材料与试剂

生物材料

1.SW982细胞系（ATCC，目录号：HTB-93）
2.RASF原代细胞（来源）

试剂

1.Lipofectamine TM 3000（Invitrogen，目录号：L300001）
2.模拟物和抑制剂（GenePharma 公司，目录号：B02001，B03001）
3.0.25% 胰蛋白酶-EDTA（HyClone，目录号：SH30042.01B）
4.胎牛血清（FBS）（生工生物技术，目录号：E51002）
5.DMEM高糖培养基（HyClone，目录号：SH30022.01B）
6.青霉素-链霉素 100 × (P/S)（HyClone，目录号：SV30010）
7.盐水（CR双鹤，目录号：H20054037）
8.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Biosharp，目录号：BL601A）
9.DNase（Sigma-Aldrich，目录号：AMPD1）
10.透明质酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：37259-53-3）
11.I 型胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：SCR103）
12.TRIzol 试剂（Invitrogen，目录号：15596-026）
13.Pierce RIPA 缓冲液（Thermo ，目录号：89900）
14.NaOH （西龙化学，目录号：7697-37-2）
15.H CI（西龙化学，目录号：121-23-1）

解决方案

1.SW982 和 RASF 细胞培养基（参见配方）

食谱

1.SW982和RASF细胞培养基
试剂最终浓度体积
DMEM高糖培养基不适用450毫升
胎牛血清10%50毫升
压力/压力0.1%0.5毫升
全部的不适用500.5毫升
用 NaOH 或 HCl 将 pH 调节至 7.2–7.4。
无血清DMEM培养基是指不添加FBS和抗生素的培养基（基础培养基）。

实验室用品

1.100毫米无菌聚苯乙烯培养皿（Nunc，目录号：150340）
2.6孔无菌聚苯乙烯细胞培养板（Nunc，目录号：150239）
3.15 mL无菌离心管（KIRGEN，目录号：KG2611）
4.1.5 mL离心管（KIRGEN，目录号：KG2211S）
5.眼科剪刀（Shinva，目录号：ZC056R）
6.血细胞计数器（Bio-Rad，目录号：1450011）
7.细胞培养瓶（Nunc，目录号：156340）

设备

1.细胞培养箱：37℃和5% CO 2 （Thermo，目录号： THM#3427）
2.离心机（Eppendorf，目录号：5810R）
3.生物安全柜（Biobase，目录号：BSC-1500IIB2-X）
4.显微镜（尼康，目录号：Eclipse E200）

程序

A.细胞制备

2的潮湿条件下孵育。从 4 名 RA 患者的膝关节滑膜组织中分离出 RASF 细胞；表1显示了患者的具体信息。 RASF隔离程序如下；细胞提取的简单流程图如图 1 所示。

表1. 患者信息
数字性别年龄（岁）RF（国际单位/毫升）等效串联电阻（毫米/小时）CRP（毫克/升）反共阳性率
1女性3718.62908.718.5
2女性6071.9711334.53.2
3女性45195.68742.96110.4
4女性6661.53110.2233.6
RF ：类风湿因子
ESR：红细胞沉降率
CRP：C反应蛋白
CCP：环瓜氨酸肽

图1.滑膜成纤维细胞提取过程示意图。使用BioRender.com创建。

1.从RA滑膜组织标本上剪下多余的脂肪组织，用无菌生理盐水冲洗滑膜组织直至无明显血迹，选择合适的组织，置于无菌培养皿中，用眼科剪刀剪得尽可能小。
2.加入 5 mL 生理盐水，浸泡组织，然后转移至 15 mL 离心管中。 500 × g离心 5 分钟并弃去上清液。
3.添加 5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 重悬、I 型胶原酶（终浓度 1 mg/mL）、透明质酸酶（终浓度 0.15 mg/mL）和 DNase（终浓度 0.15 mg/mL）。充分混匀，37 ℃消化60~90 min，不时摇动离心管。
4.组织消化后，加入 5 mL 培养基并重悬。静置直至15 mL离心管中剩余的组织块沉底，将上清液转移至另一个15 mL离心管中离心，得到细胞沉淀。
5.用 5 mL 培养基洗涤沉淀，重悬，离心，弃上清。再次添加 4 mL 培养基，并重复重悬离心步骤以收集尽可能多的细胞。
6.用血细胞计数器对收集的细胞进行计数。每25 cm 2的培养瓶中接种400万个细胞。新分离的细胞具有高度多样性。除RASF外，还有淋巴细胞、破骨细胞、巨噬细胞和巨噬细胞样滑膜细胞。因此，初始阶段丰富的细胞密度对于滑膜细胞的生长至关重要。
7.次日将接种细胞的培养瓶置于37℃、5%CO 2细胞培养箱中，观察细胞粘附情况，有无污染。第三天，更换液体并丢弃未粘附在烧瓶底部的其他类型的细胞或死细胞。当细胞汇合度达到90%时传代。状态良好的原代滑膜成纤维细胞如图2所示。

图 2. 类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞原代细胞的预期细胞形态。比例尺： 1μm 。

B.细胞接种

用 PBS 缓冲液彻底清洗 3 次。弃去全部液体后，加入1 mL胰蛋白酶，轻轻移动培养瓶使其均匀，37℃孵育约2 min。观察细胞状况，避免过度消化，影响细胞形态。
1.加入4 mL完全培养基终止反应，用移液器轻轻将细胞从底部分离，将细胞转移至15 mL离心管中，1,000 × g离心5 min收集细胞沉淀，弃上清，加入 1 mL 培养基，充分重悬细胞。
2.根据实验所需的细胞数量，将SW982细胞和RASF细胞接种于6孔板中过夜，并确保它们生长至80%汇合。

C.转染试剂的制备

1.对于 6 孔板中的每个孔，添加 5 μL Lipofectamine TM 3000试剂，并使用移液器在含有 250 μL 无血清 DMEM 培养基的1.5 mL 离心管中充分混合。室温孵育 5 分钟。
2.无血清 DMEM 培养基的离心管中混合。模拟物和抑制剂的序列信息如表2所示。

表 2. miRNA 模拟物和抑制剂序列信息
姓名产品序列（从 5′ 到 3′）
miRNANC模仿者感测 UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
反义ACGUGACACGUUCGGAGAATT
miR-424-5p模仿者感觉 CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA
反义 CAAAACAUGAAUUGCUGCUGUU
miRNANC抑制剂卡瓜瓜瓜瓜瓜瓜卡
miR-424-5p抑制剂UUCAAAACAUGAAUUGCUGCUG
NC：阴性对照

3.将两种混合物混合步骤1 和 2，轻轻混匀 15 次，室温孵育 20 分钟。
4.在上一步的孵育期间准备细胞。用 PBS 清洗 6 孔板中的细胞，并添加 1.5 mL 无血清培养基。转染试剂孵育后，向每孔中加入500 μL上一步混合物，充分混匀，并在CO 2 培养箱中孵育。四十八小时后，用完整的SW982 和 RASF 细胞培养基更换培养基。

D.故障排除

1.TM 3000的温度可能会影响转染效率；因此，与Lipofectamine TM 3000混合时，培养基应保存在室温下。
2.细胞的数量和状态对转染有影响。复苏细胞和原代细胞至少应传至第三代，细胞数量稳定后方可使用。
3.中添加Lipofectamine TM 3000后，混合要轻柔，以免损伤脂质体颗粒，影响转染效率。
4.转染效果取决于细胞状态、转染子浓度、转染试剂、转染过程的操作等。因此，始终需要进行后续转染效率验证的预研究，以确定它们对于每个单独的研究是否有效。我们通常有信心在用 miRNA 模拟物或抑制剂转染 48 小时后验证 miRNA 及其靶基因功能的获得或丧失。

数据分析

使用SPSS 21对数据进行分析。实验数据表示为平均值±标准误平均值（SEM）。分析各组之间的差异使用曼-惠特尼检验。认为p < 0.05 统计上显着（* p < 0.05）。

协议验证

转染效率的验证可以通过检测外源 miRNA 模拟物或抑制剂转染后的细胞内 miRNA 水平来实现。使用 T RIzol 试剂收集细胞裂解液并进行 RT-qPCR以验证转染效率。在我们发表的结果中（Wang et al., 2021），转染模拟物后，miRNA 的表达量可以比之前的细胞内水平增加多达千倍，并且一些 miRNA 的表达量在转染抑制剂后也可以显着降低（图 3））。这表明脂转染方法的成功，该方法简单且重复性高。目标基因的验证是通过蛋白质印迹法实现的，使用 RIPA 缓冲液收集蛋白质裂解物。经过蛋白定量、凝胶电泳、抗体孵育后，得到目的基因表达变化的结果；这部分结果可以参考我们发表的文章（Wang et al., 2021）和图4。

图 3. RT-qPCR 结果显示，转染其模拟物或抑制剂 48 小时后，类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞 (RASF) 和 SW982 细胞系中 miR-424 的 RNA 表达水平。 A、B. 10 nM 模拟物 (A) 或 100 nM 抑制剂 (B) 处理的 RASF 中 miR-424 的表达。 C、D. 10 nM 模拟物 (C) 或 100 nM 抑制剂 (D) 处理的 SW982 细胞中 miR-424 的表达。比例尺：来自四名患者（A 和 B）或来自三个独立细胞实验（C 和 D）的样品的平均值±SEM p < 0.05，*：与阴性对照（NC）相比，使用曼-惠特尼检验。

图 4. 蛋白质印迹结果显示，在 miR-424 模拟物转染 48 小时后，SW982 细胞系中经过验证的 miR-424 靶基因的蛋白表达。 miR-424 模拟物转染后SW982 细胞中DICER1 (A)、CCND1 (B) 和 CCND3 (C) 的蛋白表达。比例尺：来自三个独立细胞实验的平均值±SEM。 p < 0.05，*：与阴性对照 (NC) 相比，使用 Mann-Whitney 检验。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.miRNA 模拟物和抑制剂由该公司合成。使用前配制20 μM储备液，-20 ℃保存。
2.应包括具有 miRNA 的 NC 组。所有实验至少应进行三次。
3.根据我们以往的经验，对于miRNA转染，10nM模拟物的终浓度足以满足大多数miRNA实验的需要；对于抑制剂，100 nM 就可以了。最佳浓度可以通过中试获得。

致谢

感谢国家自然科学基金项目（项目编号：81671629、81701619、81970029、81902249）和陕西省自然科学基金项目（项目编号：2021JQ-024、2018JM7057）。

利益争夺
这些实验程序改编自我们之前在Wang, S. et al., 2021发表的工作。作者声明，不存在可能影响这项工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

参考

巴特尔，DP (2004)。 MicroRNA：基因组学、生物发生、机制和功能。单元格116(2)：281-297。
Bartok, B. 和 Firestein, GS (2010)。成纤维样滑膜细胞：类风湿性关节炎的关键效应细胞。免疫学。启示录233(1)：233–255。
Felgner, PL、Gadek, TR、Holm, M.、Roman, R.、Chan, HW、Wenz, M.、Northrop, JP、Ringold, GM 和 Danielsen, M. (1987)。脂转染：一种高效的脂质介导的 DNA 转染程序。过程。国家。阿卡德。科学。美国84(21)：7413–7417。
Kim, TK 和 Eberwine, JH (2010)。哺乳动物细胞转染：现在和未来。肛门。生物肛门。化学。 397（8）：3173-3178。
Philippe, L.、Alsaleh, G.、Suffert, G.、Meyer, A.、Georgel, P.、Sibilia, J.、Wachsmann, D. 和 Pfeffer, S. (2012)。类风湿成纤维样滑膜细胞中 TLR2 表达受 MicroRNA miR-19 调节。 J.免疫学。 188（1）：454-461。
Trenkmann, M.、Brock, M.、Gay, RE、Michel, BA、Gay, S. 和 Huber, LC (2013)。肿瘤坏死因子 α 诱导的 MicroRNA-18a 通过 NF-κB 信号传导中的反馈环激活类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。关节炎风湿病。 65（4）：916-927。
van der Helm-van Mil, AH 和 Huizinga, TW (2008)。类风湿性关节炎遗传学的进展表明可以将其细分为不同的疾病子集。关节炎研究中心。瑟尔。 10（2）：205。
王S.、徐J.、郭Y.、蔡Y.、任X.、朱W.、耿M.、孟L.、蒋成.、卢S.、等人。（2021）。 MicroRNA-497 的减少及其家族成员 MicroRNA-424 的增加导致类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中多个炎症相关基因的失调。正面。免疫学。 12：e619392。
朱生、潘文、宋X、刘Y、邵X、唐Y、梁D、何D、王H、刘W、等人。（2012）。 microRNA miR-23b 通过靶向 TAB2、TAB3 和 IKK-α 来抑制 IL-17 相关的自身免疫炎症。纳特。医学。 18（7）：1077-1086。