材料与试剂

注：类似的材料、试剂和设备可以从其他来源购买。我们注意到，0.28 mm 内径管的替代来源可能会导致使用 30 G 针创建防水密封时出现问题（例如，实际内径与报告内径的差异）。

插管制造

1.一次性手术刀（Swan Morton，VWR International，目录号：0505）
2.PE-10/10 聚乙烯管，内径 0.28 mm，外径 0.61 mm（Warner Instruments，多通道系统，目录号：64-0750）
3.30 G × 1/2" 针（BD，目录号：305106）
4.6 孔板，平底（VWR International，目录号：734-2777）
5.无菌水
6.10 mL注射器（ Fisherbrand ，Fisher Scientific，目录号：15879152）
7.10 μL注射器，701 N，26 G，51 mm 长度，0.47 mm 外径（Hamilton，VWR International，目录号：549-1135）

腹腔注射

1.一次性手术单，例如，30 cm × 45 cm （Millpledge，目录号：SDT0100）
2.大型称重船（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：15758187）
3.生物危害锐器箱
4.插管（见上文）
5.，将注射物质（例如病毒、毒素、化合物）装在 1.5 mL微量离心管中，置于冰上或一次性加热垫上
6.无菌棉签（Texwipe，Fisher Scientific，目录号：15823886）
7.记号笔
8.P20 移液器吸头
9.封口膜（ VWR International，目录号： 291-0057）
10.纸巾或手术纱布
选修的：
11.50 mL离心管（Falcon，Fisher Scientific，目录号：10788561），含 20–40 mL漂白剂（用于病毒/毒素）
12.胰岛素注射器（BD，Fisher Scientific，目录号：13161931）（用于脚趾纹身）
13.纹身墨水（Ketchum，VWR International，目录号：NASCC01885N）（用于脚趾纹身）

设备

插管制造

1.30 厘米尺子或卷尺
2.直头止血钳，不锈钢，5 英寸（Newport Spectra-Physics，目录号：LAB-17）（参见注释 1）

腹腔注射

1.动物加热垫（Tonkey Electrical Technology，目录号：TK-HPP4030）或一次性加热垫（例如 HotHands 暖手器）（参见注释 2）
2.10微升注射器，701 N，26 G，长度 51 mm，外径 0.47 mm（Hamilton，VWR International，目录号：549-1135）（参见注释 3）
3.P20移液器
选修的：
4.II级生物安全柜（病毒/毒素）
5.50 mL离心管架（用于病毒/毒素）
6.放大灯（以帮助注射精度）

程序_

注意：应使用适当的个人防护装备，在处理有毒/有害物质时应特别小心。

A.插管制造（图1和视频1 ）

图 1. 用 30 G 针制造插管。 A) 切一段约 15 厘米长的聚乙烯管。 B) 使用止血钳，从 30 G 针上取下塑料毂，并刷掉针轴上残留的任何碎屑。 C) 将约 2–3 毫米的分离针轴插入管中。 D) 将制作好的插管存放在 6 孔板中。另请参见视频 1。

视频 1. 用于新生小鼠腹腔注射的插管制造。 00:00 – 00:11：从 30 G 针上取下塑料毂。 00:11–00:27：清除针座上的塑料毂碎片。 00:27–00:39：将针插入聚乙烯管中。 00:39–01:08：测试插管密封。 01:08–01:31：清除插管中的水。 01:31–01:44：套管储存在 6 孔板中。

1.测量然后用手术刀刀片将聚乙烯管切成约 15 厘米长的碎片（图 1A ）。确保刀片锋利，以免压碎管道。
2.使用止血钳，将 30 G 针的底座夹在塑料针座上。用手指抓住针的塑料毂并快速旋转。塑料轮毂应以最小的力弹出（参见注释 4 ）（图 1B ）。
3.刷掉针底部的所有塑料残留物，然后检查针拔出过程中是否存在任何物理损坏（例如，针座被压碎或弯曲）。
4.小心地将新暴露的针底座约 2-3 毫米插入管中，直至牢固连接（图 1C ）。根据我们的经验，将0.28 mm 内径管与 30 G 针结合使用即可形成防水密封，无需进一步修改。
5.为了确认套管密封中没有泄漏，小心地将聚乙烯管的自由端连接到固定在装有无菌水的 10 mL 注射器上的 30 G 针上，并排出少量液体（参见注释5 ）。要清除插管中的水并将其风干，请将管固定到连接到空 10 mL注射器的 30 G 针上，并排出剩余的水。使用新鲜无菌的 10 mL 注射器以避免腹腔注射所用的 Hamilton 注射器受到污染。
6.将插管存放在 6 孔板中直至准备使用（图 1D ）（暂停点）。

B.腹腔注射（图2和视频2 ）

图2.新生小鼠腹腔注射。 A) 将 10 μL Hamilton 注射器插入连接到预制套管的管道的开口端。 B) 远离无菌注射区域，等待幼犬排尿，然后用棉签擦干幼犬。 C) 移至无菌注射区并约束幼犬，使其腹侧朝上。 D) 将斜面朝上，将套管针以浅角度插入腹腔，然后缓慢注射。这些图像中的动物年龄为 P2。另请参见视频 2。

视频 2. 鼓励膀胱排尿、腹腔注射和脚趾纹身。 00:00–00:56：鼓励膀胱排尿（注意，视频中的小鼠已经排尿）。 00:56–01:19：腹腔注射。 01:19–01:52：在爪子上纹身以进行识别。视频中的动物年龄为P2。

1.可选：如果使用病毒/毒素，请打开II 级生物安全柜。
2.打开动物加热垫并使其升温至 38–40 °C 。
3.清洁工作表面，然后在上面放置无菌手术单。
4.将一些家用床上用品撒入大型称重船中，并将船放在加热垫上（以在注射后容纳幼崽以进行急性监测）。
5.可选：如果处理病毒/毒素，请将含有漂白剂的 50 mL离心管放入机架中，并确保生物危害锐器箱可用。
6.可选：如果出于识别目的对腹腔注射的幼犬进行纹身，请预留胰岛素注射器和纹身墨水。
7.准备好注射后，将父母转移到一个单独的笼子里，并放上一些他们家里的床上用品。此外，确保它们能够获得食物、水和笼内丰富的食物。理想情况下，在进行注射时，父母的笼子将被放在一个单独的房间里，以避免暴露于幼犬发出的任何可能令人痛苦的声音。
8.将原来的笼子和小狗放在预热的加热垫上。
9.将插管连接到 10 μL Hamilton 注射器并放在手术单上（图 2A ）。
10.将适当体积的物质装入插管中（表 1 ）。在此步骤中必须小心，因为聚乙烯管由于刚性而难以处理。将套管针放入含有待注射物质的微量离心管中。轻轻地将聚乙烯管靠在微量离心管的侧面，以确保聚乙烯管的稳定性，以便在将溶液吸入汉密尔顿注射器时插管针尖保持浸没在物质中。如果这被证明很棘手，则可以将微量离心管侧放（对于管中的小体积），或者可以将少量（例如，5–10 μL）移至石蜡膜上并从那里加载（参见注释 6））——但要小心蒸发。如果移取病毒/毒素，请用漂白剂将移液器吸头和石蜡膜放入 50 mL离心管中。

表格1。从产后第 1 天 (P1) 到 P5，使用此方法进行腹腔注射的近似最大体积（参见注释 7）。对于P5以上的小鼠，可以使用更传统的腹腔注射方法，尽管也可以使用这里概述的方法（参见注3 ）。据报道，通过新生儿腹腔注射可以获得更大的注射量（ Foust等，2008 ）。
产后年龄（天）最大进样量（μL）
12–4
24-6
36-8
48–10
5> 10

11.在你的手套上涂上家用床上用品的香味，然后将一只小狗转移到无菌手术巾上。
12.为了排空膀胱，从而为向腹部区域注射物质创造更多空间，鼓励诱导翻正反射反应，这通常会引起排尿（视频2）。这可以通过将小狗放在靠近注射位置的纸巾上来实现。用手指轻轻地将小狗翻过来。幼崽会自动开始有节奏地踢前肢和后肢，这通常伴随着不自觉的排尿。使用无菌棉签擦去尿液（图2B ）并将小狗转移到无菌注射区域。 P3 和年龄较大的幼犬通常不需要在注射前排空膀胱。
13.用拇指和食指轻轻地将小狗固定在腹部周围，腹侧朝上（图2C ）。小心地收集手指之间多余的皮肤以提供注射部位（参见注释 8 ）。
14.将插管针（斜面朝上）插入中线和脂肪垫（可见时）之间的腹腔内，避开肝脏和充满牛奶的胃（图2D和视频2 ）。目标是插入 2-3 毫米的针，并以浅角度插入，以避免刺穿任何器官。缓慢注射幼犬，然后抓住针头底座使其稳定，等待 5-10 秒以确保吸收，然后小心取出针头（参见注 9 ）。
15.监视小狗和注射部位是否存在回流。如果需要，用新的棉签清洁注射部位（参见注释 10 ），然后将注射的小狗转移到加热垫上的称重船上。用家用床上用品盖住小狗。
16.可选：为了给小狗纹身以进行注射后识别，请在胰岛素注射器针头的尖端涂上纹身墨水（请谨慎执行，因为它可能会变得混乱）。轻轻约束要纹身的爪子并经皮插入针头（视频2）。插入针时，您应该几乎不会遇到阻力。轻轻地插入和缩回（但不要完全）针几次，使墨水沉积在皮肤下（参见注释 11）。完成后，将爪子轻拍在纸巾或手术纱布上，以去除多余的墨水。插入部位应该几乎没有血液。纹身最好在 P0-P2 进行。
17.可选：如果注射病毒/毒素，在从注射器断开插管之前，将一些漂白剂从 50 mL离心管中吸入聚乙烯管中。从注射器上拆下管子和针头，并将其浸入漂白剂中几秒钟，然后将其丢弃在生物危害锐器箱中。将所有用过的棉签放在一边。
18.对每只要注射的小狗重复步骤 B9–B14 或 B9–B16。
19.一旦所有幼崽都服药后，将垃圾转移回笼子并用筑巢材料覆盖（参见注释 12 ）。几分钟后，将父母搬回笼子里。
20.要进行清理，请将任何受病毒/毒素污染的工具（例如移液器吸头和棉签）转移到带有漂白剂的离心管中。用漂白剂溶液喷洒工作表面（包括手术单和称重船），然后向内折叠手术单以容纳所有经过漂白处理的材料。将材料丢弃在生物危害锐器箱中。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•麦克唐纳等人。（2021）。缺乏钠通道 NaV1.7 的小鼠和人类镇痛的核心机制。神经元109(9)：1497–1512.e6（补充图 3 和 4）。
•雪橇等人。（2023）。增强外周 BDNF 可挽救 CMT2D 小鼠体内受损的轴突运输。 JCI Insight 8(9)：e157191（补充图 9，面板 A – C）。

笔记

1.可以使用台式虎钳代替止血钳来移除针座。
2.可以使用一次性加热垫（例如HotHands暖手器）或可充电加热垫（例如Unigear可充电暖手器）来代替电动动物加热垫。如果将一次性加热垫存放在密封袋中，可以多次重复使用，以避免进一步暴露在空气中。
3.如果注射量超过 10 μL，则需要更大容量的注射器（见表1）。
4.在扭转和拉动塑料毂时保持针静止不动，可以实现干净的分离，而不会压碎或弯曲针（视频 1）。如果针座被压碎或弯曲，则可能没有足够的背压将溶液吸入插管。
5.密封不当会导致水负载不良和管道中气泡积聚，特别是在处理粘性溶液时。
6.与在制造过程中测试插管密封时类似，确保溶液顺利吸入管道中并且没有气泡。如果发生这种情况，请将插管从注射器上取下，然后尝试换一根新的。
7.P1 被指定为一窝出生后的第一天。
8.放大灯可以帮助注射过程。无需预先清洁注射部位。
9.有时，在装载要注射的物质后，插管密封可能会失效。为确保这种情况不会在您不注意的情况下发生，请注意观察注射时皮下形成的小凸起。注射后，您还可以操作注射器柱塞检查是否有残留液体。如果您注意到注射过程中未分配全部体积，请在针头仍插入腹腔内时轻轻摆动针头。我们发现这样做可以缓解腹腔内的内部压力，从而使剩余的溶液被吸收。作为辅助可视化的附加可选预防措施，可以将台盼蓝或过滤绿色食用染料等染料与要注射的物质预混合（Glascock 等，2011 ）。
10.确保尿液和病毒/毒素泄漏的棉签分开存放；可以使用记号笔来帮助识别。
11.有关爪子/脚趾纹身的信息视频协议，请参阅 JoVE 科学教育数据库 (2021) 参考。
12.如果需要且允许，幼犬可以在随后的几天接受多次腹腔注射。

致谢

这项工作得到了欧洲分子生物学长期奖学金（ALTF 495-2018 至 AMP）、肌张力障碍医学研究基金会（DMRFPRF-2022-3 至 AMP）、医学研究理事会（MR/S006990/1 至 JNS）的支持，以及 Rosetrees Trust（M806 至 JNS）。图形摘要是通过www.BioRender.com创建的。此处描述的协议已在 MacDonald等人中执行。（2021）和斯利等人。（2023）。

利益争夺

作者没有需要声明的竞争利益。

道德考虑

涉及小鼠的实验是在英国内政部的许可下根据《动物（科学程序）法》（1986）进行的，并得到了伦敦大学学院皇后广场神经病学研究所伦理审查委员会的批准。

参考

Al Shoyaib, A.、Archie, SR 和 Karamyan, VT (2019)。腹膜内给药途径：是否应该用于实验动物研究？医药。资源。 37(1)：e1007/s11095-019-2745-x。
Foust, KD、Poirier, A.、Pacak, CA、Mandel, RJ 和 Flotte, TR (2008)。新生儿腹膜内或静脉注射 8 型重组腺相关病毒可转导背根神经节和下运动神经元。哼。吉恩·瑟尔. 19（1）：61-70。
Glascock, JJ、Osman, EY、Coady, TH、Rose, FF、Shababi, M. 和 Lorson, CL (2011)。通过小鼠脑室内 (ICV) 和静脉内 (IV) 注射输送治疗药物。 J. 维斯。过期。：e3791/2968-v。
Gombash Lampe, SE、Kaspar, BK 和 Foust, KD (2014)。新生小鼠静脉注射。 J. 维斯。过期。：e3791/52037。
Hua, Y.、Sahashi, K.、Rigo, F.、Hung, G.、Horev, G.、Bennett, CF 和 Krainer, AR (2011)。外周 SMN 恢复对于严重脊髓性肌萎缩小鼠模型的长期挽救至关重要。自然478（7367）：123-126。
JoVE 科学教育数据库（2021）。实验室动物研究。啮齿动物识别 II. J 可见实验。
Kienstra, KA、Freysdottir, D.、冈萨雷斯, NM 和 Hirschi, KK (2007)。小鼠新生儿血管内注射：模拟新生儿疾病。 J. Am.副教授。实验室。动画。科学。 46（6）：50-54。
MacDonald, DI、Sikandar, S.、Weiss, J.、Pyrski, M.、Luiz, AP、Millet, Q.、Emery, EC、Mancini, F.、Iannetti, GD、Alles, SR 等。（2021）。缺乏钠通道 NaV1.7 的小鼠和人类镇痛的核心机制。神经元109(9)：1497–1512.e6。
Nizzardo, M.、Simone, C.、Salani, S.、Ruepp, MD、Rizzo, F.、Ruggieri, M.、Zanetta, C.、Brajkovic, S.、Moulton, HM、Müehlemann, O. 等。（2014）。全身和局部吗啉联合治疗对脊髓性肌萎缩症 Δ7 小鼠模型表型的影响。临床。瑟尔。 36（3）：340-356.e5。
大岛，M.，田口，A.，津田，H.，佐藤，Y.，山原，K.，原田芝，M.，宫里，M.，池田，T.，饭田，H.，辻，M .，等人。（2015）。腹腔内和静脉内给药在缺氧缺血新生小鼠的药物疗效和细胞分布方面没有可比性。大脑开发。 37（4）：376-386。
Ostermann, E.、Macquin, C.、Bahram, S. 和 Georgel, P. (2013)。使用体内成像监测新生儿实验性小鼠巨细胞病毒感染的进展。 J. 维斯。过期。：e3791/50409。
马萨诸塞州帕西尼和 JH 沃尔夫 (2001)。新生小鼠脑室内注射腺相关病毒载体后大脑中广泛的基因传递和结构特异性表达模式。 J.维罗尔。 75（24）：12382-12392。
Pitulescu, ME、Schmidt, I.、Benedito, R. 和 Adams, RH (2010)。新生儿脉管系统中的诱导基因靶向和小鼠视网膜血管生成的分析。纳特。协议。 5（9）：1518-1534。
Sands, MS 和 Barker, JE (1999)。新生小鼠经皮静脉注射。实验室。动画。科学。 49（3）：328-330。
Sleigh, JN、Villarroel-Campos, D.、Surana, S.、Wickenden, T.、Tong, Y.、Simkin, RL、Vargas, JNS、Rhymes, ER、Tosolini, AP、West, SJ 等。（2023）。增强外周 BDNF 可挽救 CMT2D 小鼠体内受损的轴突运输。 JCI 洞察8(9)：e157191。
Statler, PA、McPherson, RJ、Bauer, LA、Kellert, BA 和 Juul, SE (2007)。高剂量重组促红细胞生成素在新生大鼠血浆和脑中的药代动力学。儿科。资源。 61（6）：671-675。
Turner, PV、Brabb, T.、Pekow, C. 和 Vasbinder, MA (2011)。对实验动物施用物质：施用途径和要考虑的因素。 J. Am.副教授。实验室。动画。科学。 50（5）：600-613。
Yardeni, T.、Eckhaus, M.、Morris, HD、Huizing, M. 和 Hoogstraten-Miller, S. (2011)。小鼠眼眶后注射。实验室动画。 40（5）：155-160。
徐 L.、高 Y.、刘 YS 和韩 R. (2018)。腺相关病毒介导的 CRISPR 递送用于小鼠心脏基因编辑。 J. 维斯。过期。：e3791/57560-v。