材料与试剂

试剂

1.Roche Terminal Transferase 8000 U（Merck，目录号：3333566001）
2.ChromaTide TM Alexa Fluor TM 488-5-dUTP（ Thermo Fisher，目录号：C11397）
3.Roche DIUTPS-RO （DIG-11-dUTP）（地高辛-11-dUTP，碱稳定）（Merck，目录号：11093088910）
4.Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物，100 mg（ Thermo Fisher，目录号：H1399）
5.ProLong TM Gold 抗淬灭封固剂（ Thermo Fisher，目录号：P36930）
6.多聚甲醛，16% w/v 水溶液溶液，不含甲醇（ Thermo Fisher，目录号：043368.9M）
7.甲酰胺（默克，目录号：FX0420）
8.氯化钠（Merck，目录号：1.16224）
9.氯化钾（Merck，目录号：7447-40-7）
10.氯化镁（Merck，目录号：7786-30-3）
11.柠檬酸钠（Merck，目录号：1613859）
12.磷酸钠，0.5 M，pH 7.0 缓冲液（ Thermo Fisher，目录号：J63791.AK）
13.盐水柠檬酸钠（ SSC）20×浓缩物（Merck，目录号：S6639）
14.乙二胺四乙酸（EDTA）（Merck，目录号：E9884-100G）
15.牛血清白蛋白（BSA）（Merck，目录号：A9418-5G）
16.Ficoll ® 400（默克，目录号：F2637-5G）
17.聚乙烯吡咯烷酮（Merck，目录号：P0930-50G）
18.BSA，乙酰化（ Thermo Fisher，目录号：AM2614）
19.精胺（Merck，目录号：S3256-1G）
20.抗地高辛抗体（Merck，11333062910）
21.山羊抗小鼠二抗，Alexa Fluor Plus 488（ Thermo Fisher，目录号：A55058）
22.山羊抗小鼠二抗，Alexa Fluor Plus 555（ Thermo Fisher，目录号：A32727）
23.RNase A（ Thermo Fisher，目录号：EN0531）
24.Tris-HCl，pH 7.5（ Thermo Fisher，目录号：15567027）
25.Tween 20（默克，目录号：P1379）
26.蔗糖（默克，目录号：S0389）
27.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Merck，目录号：P4417）
28.Triton X-100（默克，目录号：9036-19-5

解决方案

1.杂交缓冲液（参见配方）
2.Denhardt 溶液 100 × (50 mL)（参见配方）
3.LB01 缓冲液 (10 mL)（参见配方）
4.分选缓冲液 (10 mL)（参见配方）

设备

1.潮湿室（例如， StainTray Slide Staining， Polysciences ，目录号：25502-1）
2.聚赖氨酸粘附载玻片（例如，Roth，目录号：ET10.1）
3.用于显微镜载玻片的盖玻片（例如，Merck，品牌盖玻片，目录号：BR470045）
4.CellTris 30 µm（Sysmex，目录号：CTS220112）
5.共焦显微镜、Leica DMI 6000B、TCS TrinoTCS SP8
6.平场复消色差 DIC H 油浸透镜 (63 × /1.4)

软件

1.ImageJ，斐济（ https://imagej.net/software/fiji/ ）

程序

A.细胞核分离

注：细胞核分离是根据Pontvianne等人描述的方法进行的。（2007 年和 2012 年）。
1.从 4 周龄的拟南芥植物中收集 2-3 片叶子，并在Tris缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5、10 mM EDTA、100 mM NaCl）中的4% 甲醛溶液中在室温下固定 20 分钟。叶子应完全浸没。
笔记：
a.对于 4% 固定剂制剂，将 10 mL 16% 无甲醇甲醛稀释在 30 mL Tris 缓冲液中。
b.也可以按照相同的方案从幼苗中分离细胞核。
警告：甲醛是一种挥发性有毒致癌物质，只能在通风橱中使用。使用它时还应佩戴手套、安全眼镜和防护服。
2.Tris缓冲液中清洗叶子两次，每次 10 分钟。
3.用刀片在 0.5 mL 的 LB01 缓冲液中切碎叶子，在培养皿中获得汤。
4.μm细胞过滤器过滤所得裂解液。
5.每 3 μL步骤 3 中获得的过滤核悬浮液添加 12 μL分选缓冲液。
6.将混合物涂抹在覆盖有聚赖氨酸的粘附载玻片上，并在室温下干燥（可以放置过夜）。

B.探针准备

1.用双蒸 H 2 O 溶解 DNA 寡核苷酸至终浓度 100 μM 。
2.准备末端转移酶 ( TdT ) 工作溶液：5 mM CoCl 2 、1× TdT反应缓冲液、0.1 mM DIG-11-dUTP、0.1 mM dATP和PCR 管中每个反应400 U 的TdT 。
笔记：
a.您还可以选择另外提供带有 Alexa Fluor 5-dUTP 的反应缓冲液（最终浓度：0.2 mM）。
b.可以使用 Biotin-11-dUTP 代替 DIG-11-dUTP。
3.μL DNA 寡核苷酸与 9 μL TdT工作溶液混合，并在 PCR 管中 37°C 孵育 40 分钟。
笔记：
a.在不摇动的情况下进行孵育。孵育后，反应混合物可保存在-20 ° C。在我们的研究中，探针在保存三个月后即可工作。
b.对于我们的研究，探针由Metabion公司（ Planegg ，德国）提供。

C.荧光原位杂交（FISH）

1.准备透化缓冲液：1× PBS 中的 0.1% Triton X-100。
2.将样品在透化缓冲液中室温孵育 10 分钟。缓冲区应覆盖整个样本区域。
3.用 1× PBS 清洗样品两次。
4.准备杂交缓冲液（ Niedojadlo等人，2012）。
5.μL杂交缓冲液中稀释 1 μL探针混合物（B 部分）（最终探针浓度：100 pM / μL ）。
注意：杂交缓冲液中的最终探针浓度可能因不同的 RNA 而异，应通过实验进行调整。
6.将 100 μL杂交缓冲液添加到载玻片上的样品中，并盖上载玻片盖。
7.将载玻片放入 28°C 培养箱的潮湿杂交室中并放置过夜。杂交期间应防止载玻片干燥。为此，应在室内放置少量 PBS 或水以保持稳定的湿度。
注意：轻轻摇动（0.6 rpm）进行孵育
8.孵育后，按照以下顺序清洗载玻片：4× SSC 5 分钟、 2× SSC 5 分钟、 1× SSC 5 分钟、 1 × PBS 10 分钟。

D.免疫标记

1.在含有 0.05% 乙酰化 BSA 的 1× PBS 中按 1:100 稀释，稀释抗地高辛一抗。
2.μL抗体稀释液（含有步骤 1 中的抗地高辛抗体）覆盖样品，并盖上载玻片盖。将样品在 10°C 的潮湿室中孵育过夜。
3.从样品中去除一抗，并用 1× PBS 清洗 5 分钟。
4.在含有 0.05% 乙酰化 BSA 的 1× PBS 中稀释荧光染料标记的二抗（稀释 1:1,000）。
5.将 100 μL二抗溶液置于样品上，盖上载玻片，在湿盒中 37 °C 孵育 3 h。
6.从样品中除去二抗，用 1× PBS 清洗两次，每次 5 分钟。
注意：孵育时间和温度以及抗体浓度应根据所使用的不同抗体通过实验确定。

E.细胞核标记和样品安装

1.在 1× PBS 中按 1:1,000 稀释 Hoechst 33342，并向样品中添加 100–200 μL 。室温孵育 10 分钟。
注意：对于细胞核标记，也可以使用在 1 × PBS 缓冲液中按 1:1,000 稀释的DAPI（4 ' ,6-二脒基-2-苯基吲哚）。
2.从载玻片中取出 Hoechst 33342 溶液，并用 1× PBS 清洗一次，持续 5 分钟。
3.μL ProLong Gold Antifade试剂覆盖样品，小心盖上盖玻片，用手指用力按下以除去气泡，使抗淬灭试剂均匀分布在样品上。
4.让样品在室温下干燥，并避光。

数据分析

在我们的研究中，使用 Leica SP8 共焦显微镜记录结果，使用二极管 405 激光器、波长为 488 nm 的氩/离子激光器以及二极管激光器 DPSS 561（发射波长为 561 nm 的光，并经过优化）。针孔，长曝光时间（200kHz）和63 × （数值孔径，1.4）。图像按顺序在蓝色 (Hoechst 33342)、绿色 (Alexa 488 荧光) 和红色 (Alexa 555) 通道中收集。设置低激光功率（最大功率的 0.4%–5%）和单通道收集，以最大限度地减少荧光通道之间的渗透。对于渗透分析，使用 Leica SP8 软件。
所提出的方法之前用于定位从 4 周龄拟南芥叶子中分离的细胞核中的 pri-miRNA156a 和 pri-miRNA163 （图 2）。

图 2. 使用地高辛标记探针和靶向地高辛配基的抗体检测 pri-miR156a 和 pri-miR163。应用与位于茎环结构下游的内含子序列杂交的探针。 (A) pri -miRNA的茎环结构示意图；探针用红色表示。 (B) pri-miRNA156a（左图，绿色）和 pri-miRNA163（右图，绿色）的检测。 DNA 用 Hoechst（蓝色）染色。比例尺 = 2.5 μm 。

为了确认观察到的核点是由于探针与pri -miRNA 杂交所致，我们用 RNase A（100 μg /mL，PBS 溶液 30 分钟）处理分离的细胞核，然后应用识别 pri-miR156a 内含子序列的探针（图 3B）。我们没有在用 RNase A 处理的细胞核中观察到杂交信号。同样，如果应用与 pri-miR156a 内含子匹配的正义探针，我们也没有观察到荧光信号（图 3C）。此外，我们还通过斐济软件计算了荧光强度，以区分杂交的阳性荧光信号和背景。

图 3.使用内含子识别探针（内含子反义探针）在经 RNase A 处理的细胞核中检测（荧光原位杂交，FISH）pri-miR156a（红色），并使用与 miR156a 片段相同的序列的探针内含子（内含子感应探针）。荧光强度沿着每个合并图像上显示的黄线绘制。比例尺 = 2.5 μm 。

食谱

1.杂交缓冲液
试剂最终浓度数量
甲酰胺30%（体积/体积）600微升
20 × SSC4 ×400微升
100× 登哈特解5 × 登哈特缓冲液 100微升
磷酸钠缓冲液 (0.5 M)50毫米200微升
乙二胺四乙酸 (0.5 M)1毫米4微升
水分子_不适用696微升
全部的不适用2毫升

2.Denhardt 溶液 100 × (50 mL)
试剂最终浓度数量
牛血清白蛋白 (BSA)2%（重量/体积）1克
聚蔗糖4002%（重量/体积）1克
聚乙烯吡咯烷酮2%（重量/体积）1克
水分子_不适用50毫升
全部的不适用50毫升

3.LB01缓冲液（10毫升）
试剂最终浓度数量
Tris-HCl (1M)15毫米150微升
乙二胺四乙酸2毫米20微升
精胺0.5毫米5微升
氯化钾 ( KCl ) (1M)80毫米800微升
氯化钠 (NaCl) (1M)20毫米200微升
海卫一 (10%)0.1%1毫升

4.分选缓冲液 (10 mL)
试剂最终浓度数量
Tris-HCl (1 M)100毫米1毫升
氯化钾 ( KCl ) (1 M)50毫米500微升
氯化镁 (MgCl 2 ) (1 M)2毫米20微升
吐温 20 (10%)0.05毫米50微升
蔗糖5%0.5克
牛血清白蛋白 (BSA)3%0.3克

致谢

这项工作得到了波兰国家科学中心的资助（UMO-2019/32/T/NZ1/00508、UMO-2016/23/N/NZ1/00010、UMO-2013/10/A/NZ1/00557）和波兰波兹南亚当·密茨凯维奇大学卓越研究型大学倡议 (05/IDUB/2019/94)，至 AJ

利益争夺

不存在利益冲突或利益竞争。

参考

Bhat, S.S.、Bielewicz, D.、 Gulanicz , T.、Bodi, Z.、Yu, X.、Anderson, S.J.、Szewc, L.、Bajczyk, M.、 Dolata , J.、Grzelak, N. 等。（2020）。拟南芥中mRNA 腺苷甲基化酶 (MTA) 将 m 6 A 沉积在 pri-miRNA 上以调节 miRNA 生物合成。国民百分比阿卡德。科学。美国117(35)：21785–21795。
Gonzalo, L.、 Tossolini , I.、 Gulanicz , T.、 Cambiagno , DA、Kasprowicz- Maluski , A.、Smolinski, DJ、Mammarella, MF、Ariel, FD、Marquardt, S.、 Szweykowska-Kulinska , Z.,等人。（2022）。 microRNA 编码位点的 R 环促进植物中 pri-miRNA 的共转录加工。纳特。植物8(4)：402–418。
胡 L.、茹 K.、张 L.、黄 Y.、朱 X.、刘 H.、Zetterberg, A.、程 T. 和苗 W. (2014)。荧光原位杂交 (FISH)：生物标志物研究和个性化医疗日益需要的工具。生物标志物研究中心。 2(1)：e1186/2050-7771-2-3。
Niedojadlo , K.、 Piecinski , S.、Smolinski, DJ、Bednarska-Kozakiewicz, E. (2012)的转录活性风信子 L.受精前后的雌配子体细胞。植物236：153-169。
Pontvianne , F.、 Matía , I.、Douet, J.、 Tourmente , S.、Medina, FJ、Echeverria, M. 和 Sáez-Vásquez, J. (2007)。 AtNUC - L1的表征揭示了核仁素在拟南芥核仁组织和AtNUC - L2基因沉默中的核心作用。摩尔。生物。单元格18(2)：369-379。
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