材料与试剂

1.感兴趣的哺乳动物细胞类型（例如 HEK293、ATCC，目录号：CRL-1573）
2.补充有 10% 血清的细胞培养基（例如，补充有 10% FBS 的 DMEM；DMEM，Thermo Fisher Scientific，目录号：11995040；FBS，VWR，目录号：97068-085）
3.10 cm 组织培养皿（例如 Genesee Scientific，目录号：25-200）
4.5/10 mL 无菌血清移液管（例如 Genesee Scientific，目录号：12-102、12-104）
5.15/50 mL 锥底离心管（例如，Corning，目录号：05-538-59A、05-526B）
6.1.7 mL 微量离心管（例如 Genesee Scientific，目录号：22-282）
7.TRIzol 试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：15596018）
8.氯仿（Fisher Scientific，目录号：BP1145-1）
9.异丙醇（Fisher Scientific，目录号：BP2618-1）
10.80% 乙醇，分子生物学级（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：T08204K7）
11.GeneRuler 1 kb Plus DNA 梯子（Thermo Fisher Scientific，目录号：FERSM1333）
12.5 M NaCl，不含 RNase（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9760G）
13.微球菌核酸酶（MNase）（2,000,000 凝胶单位/mL）（New England Biolabs，目录号：M0247S）
14.10 × MNase反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0247S）
15.0.5 M EGTA，pH 8.0，不含 DNase 和 RNase（Thermo Fisher Scientific，目录号：NC1874048）
16.无核酸酶水（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9939）
17.10 ×磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.4，不含 RNase（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9624）
18.5-溴尿苷（Sigma-Aldrich，目录号：850187）
19.Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
20.1 M DTT（Thermo Fisher Scientific，目录号：P2325）
21.Superase-In TM RNase 抑制剂（Invitrogen，AM2696）
22.蛋白 G 磁珠（Pierce Thermo Scientific，目录号：88848）
23.纯化的小鼠抗 BrdU 抗体（克隆 3D4，RUO）（BD Pharmingen，目录号：555627）
24.Qubit TM RNA 高灵敏度检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32852）
25.Invitrogen TM Qubit TM测定管（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32856）
26.T4多核苷酸激酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：EK0031）
27.10 ×反应缓冲液A（Thermo Fisher Scientific，目录号：EK0031）
28.RNA Clean & Concentrator TM -5 套件（ZYMO RESEARCH，目录号：R1013、R1014）
29.QIAseq miRNA 文库试剂盒（Qiagen，目录号：331502）
30.QIAseq miRNA Index 试剂盒 IL UDI（例如，UDI-B-96，Qiagen，目录号：331625）
31.10× TBE 缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9863）
32.1:20 稀释的 MNase（100,000 凝胶单位/mL）（参见配方）
33.50 mM 5-溴尿苷（参见配方）
34.IP 缓冲区（参见食谱）

软件

1.删除 UMI 重复项：UMI 工具（Smith 等人，2017）
2.去除接头序列：Cutadapt （Martin，2011）
3.基因组测序读数比对：Bowtie2 （Langmead 和 Salzberg，2012）
4.BAM 文件处理：Samtools （Li 等人，2009）
5.综合基因组查看器 (IGV) （Robinson 等人，2011）
6.将 BAM 文件转换为 BED 文件：bedtools （Quinlan 和 Hall，2010）
7.将 bedGraph 文件转换为 BigWig：bedGraphToBigWig （Kent 等人，2010）

设备

1.1.5 mL 微量离心机磁体支架（例如 Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
2.离心机 5430 R（例如，Eppendorf，目录号：022620601）
3.热循环仪（例如，Bio-Rad，型号：C1000 Touch，目录号：1851148）
4.量子位荧光计（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q33238）

程序

A.新生转录本的标记

以下步骤实现了用溴尿苷标记新生转录物，以便能够通过 D 节中的免疫沉淀分离这些转录物。在用 5-溴尿苷孵育细胞期间，所有主动转录的 RNA 聚合酶都会掺入 5-溴尿苷。
1.在总共 10 mL 的培养基中，在 10 cm 培养板中培养细胞。对于 C 部分，需要 250 μg 的总 RNA。根据细胞系类型和总 RNA 提取方案的产量缩放板数。对于 HEK293 细胞，每种条件总共使用 3 × 10 cm 板或单个 15 cm 板（~20 × 10 6 个细胞）。
2.当细胞群达到约 70% 汇合时，除去细胞培养基，并用含有 400 μL 50 mM 5-溴尿苷（2 mM 5-溴尿苷最终浓度）的 10 mL 新鲜细胞培养基替换。如果使用 15 cm 板，则使用 20 mL 含有 800 μL 50 mM 5-溴尿苷的新鲜细胞培养基进行相应放大。
3.将含有细胞的板置于 37 °C 和 5% CO 2的加湿培养箱中30 分钟（参见注释 1）。
4.获取无溴尿苷阴性对照样品，以排除免疫沉淀后 RNA 的非特异性富集。使用每种条件使用的板数执行标记方案，排除步骤 A2 中新鲜细胞培养基中的 5-溴尿苷。
5.除去细胞培养基，加入 1 mL TRIzol 试剂将细胞从培养板上解离，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。如果使用 15 cm 板，则收获至少 3 mL TRIzol 试剂。
6.上下移液裂解液以均质化。

执行以下部分时应特别小心，不要污染 RNA 样品，否则可能会导致 RNA 被 RNase 降解。使用无 RNase 认证的塑料器具和过滤器吸头。

B.总RNA提取

1.每 1 mL TRIzol 裂解液中添加 0.2 mL 氯仿，牢固地盖住管子，并通过摇动约 30 秒彻底混合。
2.将样品在 4°C 下以 12,000× g离心 15 分钟。
3.将含有 RNA 的水相转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，将管倾斜 45° 并吸出溶液。
4.向水相中加入等体积的异丙醇，上下吹打混匀，4℃孵育10分钟。
5.以 12,000× g离心10 分钟。
6.总 RNA 沉淀在管底部形成白色凝胶状沉淀。
7.通过移液除去溶液。避免去除 RNA 沉淀，RNA 沉淀应位于微量离心管铰链下方，呈白色沉淀。
8.轻轻加入 1 mL 冰冷的 80% 乙醇，并在 4 °C 下以 12,000× g离心5 分钟。
9.通过移液除去 80% 乙醇溶液，并在微型离心机中脉冲旋转 1.7 mL 微量离心管，将管壁上残留的乙醇带到底部。
10.使用 P20 移液器和吸头去除剩余的溶液。
11.将 RNA 沉淀重悬于 100 μL 无 RNase 水中，如果从 15 cm 板开始，则重悬于 300 μL。
12.使用 Nanodrop 分光光度计定量 RNA 的浓度。
13.我们建议通过您选择的方法（即生物分析仪、TapeStation 或 RNA 凝胶电泳分析）分析 RNA 质量，排除总 RNA 提取过程中的 RNA 碎片。对于 RNA 凝胶电泳，我们将 2 μL 总 RNA 样品和 3 μL GeneRuler 1 kb Plus DNAladder 加载到 1 × TBE 缓冲液中的 1% 琼脂糖凝胶中，并施加 140 V 1 小时（图 2A）（参见注释 2））。将 RNA 样品储存在 -80 °C 的冰箱中或继续执行 C 部分。

图 2. MNase 消化的总 RNA 的凝胶电泳。 HEK293 细胞的新生转录物用 5-溴尿苷脉冲标记 30 分钟，并提取总 RNA。所示为三个生物学重复的纯化总 RNA 样品在 MNase 片段化之前 (A) 和使用 MNase 片段化之后 (B)。

C.使用 MNase 进行 RNA 片段化

在免疫沉淀之前用 MNase 对总 RNA 进行片段化，仅富集 5-溴尿苷标记的前 mRNA 分子区域。此外，MNase 消化会产生大小合适的 RNA 分子，用于 G 部分中的文库制备。
C 节和 D 节中描述的程序一直不间断地执行。在开始之前，请考虑该协议不包括这些部分之间的停止点。如果需要停止点，我们建议完成本节中的步骤 C4，并将碎片 RNA 置于冰上，直到该样品在 24 小时内用于步骤 D6。
1.将 250 μg 总 RNA、25 μL 5 M NaCl 和 50 μL 10 × MNase 反应缓冲液在 1.7 mL 管中混合，并用无核酸酶水使总体积达到 500 μL。通过上下移液混合。
2.将样品在 37°C 下孵育 5 分钟。
3.添加 5 μL 1:20 稀释的 MNase（100,000 凝胶单位/mL），通过上下移液混合，并孵育 1 分钟。
4.添加 10 μL 0.5 M EGTA 终止反应。充分混合并将样品置于冰上直至完成步骤 D5。
5.使用 2–4 μL 片段化 RNA (1–2 μg) 进行凝胶电泳来评估 RNA 片段化。 RNA 片段的长度范围应为 ~1.5 kb 至 ~100 bp。（图2B）。

D.新生转录本的免疫沉淀

以下步骤通过与缀合有 Protein G 磁珠的小鼠 BrdU 抗体特异性结合来富集溴尿苷标记的新生 RNA 转录物，同时洗掉未标记的 RNA。
1.清洗Protein G 磁珠。将 50 μL 充分混合的含有 Protein G 磁珠的溶液转移至 1.7 mL 管中，并按照以下步骤清洗磁珠：
a.将 1.7 mL 管放在磁力架上以固定珠子。
b.当溶液完全澄清并且所有珠子都固定在管壁上时，通过移液除去上清液并添加 500 μL IP 缓冲液。
c.从磁力架上取下管子，轻轻上下吹打以重新悬浮珠子，直到所有珠子解离并且观察不到珠子团块。放回磁铁架上。
d.当溶液完全澄清并且所有珠子都固定在管壁上时，通过移液除去上清液。
2.将 1 mL 的 IP 缓冲液添加到洗过的珠子中，然后从磁力架上取下。
3.将小鼠抗 BrdU 抗体与 Protein G 磁珠结合。将 8 μL 抗 BrdU 抗体（4 μg）添加到 1 mL 含有Protein G 磁珠的 IP 缓冲液中，通过上下移液混合，并将样品在 4°C 下端到端旋转孵育 1 小时。如果包括 C 部分中建议的停止点，则该孵育可以进行过夜。
4.按照步骤 D1 (a–d) 中所述的清洗程序 3 次，用 IP 缓冲液清洗缀合的抗 BrdU 抗体和珠子。
5.将 1 mL 的 IP 缓冲液添加到珠子中，然后从磁力架上取下管。
6.将步骤 C4 中的片段化 RNA 添加到含有珠子的管中，通过上下移液混合，并在 4°C 下端到端旋转孵育样品 1 小时（参见注释 3）。
7.执行步骤 D1 (a–d) 中描述的清洗程序 3 次，用 IP 缓冲液清洗珠子。最后一次清洗后，将管子放在磁铁架上。
8.在不干扰磁珠的情况下，加入 500 μL 无 RNase 的 1 × PBS，孵育 30 s，并吸出上清液。
9.从磁力架上取下管，加入 20 μL 无核酸酶水，通过上下吹打重悬珠子，然后转移到 PCR 管中。
10.将管放在热循环仪上并运行以下程序以从珠子中洗脱抗体和新生转录物：90°C 5 分钟，12°C 30 秒，在 105°C 下加热盖。
11.涡旋并将样品转移至 1.5 mL 管中。
12.将 1.5 mL 管放在磁力架上，当溶液澄清后，将上清液转移到干净的 1.5 mL 管中。
13.使用 Qubit TM RNA 高灵敏度检测试剂盒测量样品的 RNA 浓度。按照此方案，HEK293 细胞中新生转录物的特异性富集预期浓度为 ~9–15 ng/μL，总 RNA 产量为 ~180–300 ng。无溴尿苷阴性对照样品不应包含 Qubit 检测可检测到的信号 (< 0.2 ng/μL)。在该阴性对照中检测到 RNA 表明免疫沉淀后洗涤的效率较低。

E.MNase 片段化 RNA 3 '端的修复

MNase 造成的 RNA 片段化产生 3 '磷酸基团（Alexander 等人，1961）。这些可以通过 T4 多核苷酸激酶转化为 3 ' OH RNA 末端，这是在 G 部分的文库制备过程中连接到3 '接头所需的。该反应在没有 ATP 的情况下进行，排除了非天然5 ' -PO的安装通过这种酶在RNA分子上形成4个基团。
1.将 150 ng 新生转录物转移至 1.5 mL 管中，加入 5 μL 10 ×反应缓冲液 A，加入无 RNase 的水使溶液达到 49 μL，上下吹打混匀。
2.添加 1 μL T4 多核苷酸激酶 (10 U)，并在 30°C 下孵育 30 分钟。

F.柱内 RNA 纯化

使用任何亲和微柱纯化方案从体外反应中纯化 RNA，以少量 (< 20 μL) 洗脱 RNA。我们使用如下所述的RNA Clean & Concentrator TM -5 清理套件。
1.向每个样品中添加两体积的 RNA 结合缓冲液，并通过上下移液混合。
2.添加等体积的乙醇 (95% – 100%)，并通过上下移液混合。
3.将样品转移至收集管中的Zymo-Spin TM IC 柱并以 12,000 ×离心 g 30 秒。丢弃流出液。
4.跳过 DNase I 处理步骤，向柱中添加 400 μL RNA 制备缓冲液，并以 12,000 ×离心 g 30 秒。丢弃流出液。
5.向柱中添加 700 μL RNA 洗涤缓冲液，并以 12,000 ×离心 g 30 秒。丢弃流出液。
6.向柱中添加 400 μL RNA 洗涤缓冲液，并以 12,000 ×离心 g 1 分钟。确保完全去除洗涤缓冲液。小心地将柱转移到无 RNase 的管中。
7.将 15 μL 无 DNase/RNase 的水直接添加到柱基质中，并以 12,000 ×离心 g 1 分钟以洗脱 RNA。
8.TM RNA 高灵敏度检测试剂盒测量样品的 RNA 浓度（预计约为 6 ng/μL）。继续G部分或将RNA样品冷冻在-80°C。

G.5' -PO 4 Bru-Seq 文库的制备

5' -PO 4 Bru-Seq 文库的制备可以通过使用文库制备方案来检测 miRNA 来实现。在此协议中，我们采用了 QIAseq miRNA 库套件，包括 10 碱基 UMI。具有除单磷酸之外的 5 '末端的转录本（包括帽子结构）被排除在外，因为它们无法连接到 5 '接头。按照制造商协议中的步骤以及下述具体条件进行操作：
1.'连接反应所需的试剂。在室温 (15–25 °C) 下解冻 QIAseq miRNA NGS 3 '适配器、QIAseq miRNA NGS 3 '缓冲液、2 × miRNA 连接激活剂和无核酸酶水。通过轻弹管子混合每种溶液。短暂离心管以收集管壁上残留的液体并保持在室温下。
2.根据 QIAseq miRNA 文库试剂盒表 5（QIAseq miRNA NGS 3 '适配器的稀释），使用 10–50 ng 的新生 RNA 转录本，并使用 1:5 稀释的 3 '适配器。
3.根据表 1准备 3 '连接反应。短暂离心，上下吹打 15-20 次混合，然后再次短暂离心。

'连接反应的设置
成分体积/反应
无核酸酶水多变的
QIAseq miRNA NGS 3 '适配器1微升
QIAseq miRNA NGS RI1微升
QIAseq miRNA NGS 3 '连接酶1微升
QIAseq miRNA NGS 3 '缓冲液2微升
2x miRNA 连接激活剂10微升
模板RNA（在步骤G4中添加）多变的
总容积20微升

4.将模板 RNA 添加到含有 3 '连接主混合物的每个管中。短暂离心，上下吹打 15-20 次混匀，然后再次短暂离心。
5.28°C 孵育 1 小时。
6.65°C 孵育 20 分钟。
7.在 4°C 下保持至少 5 分钟。
8.'连接反应所需的试剂。在室温下解冻 QIAseq miRNA NGS 5 '适配器和 QIAseq miRNA NGS 5 '缓冲液。通过轻弹管子进行混合。短暂离心管以收集管壁上残留的液体并保持在室温下。
9.根据 QIAseq miRNA 文库试剂盒表 7 （QIAseq miRNA NGS 5 '适配器的稀释），使用 1:2.5 稀释的 5 '适配器。
10.根据表 2准备 5 '连接反应，按所列顺序添加组分。短暂离心，上下吹打 10-15 次混匀，然后再次短暂离心。

5 '连接反应的设置
成分体积/反应
3 ′连接反应（已在管中）20微升
无核酸酶水15微升
QIAseq miRNA NGS 5 '缓冲液2微升
QIAseq miRNA NGS RI1微升
QIAseq miRNA NGS 5 '连接酶1微升
QIAseq miRNA NGS 5 '适配器1微升
总容积40微升

11.28°C 孵育 30 分钟。
12.65°C 孵育 20 分钟。
13.保持在 4°C 并立即进行步骤 G14。
14.准备逆转录反应所需的试剂。在室温下解冻 QIAseq miRNA NGS RT 引发剂、QIAseq miRNA NGS RT 缓冲液和 QIAseq miRNA NGS RT 引物。通过轻弹管子进行混合。短暂离心管以收集管壁上残留的液体并保持在室温下。
15.将 2 μL QIAseq miRNA NGS RT 引发剂添加到每个管中。短暂离心，上下吹打 15-20 次混匀，然后再次短暂离心。
16.按照表 3 中的说明孵育管。

表 3. 使用 QIAseq miRNA NGS RT 引发剂孵育试管
时间温度
275℃
270℃
265℃
260℃
255℃
537℃
525℃
无穷大*4℃
*按住直至 RT 反应建立

17.根据 QIAseq miRNA 文库试剂盒表 10（QIAseq miRNA NGS RT 引物的稀释），使用 1:5 稀释的 QIAseq miRNA NGS RT 引物。
18.在冰上，根据表 4 准备逆转录反应。短暂离心，上下移液 12 次混匀，再次短暂离心。

表 4. 逆转录反应的设置
成分体积/反应
5 ′连接反应+QIAseq miRNA NGS RT引发剂（已在管中）42微升
QIAseq miRNA NGS RT 引物2微升
无核酸酶水2微升
QIAseq miRNA NGS RT 缓冲液12微升
QIAseq miRNA NGS RI1微升
QIAseq miRNA NGS RT 酶1微升
总容积60微升

19.50°C 孵育 1 小时。
20.70°C 孵育 15 分钟。
21.在 4°C 下保持至少 5 分钟。
22.准备 QIAseq miRNA NGS 珠（QMN 珠）。彻底涡旋 QIAseq 珠子和 QIAseq miRNA NGS 珠子结合缓冲液，以确保珠子处于悬浮状态并均匀分布。不要离心试剂。重要提示：QIAseq 微珠必须是同质的。这就需要在使用前快速彻底地重新悬浮珠子。如果实验方案发生延迟，只需再次涡旋珠子即可。
23.小心地将 400 μL QIAseq 珠（珠存储缓冲液是粘性的）添加到 2 mL 微量离心管中。这一数量的珠子足以执行“方案：cDNA 清理”以及与一个样品的文库扩增相关的清理。短暂离心并立即在磁力架上分离珠子。
24.当珠子完全迁移时，小心地取出并丢弃上清液。
25.从磁力架上取下管子，小心地将 150 μL QIAseq miRNA NGS 珠结合缓冲液移至珠子上（缓冲液是粘稠的）。彻底涡旋以完全重悬珠粒。短暂离心并立即在磁力架上分离珠子。
26.当珠子完全迁移时，小心地取出并丢弃上清液。
27.从磁力架上取下管子，小心地将 400 μL QIAseq miRNA NGS 珠子结合缓冲液移至珠子上（缓冲液是粘性的）。彻底涡旋以完全重悬珠粒。 QMN 珠子的制备现已完成。如果不立即使用珠子，请将其储存在冰上或 2–8 °C 下。
28.执行 cDNA 清理。离心含有 cDNA 反应的管，并将 143 μL QMN 珠添加到含有 cDNA 反应的管中。涡旋 3 秒并短暂离心。
29.室温孵育 5 分钟。
30.将管子放在磁力架上约 4 分钟或直到珠子完全迁移。
31.丢弃上清液并保留珠子。
32.当珠子仍在磁力架上时，添加 200 μL 80% 乙醇。立即取出并丢弃乙醇洗液。
33.添加 200 μL 80% 乙醇重复洗涤。立即取出并丢弃第二次乙醇清洗液。重要提示：第二次清洗后完全去除所有乙醇痕迹。短暂离心并将管放回磁力架上。先用 200 μL 移液器除去乙醇，然后用 10 μL 移液器除去残留的乙醇。
34.将珠子仍然放在磁力架上，在室温下风干 10 分钟。残留的乙醇会阻碍后续文库扩增反应的扩增效率。根据湿度，可能需要延长干燥时间。
35.当珠子仍位于磁力架上时，通过向管中添加 17 μL 无核酸酶水来洗脱 DNA。随后关闭/覆盖并从磁力架上取下管/板。
36.小心地上下吹打，直到所有珠子完全重悬，短暂离心，并在室温下孵育 2 分钟。
37.将管放回磁力架约 2 分钟或直到珠子完全迁移。完成的cDNA纯化产物可-20℃保存；或者，继续执行以下步骤。
38.准备文库扩增反应所需的试剂。解冻 QIAseq miRNA NGS 文库缓冲液、QIAseq miRNA NGS ILM 文库正向引物和所需的标签引物。通过轻弹管子进行混合。短暂离心管以收集管壁上残留的液体。
39.在冰上，根据表 5 准备文库扩增反应。短暂离心，通过上下移液 12 次混合，然后再次短暂离心。

表 5. 使用管索引时文库扩增反应的设置
成分体积/反应
来自“方案：cDNA 清理”的产品15微升
QIAseq miRNA NGS 文库缓冲液16微升
HotStarTaq DNA 聚合酶3微升
QIAseq miRNA NGS ILM 文库正向引物2微升
QIAseq miRNA NGS ILM IPD1 至 IPD48（索引引物）2微升
无核酸酶水42微升
总体积80微升

40.根据表 6 对热循环仪进行编程。

表 6. 文库扩增方案
步时间温度
抓住15分钟95℃
3步循环（18个循环）
变性
退火
扩大
15秒95℃
30秒60℃
15秒72℃
抓住2分钟72℃
抓住无穷大4℃

41.将文库扩增反应放入热循环仪中并开始运行。完成协议后，在 4°C 下保持至少 5 分钟。
42.将 75 μL QMN 珠添加到管中。确保 QMN 珠始终充分混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果实验方案发生延迟，只需涡旋珠子即可。
43.短暂离心 80 μL 文库扩增反应，然后将 75 μL 转移至含有 QMN 珠子的试管中。涡旋 3 秒并短暂离心。
44.室温孵育 5 分钟。
45.将管子放在磁力架上大约 4 分钟或直到珠子完全迁移。
46.保留上清液并将 145 μL 上清液转移至新管中。丢弃含有珠子的管子。重要提示：请勿在此步骤丢弃上清液。
47.向 145 μL 上清液中添加 130 μL QMN 珠子。涡旋 3 秒并短暂离心。
48.室温孵育 5 分钟。
49.将管子放在磁力架上，直到珠子完全迁移。
50.丢弃上清液并保留珠子。
51.当珠子仍在磁力架上时，添加 200 μL 80% 乙醇。立即取出并丢弃乙醇洗液。
52.添加 200 μL 80% 乙醇重复洗涤。立即取出并丢弃第二次乙醇清洗液。在第二次洗涤后完全去除乙醇洗涤的所有痕迹非常重要。短暂离心并将管放回磁力架上。先用 200 μL 移液器除去乙醇，然后用 10 μL 移液器除去残留的乙醇。
53.将珠子仍然放在磁力架上，在室温下风干 10 分钟。
54.当珠子仍位于磁力架上时，通过向管中添加 17 μL 无核酸酶水来洗脱 DNA。随后关闭并从磁力架上取下管子。
55.小心地上下移液，直至所有珠子完全重悬；短暂离心并在室温下孵育 2 分钟。
56.将管子放在磁力架上约 2 分钟（或直到珠子清除）。
57.将 15 μL 洗脱 DNA 转移至新管中。这是 5 ' -PO 4 Bru-Seq 测序文库。将测序文库储存在-20°C。
58.提交文库进行 Illumina 测序。建议使用双端测序。测序的 Read 1 的5 '端告知连接事件的位置（5 ' -PO 4 RNA 末端），Read 2 5 '端的前 12 个核苷酸告知 UMI 的身份。

数据分析

1.从 Illumina 测序运行文件（例如 Read1.fastq、Read2.fastq）中提取 UMI，并使用 UMI 工具获取新的 Read1.UMI.fastq 文件（参见注释 4）。

umi_tools 提取 \
-I Read2.fastq \
--extract-method=字符串 \
--bc-pattern=NNNNNNNNNNNN \
--read2-in=Read1.fastq \
--read2-out=Read1.UMI.fastq \
> 阅读2.UMI.fastq

2.使用 Cutadapt 删除接头序列。

切割适应\
-a 'AACTGTAGGCACCATCAAT' \
-A 'GATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAAC' \
-o Read1.trimmed.fastq \
-p Read2.trimmed.fastq \
读取1.UMI.fastq \
读取2.UMI.fastq \

3.使用 Bowtie（例如 Bowtie 2）将 Read1.trimmed.fastq 文件中的读数与人类基因组索引（例如 GRCh37/hg19）对齐。

领结2 \
-x 领结索引 \
-U Read1.trimmed.fastq \
-S Read1.sam

4.将“Read1.sam”文件转换为 BAM 格式。

samtools 查看 -S -b Read1.sam > Read1.bam

5.对 Read1.bam 文件进行排序。

samtools 排序 Read1.bam -o Read1.sorted.bam

6.使用 UMI 工具删除 UMI 重复项。

umi_tools 去重 \
--方法独特\
--读取长度\
-I Read1.sorted.bam \
-S Read1.filtered.bam

7.使用 Read1.filtered.bam 和 Read1.filtered.bam.bai 文件可视化 IGV 上的序列读取。下面的图3显示了映射到ACTB基因的poly(A)位点的测序读数，其中测序读数中的第一个5 '核苷酸包含新生转录物中紧邻下游的5'-PO 4 RNA末端的单核苷酸坐标。 Poly(A) 切割位点（红色箭头）。

ACTB 基因3 '端的已测序 5 ' -PO 4 Bru-Seq 读取，其中新生转录物中的局部 5 ' -单磷酸化核苷酸由读取箭头指示。 Poly(A) 信号由序列轨道上方的红线表示。

8.使用 bedtools 将“Read1.filtered.bam”文件转换为 BED 格式。

床具 bamtobed \
-i Read1.filtered.bam \
> 阅读1.过滤.床

9.将“Read1.filtered.bed”文件中的读取坐标折叠到 5 '单核苷酸坐标，该坐标对应于 5 ' -PO 4 RNA 单核苷酸坐标，并使用“chrom.sizes”创建具有链特异性的覆盖 BEDGRAPH 文件与用于映射的参考基因组关联的文件。

床具基因组冠状病毒\
-链+\
-5 \
-i Read1.filtered.bed \
-bg chrom.sizes \
> 阅读1.5p.positive.bg
床具基因组冠状病毒\
-股-\
-5 \
-i Read1.filtered.bed \
-bg chrom.sizes \
> 阅读1.5p.负数.bg

10.对输出 BEDGRAPH 文件进行排序。

排序-k1,1 -k2,2n Read1.5p.positive.bg \
> 阅读1.5p.sorted.positive.bg
排序-k1,1 -k2,2n 读取1.5p.负数.bg \
> 阅读1.5p.sorted.negative.bg

11.使用 bedGraphToBigWig 创建 BigWig 文件，以便在加州大学圣克鲁斯分校 (UCSC) 基因组浏览器上可视化基因组数据。

bedGraphToBigWig \
Read1.5p.sorted.positive.bg \
铬尺寸 \
Read1.5p.positive.bw
bedGraphToBigWig \
读取1.5p.sorted.negative.bg \
铬尺寸 \
读1.5p.负数.bw

12.MIR17HG miRNA 簇微处理器切割位点的 5 ' -PO 4 RNA 末端（图 4A）、SNORA14B snoRNA 的 5 ' 末端（图 4B），确认5 ' -PO 4 Bru - Seq信号的富集， RNaseP 裂解之前初级 tRNA 转录物的5 '末端（图 4C，红色箭头），以及ACTB 基因上的 Poly(A) 位点裂解后生成的 5'-PO 4 末端（图4D ）。 5 ' -PO 4信号可以通过检测47S rRNA 前体的 5 '端进一步验证（Wang 和 Pestov，2011）（图 4E，红色箭头）。核糖体信号可以通过映射到人核糖体重复单元参考序列（ GenBank 登录号 U13369）来可视化。最后，可以通过归一化至映射读数的总数或归一化至适当的内部控制区域[例如，线粒体基因组（Cortazar等人，2022）]来对整个文库的峰强度进行相对量化。

图 4. 5 ' -PO 4 Bru-Seq 绘制新生转录物已知 5 ' -PO 4 RNA 末端的图谱。显示的是 UCSC 基因组浏览器屏幕截图，其中包含以下位置的 5 ' -PO 4 Bru-Seq 信号：(A) MIR17HG miRNA 簇，(B) SNORA14B snoRNA，(C) tRNA 基因，其中初级 tRNA 转录物的5 '末端是(D) ACTB 基因的3 '端，其中 Poly(A) 信号在 Poly(A) 切割位点上游加下划线。峰代表Poly(A) 切割位点下游的 RNA 片段中具有5 ' -PO 4基团的核苷酸，并且 (E) 核糖体 RNA 转录单元在 y 轴值 (0–8,000) 上放大，以可视化47S rRNA 前体的5 '端由黑色箭头指示。 y 轴表示每百万个线粒体 5 ' -PO 4 Bru-Seq 测序读数的映射读数数。

笔记

1.先前已验证细胞与 2 mM 5-溴尿苷孵育 30 分钟可主要产生新生转录信号（Paulsen 等人，2013）。尽管新生转录本的产量大大降低，但可以进行更短的孵育时间（约 20 分钟）。不建议使用更长的孵育时间，因为标记的新生转录本会被处理，在成熟 RNA 群体中积累，并污染新生转录本信号。
2.高质量样品中的完整 RNA 分子群显示出分别对应于 28S 和 18S rRNA 种类的不同条带。凝胶底部对应于 tRNA 群体的模糊且微弱的条带也可以可视化，具体取决于 RNA 的加载量（图 2A）。定性 28S/18S 带强度比值 2 历来被认为表明完整的 RNA。
3.溴标记 RNA 免疫沉淀过程中较短的孵育时间可降低 RNA 断裂的可能性。
4.默认情况下，UMI_tools 使用参数“-I”从“Read1.fastq”输入文件中提取 UMI。鉴于 UMI 包含在 Read 2 中，您可以简单地切换为参数“--read2-in”提供的输入文件。

食谱

1.1:20 稀释的 MNase（100,000 凝胶单位/mL）
将 1 μL MNase（2,000,000 凝胶单位/mL）与 19 μL 1 × MNase 反应缓冲液混合。

2.50 mM 5-溴尿苷
将 808 mg 5-溴尿苷溶解在 50 mL 无 RNase 1 × PBS 中，并储存在 -20°C 下。

3.IP缓冲器
0.05% Triton X-100、1 mM DTT，补充有 Superase-In TM RNase 抑制剂，溶于无 RNase 的 1 × PBS。
混合 25 μL Triton X-100、50 μL 1 M DTT、50 μL Superase-In TM RNase 抑制剂和 50 mL 无 RNase 1 × PBS。

致谢

Michael A. Cortázar 是科罗拉多大学丹佛分校 RNA 生物科学计划的学者。该方案中的标记和免疫沉淀步骤是根据 Bru-Seq 方案进行修改的（Paulsen 等人，2014）。这项工作得到了 NIH 拨款 R35 GM144336 给 DB 的支持

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Alexander, M.、Heppel, LA 和 Hurwitz, J. (1961)。这纯化和特性的微球菌核酸酶。 J.Biol。化学。 236（11）：3014-3019。
Bhatt, DM、Pandya-Jones, A.、Tong, AJ、Barozzi, I.、Lissner, MM、Natoli, G.、Black, DL 和 Smale, ST (2012)。成绩单动力学的促炎性基因揭晓经过顺序分析的亚细胞核糖核酸分数。单元格150(2)：279–290。
Churchman, LS 和 Weissman, JS (2011)。新生成绩单测序形象化转录在核苷酸解决。自然469（7330）：368-373。
Cortazar, MA、Erickson, B.、Fong, N.、Pradhan, SJ、Ntini, E. 和 Bentley, DL (2022)。 Xrn2 基质映射识别鱼雷加载中网站和广泛的过早的终止的核糖核酸波尔二转录。基因开发。 36：1062–1078。
Fong, N.、Saldi, T.、Sheridan, RM、Cortazar, MA 和 Bentley, DL (2017)。核糖核酸波尔二动力学调制共转录染色质修改， CTD 磷酸化，和转录的方向。摩尔。单元格66(4)：546–557.e3。
German，MA，Pillay，M，Jeong，DH，Hetawal，A，Luo，S，Janardhanan，P，Kannan，V，Rymarquis，LA，Nobuta，K，German，R，等。（2008）。全球的鉴别的微小RNA-靶标核糖核酸对经过平行线分析的核糖核酸结束。纳特。生物技术。 26（8）：941-946。
Harigaya, Y. 和 Parker, R. (2012)。全球的分析的信使RNA 衰变中间体在酵母属酿酒酵母。过程。国家。阿卡德。科学。美国109(29)：11764–11769。
Herzog, VA、Reichholf, B、Neumann, T、Rescheneder, P、Bhat, P、Burkard, TR、Wlotzka, W、von Haeseler, A、Zuber, J、Ameres, SL 等人…… （2017）。硫醇连接烷基化自己核糖核酸到评估表达动力学。纳特。方法14(12)：1198–1204。
Jao, CY 和 Salic, A. (2008)。探索核糖核酸转录和周转在体内经过使用点击化学。过程。国家。阿卡德。科学。美国105(41)：15779–15784。
Kent, WJ、Zweig, AS、Barber, G.、Hinrichs, AS 和 Karolchik, D. (2010)。大假发和大床：使能浏览的大的分散式数据集。生物信息学26（17）：2204–2207。
Kenzelmann, M.、Maertens, S.、Hergenhahn, M.、Kueffer, S.、Hotz-Wagenblatt, A.、Li, L.、Wang, S.、Ittrich, C.、Lemberger, T.、Arribas, R .等人，等人。（2007）。微阵列分析自己新合成的核糖核酸在细胞和动物。过程。国家。阿卡德。科学。美国104(15)：6164–6169。
Langmead, B. 和 Salzberg, SL (2012)。快速地间隙阅读结盟和领结 2. 纳特。方法9(4)：357–359。
Li, H.、Handsaker, B.、Wysoker, A.、Fennell, T.、Ruan, J.、Homer, N.、Marth, G.、Abecasis, G.、Durbin, R. 和 1000 基因组计划数据处理子组（2009）。这顺序路线/地图格式和 SAM 工具。生物信息学25(16)：2078–2079。
马丁，M.（2011）。库达普删除适配器序列从高通量测序读。 EMB 网。 J.17 （1）：10。
Mayer, A.、di Iulio, J.、Maleri, S.、Eser, U.、Vierstra, J.、Reynolds, A.、Sandstrom, R.、Stamatoyannopoulos, JA 和 Churchman, LS (2015)。本国的拉长成绩单测序揭示人类转录的活动在核苷酸解决。单元格161(3)：541-554。
Muhar, M.、Ebert, A.、Neumann, T.、Umkehrer, C.、Jude, J.、Wieshofer, C.、Rescheneder, P.、Lipp, JJ、Herzog, VA、Reichholf, B. 等人…… （2018）。 SLAM序列定义直接地基因调控功能自己这 BRD4-MYC 轴。科学360(6390):800–805。
Nojima, T.、Gomes, T.、Grosso, ARF、Kimura, H.、Dye, MJ、Dhir, S.、Carmo-Fonseca, M. 和 Proudfoot, NJ (2015)。哺乳动物网络序列揭示全基因组新生转录耦合到核糖核酸加工。单元格161(3)：526–540。
Paulsen, MT、Veloso, A.、Prasad, J.、Bedi, K.、Ljungman, EA、Magnuson, B.、Wilson, TE 和 Ljungman, M. (2014)。使用的布鲁测序和布鲁蔡斯测序为了全基因组评估的这合成和稳定的核糖核酸。方法67(1)：45-54。
Paulsen, MT、Veloso, A.、Prasad, J.、Bedi, K.、Ljungman, EA、Tsan, YC、Chang, CW、Tarrier, B.、Washburn, JG、Lyons, R. 等。（2013）。协调的规定的合成和稳定的核糖核酸期间这急性 TNF诱导的促炎性的回复。过程。国家。阿卡德。科学。美国110(6)：2240–2245。
昆兰和 IM 霍尔 (2010)。 BED工具： A 灵活的套房的公用事业为了比较基因组特征。生物信息学26(6): 841–842。
Rabani, M.、Levin, JZ、Fan, L.、Adiconis, X.、Raychowdhury, R.、Garber, M.、Gnirke, A.、Nusbaum, C.、Hacohen, N.、Friedman, N. 等阿尔阿尔。（2011）。新陈代谢标签自己核糖核酸揭开原则自己核糖核酸生产和降解动力学在哺乳动物的细胞。纳特。生物技术。 29（5）：436-442。
Robinson, JT、Thorvaldsdóttir, H.、Winckler, W.、Guttman, M.、Lander, ES、Getz, G. 和 Mesirov, JP (2011)。综合性基因组学观众。纳特。生物技术。 29（1）：24-26。
Schofield, JA、Duffy, EE、Kiefer, L.、Sullivan, MC 和 Simon, MD (2018)。延时序列：添加 A 颞方面到核糖核酸测序通过核苷重新编码。纳特。方法15(3)：221-225。
Schwalb, B.、Michel, M.、Zacher, B.、Frühauf, K.、Demel, C.、Tresch, A.、Gagneur, J. 和 Cramer, P. (2016)。 TT序列地图这人道短暂的转录组。科学352(6290):1225-1228。
Smith, T.、Heger, A. 和 Sudbery, I. (2017)。 UMI 工具：造型测序错误在独特的分子身份标识到提升量化准确性。基因组研究。 27（3）：491-499。
Sousa-Luís, R.、Dujardin, G.、Zukher, I.、Kimura, H.、Weldon, C.、Carmo-Fonseca, M.、Proudfoot, NJ 和 Nojima, T. (2021)。观点技术照亮这加工的聚合酶相关的完好无损的新生的成绩单。摩尔。细胞81(9)：1935–1950.e6。
Wang, M. 和 Pestov, DG (2011)。 5′端监视经过 Xrn2 行为作为 A 共享机制为了哺乳动物的前rRNA 成熟和衰变。核酸研究。 39（5）：1811-1822。
Weber, CM、Ramachandran, S. 和 Henikoff, S. (2014)。核小体是具体情况， H2A.Z-调制障碍到核糖核酸聚合酶。摩尔。单元格53(5)：819–830。
Wissink, EM、Vihervaara, A.、Tippens, ND 和 Lis, JT (2019)。新生核糖核酸分析：追踪转录和它是规定。纳特。吉内特牧师。 20（12）：705-723。