DSS 处理小鼠结肠组织的处理方案

材料与试剂

生物材料

连续五天用 3%葡聚糖硫酸钠 ( DSS) 水溶液处理 7 周大的雌性 CL57BL/6 小鼠（查尔斯河实验室）。治疗后第3天炎症反应高峰时分离结肠组织。

试剂

1.RPMI（Invitrogen，目录号：11875119）
2.高级 DMEM/F-12（Gibco，目录号：12-634-028）
3.HBSS（Cytiva，目录号：SH3058801）
4.HEPES（Invitrogen，目录号：15630080）
5.GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific，目录号：35050061）
6.Pen/Strep（Invitrogen，目录号：15140122）
7.EDTA（0.5 M，pH 8.0）（Invitrogen，目录号：AM9260G）
8.DNase I（罗氏，目录号：10104159001）
9.Liberase TM（Sigma，目录号：05401127001）
10.胰蛋白酶（Invitrogen，目录号：12605010）
11.葡聚糖硫酸钠（ DSS）（Alfa Aesar，目录号： J62101-22）
12.台盼蓝溶液（Gibco，目录号：15250061）
13.流式细胞术抗体：
a.LIVE/DEAD TM可固定水族死细胞染色试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：L34957）
b.BV421大鼠抗小鼠CD31（BD Horizon，目录号：562939，克隆：MEC 13.3）
c.APC 抗小鼠 CD326（EP-CAM）（BioLegend，目录号：118214，克隆：G8.8）
d.PE抗小鼠Podoplanin（ BioLegend ，目录号：127408，克隆：8.1.1）
e.FITC 大鼠抗小鼠 CD45（BD Pharmingen，目录号：553080，克隆：30-F11）
注意：根据可用的流式细胞仪，用户可以使用不同颜色的面板设计。

解决方案

1.上皮细胞溶液（参见食谱）
2.固有层细胞溶液（参见食谱）
3.上皮洗涤缓冲液（参见配方）
食谱

1.上皮细胞溶液
新鲜准备并放在冰上。
试剂最终浓度数量（一个样品）
HBSS不适用11,250微升_
HEPES10毫米150μL _ _
乙二胺四乙酸 (0.5 M)10毫米300μL _ _
笔/链球菌100单位/毫升150μL _ _
胎牛血清2%300μL _ _
脱氧核糖核酸酶I100 微克/毫升150μL _ _
全部的不适用15毫升

2.固有层溶液
新鲜准备并放在冰上。
试剂最终浓度数量（一个样品）
转速指数不适用9,600微升_
笔/链球菌100单位/毫升100μL _ _
解放酶100微克/毫升200μL _ _
脱氧核糖核酸酶I100微克/毫升100μL _ _
全部的不适用10毫升

3.上皮洗涤缓冲液
配制好后可在 4°C 下保存 1 个月。
试剂最终浓度数量
高级DMEM F12不适用4,900微升_
HEPES10毫米500μL _ _
谷氨酸最大10毫米500μL _ _
全部的不适用50毫升

实验室用品

1.15 mL 离心管（CELLTREAT，目录号：30411B）
2.50 mL 离心管（CELLTREAT，目录号：229430）
3.100 × 15 mm 培养皿（CELLTREAT，目录号：229693）
4.100 μm细胞过滤器（ Falcon ，目录号：352360）
5.40 μm细胞过滤器（Falcon，目录号：352340）
6.灌胃针（灌胃针，目录号：AFN2025S）
7.磨砂显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-550-343）
8.5 mL 聚苯乙烯圆底管，带细胞过滤器盖（Falcon，目录号：352235）
9.过滤移液器吸头（1,000 μL ）（ Genesee Scientific，目录号：24-430）
10.血清移液管（10 和 5 mL）（Genesee Scientific，目录号：12-102、12-104）

设备

1.手术剪
2.钳子
3.离心机 5810 R (Eppendorf)
4.伯爵夫人 3 (Invitrogen)
5.水浴（Fisher Scientific，Isotemp GPD 10）

软件和数据集

1.FlowJo v10.8.1
2.GraphPad Prism9

程序

A.收获结肠组织并清洁

1.从胃肠道切下结肠。
注意：由于活动性炎症，DSS 治疗小鼠的结肠往往比对照小鼠更短（图 1）。

图 1. 从对照或 DSS 处理小鼠中分离出的结肠组织

2.将结肠组织放入含有冰冷 HBSS 的培养皿中。
3.使用带有灌胃针的 10 mL 注射器用 HBSS 冲洗结肠组织，以清洁结肠组织。
4.切开组织并纵向打开。用新鲜的冰冷 HBSS 代替，在同一个培养皿中清洗几次。
5.清洁后，将组织切成小块（约 2 厘米长），并将它们与 HBSS 一起保存在冰上的同一个培养皿中，直到继续下一步。
注意：在进行下一步之前，清洁并切割实验所需的所有结肠组织。

B.隐窝和固有层的分离：在此步骤中，包含隐窝的上皮层将从组织的其余部分分离。

1.将结肠碎片转移到含有 15 mL 上皮细胞溶液的 50 mL 锥形管中。
2.在 37°C 水浴中孵育 15 分钟，每 5 分钟手动轻轻摇动管子。
3.孵育后，将管转移到冰上10分钟。
4.将组织转移到含有 15 mL 新鲜 HBSS 的新 50 mL 锥形管中。
使用不含 EDTA 的新鲜 HBSS 继续进行隐窝分离（步骤 B4-B7）非常重要。
5.手动剧烈摇动 30-40 秒。
6.取少量上清液样本，将其转移到载玻片中，并在显微镜下观察以验证结肠隐窝的存在（参见图 2 中的示例）。如果存在隐窝，则继续步骤 B7。
注意：如果不存在隐窝，请在冰上延长 EDTA 中的孵育时间 10 分钟，然后再次摇动 30-40 秒。

图 2. 结肠隐窝的明场图像。 (A) EDTA 孵育和连续三轮振荡后获得的结肠隐窝。 (B) (A) 的放大倍数。正方形突出显示结肠隐窝。

7.通过 100 μm 过滤器将上清液过滤到新的 50 mL 锥形管中，然后将组织放回同一 50 mL 锥形管中，从而收集上清液。
8.再重复步骤 B4–B7 两次以合并三个级分（总体积为 45 mL）。
9.将含有三个隐窝部分的上清液以 400 × g离心 5 分钟。
10.用 20 mL 的上皮洗涤缓冲液重新悬浮隐窝颗粒，并将样品保持在冰上，直到上皮部分消化步骤。
11.将剩余的组织（固有层）保留在含有 20 mL HBSS 的 50 mL 锥形管中。该组织将在下一步中被消化。

C.消化

1.固有层分数
a.上皮层分离后，取其余组织并将其放入含有 20 mL HBSS 的 50 mL 锥形管中。
b.轻轻摇动 30 秒来清洗组织。丢弃 HBSS 并添加 20 mL 的新 HBSS。重复此步骤至少三次。
注意：此步骤非常重要，因为任何剩余的 EDTA 都会阻碍固有层消化酶。
c.清洗后，将组织切成小块（约 0.5 cm 长），并将其转移至含有 10 mL固有层溶液的新 15 mL 锥形管中。
d.37 °C 水浴孵育 20 分钟。
e.20 分钟后，开始用 5 mL 移液器上下移液，直至组织顺利通过移液器。
注意：您可以从 10 mL 移液器开始，然后移至 5 mL 移液器。
f.37°C 孵育10 分钟。
g.开始用 1 mL 移液器上下移液，直到组织完全解离。
h.将样品转移至冰上并添加 1 mL FBS 和 80 μL EDTA 以停止消化反应。
i.用 1 mL 移液器上下移液，并通过 40 μm 过滤器过滤到 50 mL 锥形管中。
j.添加 HBSS 直至体积为 30 mL。
k.× g下旋转10 分钟。
l.去除上清液并用 2 mL 的 RPMI 重新悬浮细胞颗粒。
m.使用台盼蓝和细胞计数器对细胞进行计数并测量活力。

2.上皮分数
a.将上皮部分（包含隐窝）以 400 × g旋转5 分钟。
b.离心后检查细胞沉淀。
注意：根据隐窝沉淀调整 TrypLE 酶的用量非常重要。作为参考，类似于图 3A所示的颗粒将重悬于 5 mL（左）或 3 mL（右）的 TrypLE 中。

图 3.上皮部分解离过程中细胞沉淀的示例。 (A) 从对照（左）或葡聚糖硫酸钠 (DSS) 处理（右）小鼠在 50 mL 管中获得的隐窝沉淀。 (B) 在 15 mL 管中用 TrypLE 消化后漂浮细胞沉淀的示例。

c.将隐窝颗粒重新悬浮在 5 mL 预热的TrypLE中含有 DNase I ( 100 微克/毫升）。
d.轻轻地上下移液，直到隐窝沉淀溶解，并在室温 (RT) 下孵育样品 5 分钟。
e.5 分钟后，再次用 1 mL 移液器开始移液，总共 10 分钟。
注意：当有多个样品时，每 2-3 分钟从一个样品切换到另一个样品。
f.在显微镜下检查细胞，看看它们是否是单细胞。如果仍有 5-10 个细胞团块，请继续移液 5 分钟。
注意：我们不建议将上皮部分与 TrypLE 孵育超过 30 分钟。
g.将 1 mL 的 FBS 添加到 5 mL 的TrypLE中以停止反应。
h.通过 50 mL 锥形管中的 40 μm 过滤器过滤。添加上皮洗涤缓冲液至 50 mL。
i.°C下以 400 × g离心细胞10 分钟。关键点：如果细胞沉淀不可见或漂浮（参见示例图 3B），在此步骤后，我们建议增加离心时间和速度。我们发现，800 × g下 10 分钟不会损害细胞活力，并有助于沉淀细胞。
j.通过移液丢弃上清液。注意：颗粒很容易从管底部分离。小心去除上清液非常重要。如果需要，保留 1 或 2 mL 的体积以避免丢失细胞。
k.将细胞沉淀重新悬浮在 2 mL 的上皮洗涤缓冲液中。
l.使用台盼蓝和细胞计数器对细胞进行计数并测量活力。

协议验证

细胞活力

在这里，我们提供了在协议结束时获得的上皮细胞和基质细胞的细胞活力和细胞计数。
使用台盼蓝和自动细胞计数器获得细胞计数和活力，并列于表 1。
表1. 方案结束时的细胞计数和活力。
老鼠细胞计数（总计）可行性
上皮细胞固有层上皮细胞固有层
小鼠1_未处理520K14.1M83%98%
小鼠2_未处理540K12.2M84%95%
鼠标3_DSS396K17.8M93%98%
鼠标4_DSS340K15米93%96%

流式细胞仪

通过流式细胞术，我们表征了从初始小鼠和 DSS 处理小鼠的结肠中收获的上皮和固有层部分中的不同细胞类型。如图 4A 和 4C（上）所示，在活细胞中，来自幼稚小鼠（左图）的上皮部分中超过 80% 的细胞是上皮细胞（EPCAM + ），而在 DSS 处理的小鼠（右图）中，观察到较高的 CD45 +免疫细胞以及反映活动性炎症的EPCAM +细胞减少。我们还通过分别对被鉴定为 CD45 和 EPCAM 双阴性的基质细胞中的 CD31 和 Podoplanin (PDPN) 进行门控，研究了上皮部分内内皮细胞和成纤维细胞的潜在存在。我们注意到，在上皮部分中，没有 CD31 +或 PDPN +细胞的污染。在固有层部分（图 4B 和 4C，底部）中，我们观察到在最后一组免疫细胞浸润较高的幼稚小鼠和 DSS 小鼠中，大多数细胞都是基质（主要是成纤维细胞，以及较小程度的内皮细胞）。

图 4. 结肠中的流式细胞术门控策略。 (A 和 B) 代表性流图和 (C) 与葡聚糖硫酸钠 (DSS) 相比，幼稚组 (左图) 的上皮 (A) 和固有层部分 (B) 中的细胞亚群（在活细胞上预门控）的量化）处理的小鼠（右图）。数据显示为每组三只小鼠的平均值±SD。 CD45 + = 免疫细胞，EPCAM + = 上皮细胞，CD31 + = 内皮细胞，PDPN + = 成纤维细胞。
克罗恩病患者结肠活检的处理方案

材料与试剂

生物材料

该协议对于新鲜和冷冻保存的活检同样有效，但为了一致性和过程效率，我们通常使用冷冻保存的组织（参见一般说明）。活检是从 2021 年 1 月至 12 月期间在费城儿童医院接受内窥镜检查的 0-17 岁儿科患者（表 2）中采集的。在样本采集之前，根据机构审查委员会指南（方案 16-013042）获得了知情同意书）。除用于临床护理的活检外，还由训练有素的胃肠病学家从升结肠收集研究活检。有骨髓移植史或先前诊断出任何出血性、凝血障碍或聚集障碍的患者被排除在本研究之外。病理学家专家证实了诊断。对对照受试者进行了胃肠道不适评估，但发现内镜和组织学结果正常。

表 2. 活检捐献者数据
ID年龄性别种族种族
CTR-19男性白色的非西班牙裔/拉丁裔
CTR-28男性白色的非西班牙裔/拉丁裔
CTR-38女性白色的非西班牙裔/拉丁裔
克罗恩病-17女性亚洲人非西班牙裔/拉丁裔
克罗恩病-29男性白色的非西班牙裔/拉丁裔
克罗恩病-38女性白色的非西班牙裔/拉丁裔

试剂

1.CryoStor（ CS-10，STEMCELL Technologies，目录号： 07930）
2.DPBS （Gibco，目录号： 14190-136）
3.山梨醇（Fisher Bioreagents，目录号： BP439-500）
4.蔗糖（Sigma，目录号： S8501）
5.BSA （Fisher Bioreagents，目录号： BP1600-100）
6.庆大霉素（Gibco，目录号： 15750-060）
7.DMEM，高葡萄糖（Corning，目录号： 10-013-CV）
8.高级 DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific，目录号： 12634028）
9.FBS （峰值血清，目录号： PS-FB1）
10.EDTA （优质生物，目录号： 351-027-721）
11.HBSS （Gibco，目录号： 14175-079 ）
12.抗生素抗真菌剂（Gibco，目录号： 15240-062）
13.HEPES（Gibco，目录号： 15630-080）
14.GlutaMAX 补充剂（Gibco，目录号： 35050-061）
15.Liberase TH （Sigma，目录号： 5401135001 ）
16.DNase I （罗氏，目录号： 10104159001 ）
17.IntestiCult 类器官生长培养基，人（ STEMCELL Technologies ，目录号： 06010 ）
18.TrypLE Express （Gibco，目录号： 12605-010）
19.台盼蓝溶液（Gibco，目录号： 15250061）
20.死细胞去除套件（ Miltenyi Biotech，目录号： 130-090-101 ）和必要的配件（参见实验室用品）
21.10 × Chromium Next GEM 单电池 3' v3.1

解决方案

1.Liberase TH 库存为 13 Wunsch 单位 (WU)/mL（2.5 mg 胶原酶/mL），溶于 HBSS。等分试样储存在-20 ° C ，冷冻/解冻仅限两个周期
2.DNase I 库存为 50 U/mL (25 mg/mL)，溶于 DPBS。等分试样储存在 -20 °C下，冷冻/解冻仅限五个循环
3.HBSS-BSA（1% BSA，过滤灭菌）
4.活检收集介质（参见食谱）
5.螯合缓冲液；每次都是新鲜准备的（参见食谱）
6.传输介质（参见食谱）
7.解冻介质（参见食谱）
8.基质解离酶（参见食谱）
9.上皮解离酶（参见食谱）

食谱

1.活检采集介质
试剂最终浓度数量
高级 DMEM/F121 ×500毫升
抗生素抗真菌药1 ×5毫升
HEPES10毫米5毫升
谷氨酸最大1 ×5毫升
全部的不适用515毫升

2.螯合缓冲液（过滤灭菌并在冰上冷却）
试剂最终浓度数量
山梨醇2%0.5克
蔗糖1%0.25克
牛血清白蛋白1%0.25克
庆大霉素1%25μL _ _
磷酸盐缓冲溶液1 ×25毫升
全部的不适用25毫升

3.运输介质
试剂最终浓度数量
DMEM1 ×500毫升
抗生素-抗真菌药1 ×5毫升
HEPES10毫米5毫升
全部的不适用510毫升

4.解冻培养基
试剂最终浓度数量
运输介质不适用47.5毫升
胎牛血清5%2.5毫升
全部的不适用50毫升

5.基质解离酶（冰上）
试剂最终浓度数量
HBSS不适用5毫升
解放酶-TH0.13 乌/毫升50μL _ _
脱氧核糖核酸酶I0.5单位/毫升50μL _ _
全部的不适用5毫升

6.上皮解离酶
试剂最终浓度数量
胰蛋白酶1 ×1.5毫升
脱氧核糖核酸酶I0.5单位/毫升15μL _ _
全部的不适用1.5毫升

实验室用品

1.冷冻保存容器（CoolCell，Corning，目录号： CLS432001 或 Mr. Frosty，Fisher Scientific，目录号： 15-350-50）
2.Dumont SS 镊子，每个标本需要两个镊子（Fine Science Tools，目录号： 11203-25）
3.15 和 50 mL 锥形管
4.35 mm 圆形 TC 培养皿（也可以使用 6 孔板中的一个孔）
5.40 μm细胞过滤器
6.FACS 管
7.MACS配件：
a.MS柱（Miltenyi Biotec，目录号： 130-042-201）
b.MiniMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号： 130-042-102）或OctoMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号： 130-042-109）

设备

1.管旋转器（Thermo Scientific，目录号： 88881001）
2.ThermoMixer（Eppendorf，目录号： 05-412-501）
3.涡旋混合器（例如，Vortex Genie-2，Scientific Industries，目录号： SI-0236）
4.体视显微镜（尼康，型号：SMZ-U）
5.支持 15 和 50 mL 锥形离心机
6.台式微量离心机
7.用于细胞数量和活力计数的血细胞计数器
8.自动细胞计数装置（例如 Invitrogen Countess II）

程序

A.活检组织的冷冻保存

1.在结肠镜检查期间将结肠活检收集到含有 1 mL 活检收集介质的 Eppendorf 管中，并立即运送到实验室进行冷冻保存。
2.清洗组织碎片（不要使用真空吸引器）：
注意：如果从标本（例如，患者来源的结肠）建立原代培养物，这对于防止污染特别重要。
a.取出活检收集介质。
b.重复以下 3 次：加入 1 mL DPBS，上下移液 5-10 次，用 P1000 移液器吸出 DPBS。
3.使用 P1000 吸头，轻轻地将组织转移到含有 1 mL CryoStor 的标记冷冻管中（尝试携带尽可能少的 PBS），并让组织沉降到冷冻管底部。
4.将冷冻管放入冷冻保存罐中。
5.将冷冻保存罐放入-80 °C冰箱中。
6.°C过夜孵育后，样品应移至液氮储存。

B.解冻冷冻保存的组织

1.在水浴中解冻活检并将其转移至1.5 mL Eppendorf 管中。
注意：如果使用珠浴，请将装有预热水的烧杯放入珠子中，并将冷冻管放入水中。
2.用 1 mL 解冻介质清洗 3 次。
此处和下文中，按照此程序进行一个洗涤周期：添加 1 mL 适当的洗涤溶液（此处解冻介质）并上下移液 10 次以洗涤组织，不要让碎片进入移液器吸头。除去用过的洗涤液。

C.隐窝和固有层的分离

1.用 1 mL螯合缓冲液清洗两次（图 5B）并丢弃用过的缓冲液。

图 5. 使用镊子将结肠隐窝与固有层分离。 (A) 隐窝刮擦过程的图形表示，也在视频 1 中进行了说明。(B) 结肠活检，从冷冻保存中恢复并悬浮在螯合缓冲液中。 (C) 结肠活检，在螯合缓冲液和 EDTA 中旋转后，涡旋后并转移至 35 mm 培养皿中进行刮擦。 (D) 分离的固有层 (LP) 和结肠隐窝 (c) 刮擦后的视图。 (E) 在酶消化之前悬浮在 DPBS 中的固有层。

视频1. 隐窝刮取演示
2.此后，将 80 μL 0.5 M EDTA 添加到剩余的约 20 mL 螯合缓冲液中。
3.添加 1 mL 螯合缓冲液 + EDTA （最终浓度 2 mM）将组织放入 1.5 mL Eppendorf 管中，并冷旋转（在置于冷室中的管旋转器中，设置为 10 rpm）15分钟。在此期间，贴上标签并在冰上冷却：
a.35毫米圆形TC刮削盘；
b.15 mL 锥形，用于隐窝收集；
c.1.5 mL Eppendorf 管用于基质收集。
4.以最大速度设置涡旋组织五个周期：涡旋 30 秒，然后在冰上休息 30 秒。
注意：对于某些样品，隐窝在涡旋期间开始分离。
5.将用过的螯合缓冲液（可能含有隐窝）转移到准备好的 15 mL 隐窝收集管中。
6.使用 1 mL 的新鲜螯合缓冲液将组织轻轻转移到准备好的 35 mm 培养皿中（图 5C）。
7.在立体显微镜下，将活检片段的管腔侧（上皮）朝上放置，并刮掉隐窝（图 5A 和 5D；视频 1）。
注意：如果很难看出哪一面朝上，最简单的方法就是开始刮擦。如果没有隐窝分离，则表明管腔朝下；将片段翻转过来并重试。
8.将隐窝悬浮液从 35 mm 盘转移到 15 mL 隐窝收集管中。
9.将剩余的组织移入原来的 Eppendorf 管中，并用基质 (S) 标记。
10.使用 1 mL 解冻介质冲洗基质碎片上剩余的隐窝，并将悬浮液转移到 15 mL 隐窝收集管中（基质中留下尽可能少的液体）。
11.将基质浸入 1 mL 的 DPBS 中，并将其放在冰上（图 5E）。
12.使用 2 mL 解冻介质冲洗 30 mm 盘的剩余隐窝，并将悬浮液转移到 15 mL 隐窝收集管中。
13.× g旋转隐窝收集管 1分钟。
注意：此处和下文中，将离心机保持冷却至 4 °C 是有益的，但不是关键。
14.将沉淀转移至 1.5 mL Eppendorf 管中，并用额外的 HBSS (~500 μL) 清洗。
15.在 1 mL 冷 IntestiCult（含 0.5 U/mL DNase）中重建隐窝。
16.可选：对隐窝进行计数（典型产量为每个活检片段 200-500 个隐窝）。
17.将隐窝悬浮液放置在冷室中轻轻旋转，同时处理固有层。

D.消化

1.固有层分数
a.准备用于三个消化循环的酶混合物。
b.周期 1：添加 500 μL 酶混合物与基质碎片。
c.将管转移到 ThermoMixer 中 10 分钟（37 °C，800 rpm）。
在此期间，用 2 mL FBS 灌注 40 μ m 过滤器，放入 50 mL 锥形容器中；这将是收集管。
d.迫使上清液通过过滤器进入收集管。
e.第2周期：添加500 将μL新鲜酶与剩余的组织碎片混合。
f.通过 P1000 吸头缓慢地上下移液 5-10 次以增强分解。
g.将管转移到 ThermoMixer 中 10 分钟（37 °C，800 rpm）。
h.迫使上清液通过过滤器进入同一收集管。
i.周期 3：将 500 μL新鲜酶混合物添加到基质碎片中。
j.通过 P1000 吸头缓慢地上下移液 5-10 次以增强分解。
k.将管转移到 ThermoMixer 中 10 分钟（37 °C，800 rpm）。
l.迫使悬浮液通过过滤器。
m.使用 1 mL 胰岛素注射器的柱塞迫使剩余碎片通过过滤器。
n.洗过滤器中装有 4 mL 解冻介质。
o.将收集管中的内容物转移到新的 15 mL 锥形管中。
注意：此步骤是可选的，但在 15 mL 锥形中旋转后更容易看到细胞沉淀。
p.× g旋转3 分钟。
μ L 的 FBS 通过过滤器盖来启动 FACS 管。
q.在 0.5 mL 解冻培养基中重新溶解沉淀，然后滤入已准备好的 FACS 管中。
r.使用血细胞计数器和台盼蓝排除法手动或在自动设备中对细胞和活力进行计数。
2.上皮分数
a.× g旋转隐窝悬浮液1 分钟。
b.在 1.5 mL 的 TrypLE + 15 中重建隐窝颗粒微升 DNase I。
为了有效混合，分成 3 × 1.5 mL Eppendorf 管，每个管含有 500 μL隐窝+酶悬浮液。
c.将管转移到 ThermoMixer 中 30 分钟（37 °C，800 rpm）。
通过迫使 1 mL FBS 通过过滤器盖来启动 FACS 管。关键：消化结束时可能会形成大块。
d.滤入已准备好的 FACS 管中，并用 1 mL 解冻介质清洗过滤器。
e.× g旋转3 分钟，并在 500 μL HBSS-BSA 中重新溶解，辅以 5 μL DNase I。
f.使用血细胞计数器和台盼蓝排除法手动或在自动设备中对细胞和活力进行计数。

E.对于单细胞 RNA 测序，单细胞 cDNA 文库的制备和下一代测序按照 10 × Chromium Next GEM Single Cell 3' v3.1 用户手册中的概述进行。

数据分析

× Cellranger 3.1.0对读数进行比对和量化，并通过组合所有可用样本构建基因表达矩阵。表达少于 1,000 个基因和线粒体 UMI（独特分子标识符）超过细胞总数 30% 的低质量细胞被丢弃。仅使用在超过 100 个细胞中表达的基因进行分析。每个基因的 UMI 计数通过细胞总数进行归一化，然后在添加伪数（Bolstad，2023）后进行对数转换，以避免负值和未定义的对数值。单细胞 RNA 测序数据指标和活力计数分别列于表 3 和表 4 中。使用细胞中表达变异最高的前 2,000 个基因，我们使用 R preprocessCore 包对对数归一化数据进行主成分分析 (PCA) (Bolstad, 2023)。 PCA 的前 10 个维度解释了数据中最大的变化，被用作使用统一流形逼近和投影 (UMAP) 进行非线性降维的输入( Becht ) 等人，2018 ）。我们使用 Monocle 中实现的密度聚类函数在 UMAP 坐标上运行聚类（ Qiu 等人，2017 ）。最后，我们根据文献中已知细胞标记物的表达模式为簇分配细胞类型（图 6）。

表 3. 单细胞数据指标
ID测序总细胞数细胞被移除的原因是：细胞后过滤
双峰*< 500 个基因*> 30% 线粒体 UMI*
CTR-16,998751,7124,3181,977
CTR-211,8802121,3064,3935,161
CTR-39,035385,5367,8331,044
克罗恩病-16,905611,5244,5141,658
克罗恩病-23,99717 号2,5183,382513
克罗恩病-311,5872112,285 人4,5295,267
*移除的细胞总数并不总是等于第 3-5 列的总和，因为许多细胞符合多个标准（例如，同一细胞可能具有 < 500 个基因且线粒体 UMI > 30%）

表 4. 细胞和活力计数
样本％可行性活细胞总数
基质上皮细胞基质上皮细胞
CTR-19048620,00058,500
CTR-27776328,50070,000
CTR-38542267,000123,000
克罗恩病-16657126,000141,000
克罗恩病-2 9057114,50050,000
克罗恩病-36578264,00045,000

图 6. 组织活检的单细胞 RNA 测序分析。 (A)六个样本中所有细胞的统一流形近似和投影 ( UMAP) 可视化，按细胞类型区室进行颜色编码。 (B) UMAP 按疾病状态划分。 (C) 上皮细胞 (EPCAM)、基质细胞 (PDGFRA) 和免疫细胞 (PTPRC) 典型基因标记物表达的可视化。

协议验证

细胞活力
单细胞 RNA 测序数据指标和活力计数列于上面的表 3 和表 4 中。
注意：如果细胞活力低于 70%，您可以使用死细胞去除试剂盒（按照提供的手册进行操作）。

无监督细胞聚类
均匀流形近似和投影 ( UMAP) 可视化，以及典型上皮细胞、基质细胞和免疫细胞表达的可视化如图 6 所示。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.上述方案针对结肠组织进行了优化。然而，经过一些修改，它们也可用于小肠组织。对于小鼠小肠，可以在 EDTA 孵育之前刮取绒毛以获得富含隐窝的样品。对于人类结肠活检，刮取后的隐窝和绒毛悬浮液可以通过100μm孔径的膜过滤以隔离隐窝，而绒毛则不会通过。
2.我们在处理前冷冻保存活检组织。从逻辑上讲，由于我们依赖于从内窥镜套件中收集临床样本，因此很难计划新鲜组织处理的时间和预订设备。由于处理一些新鲜标本和一些冷冻保存的标本会成为混杂因素，因此我们冷冻保存所有标本并分批执行细胞分离方案。
3.至关重要的是，应在从受试者获得活检后 30 分钟内尽快冷冻保存。
4.将上皮细胞与基质细胞混合以生成单细胞 cDNA 文库会导致活上皮细胞的转录组产量降低。因此，两个分数必须单独测序。为了优化不可避免的成本增加，我们一次对三名受试者的活检进行测序：每个上皮部分都会产生一个独立的文库，但基质部分可以进行多重分析，因此只有一个额外的文库。
5.人类方案中的离心步骤很短（30 秒至 3 分钟），因此可以在样品保持凉爽的情况下在室温下进行。然而，如果离心机可以保持在 4 °C ，这将进一步确保样品保持低温。

故障排除

1.隐窝粘在镊子上：确保在接触组织之前始终将镊子浸入螯合缓冲液中。
2.隐窝分离不良：我们发现 EDTA 库存是最有可能的罪魁祸首；在大多数情况下，打开一瓶新瓶子可以解决问题。每次都准备新鲜的螯合缓冲液。
3.细胞团而不是单个细胞：刷新酶。

致谢

本出版物是肠道细胞图谱克罗恩病联盟的一部分，该联盟由 Leona M. 和 Harry B. Helmsley 慈善信托基金资助，并得到赫尔姆斯利向费城儿童医院的拨款支持。 www.helmsleytrust.org/gut-cell-atlas/ 。
这项工作还得到 NIH R01-DK124369 (KEH) 和费城儿童医院胃肠上皮建模计划的支持。
这些协议的灵感来自Mahe开发的独立协议等人。 (2015 )，帕里克等人。（2019 ）和斯迈莉等人。（2019 ）。

道德考虑

动物样品：所有动物实验均按照宾夕法尼亚大学动物护理和使用机构委员会批准的方案进行。
人体样本：费城儿童医院的机构审查委员会批准了该方案 (2014-010826)，所有患者家长均提供了书面知情同意书。
参考

博尔斯塔德，B.（2023）。 preprocessCore：预处理函数的集合。 R 包版本 1.60.2。
Becht, E.、McInnes, L.、Healy, J.、Dutertre, CA、Kwok, IWH、Ng, LG、Ginhoux, F. 和 Newell, EW (2018)。使用 UMAP 实现单细胞数据可视化的降维。纳特。生物技术。 37（1）：38-44。
Elmentaite, R.、Ross, AD、Roberts, K.、James, KR、Ortmann, D.、Gomes, T.、Nayak, K.、Tuck, L.、Pritchard, S.、Bayraktar, OA 等。（2020）。发育中的人类肠道的单细胞测序揭示了与儿童克罗恩病的转录联系。开发。单元格55(6)：771–783.e5。
Mahe, MM、Sundaram, N.、Watson, CL、Shroyer, NF 和 Helmrath, MA (2015)。从整个组织和活检中建立人上皮肠样和结肠样。 J. 维斯。过期。 (97):52483。
Maloy, KJ 和 Powrie, F. (2011)。肠道稳态及其在炎症性肠病中的破坏。自然474（7351）：298-306。
Ng, SC, Shi, HY, Hamidi, N., Underwood, FE, Tang, W., Benchimol, EI, Panaccione, R., Ghosh, S., Wu, JCY, Chan, FKL 等。（2017）。 21 世纪炎症性肠病的全球发病率和患病率：基于人群的研究的系统回顾。柳叶刀390(10114)：2769–2778。
Parikh, K.、Antanaviciute, A.、Fawkner-Corbett, D.、Jagielowicz, M.、Aulicino, A.、Lagerholm, C.、Davis, S.、Kinchen, J.、Chen, HH、Alham, NK,等人。（2019）。健康和炎症性肠病中的结肠上皮细胞多样性。自然567（7746）：49-55。
邱X.、毛Q.、唐Y.、王L.、Fish, R.、Pliner, HA 和Trapnell, C. (2017)。反向图嵌入解决了复杂的单细胞轨迹。纳特。方法14(10):979–982。
Smillie, CS、Biton, M、Ordovas-Montanes, J、Sullivan, KM、Burgin, G、Graham, DB、Herbst, RH、Rogel, N、Slyper, M、Waldman, J 等人…… （2019）。溃疡性结肠炎期间人类结肠的细胞内和细胞间重新布线。单元格178(3)：714–730.e22。