材料与试剂

材料

1.平板或悬浮液中的细胞培养物（此处：从小鼠胚胎干细胞分化而来的神经元）
2.0.45 μm无菌过滤器（Corning，目录号：430514）
3.细胞提升器（Sigma，目录号： SILA0008）
4.1.5 mL 管（Eppendorf，目录号： 022363204）
5.移液器吸头（USA Scientific，目录号：各种）
6.玻璃载玻片（康宁，目录号： 12-553-10）
7.盖玻片（Menzel Gläser，目录号： 630-2118）
8.NU-PAGE 3%–8% 三乙酸盐（ Thermo Fisher，目录号： EA0378）
9.PVDF 膜（Millipore，目录号： IPFL00010）
10.微量移液器（Gilson，目录号：各种）
11.微量离心机（Eppendorf，目录号： 5427R）
12.超声波发生器（ Covaris ，目录号： S220）
13.迷你凝胶罐（ Thermo Fisher，目录号： A25977）
14.电源（Bio - Rad，目录号： 1645050）
15.微型 Trans-Blot 细胞（Bio - Rad，目录号： 1703930）
16.带有溴化乙锭过滤器的荧光成像系统 Gel Doc (Bio - Rad)
17.NIR 成像系统（Odyssey Clx 、 LiCOR Biosciences）
18.4°C 冷藏室
19.摇床（Boekel Scientific，目录号： 260350）

试剂

1.水蒸气_ _
2.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 14190250）
3.管道（Sigma-Aldrich，目录号： P6757）
4.氯化钠（Fisher Scientific，目录号： BP350）
5.MgCl 2水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
6.EDTA（EMD Millipore，目录号： 324503）
7.洋地黄皂苷（EMD Millipore，目录号： 300410）
8.蛋白酶抑制剂（Roche，目录号： 11697498001）
9.NaOH（Sigma-Aldrich，目录号： L4509）
10.台盼蓝（Invitrogen，目录号： 15250061）
11.Igepal （Sigma-Aldrich，目录号： I8896）
12.DC 蛋白定量试剂盒（Bio-Rad，目录号： 5000111）
13.橙色 G（Sigma-Aldrich，目录号： 861286）
14.甘油（Sigma-Aldrich，目录号： G2025）
15.Tris（Sigma-Aldrich，目录号： T6066）
16.DTT（开曼化学公司，目录号： 700416）
17.ATP（Sigma-Aldrich，目录号： A2383）
18.硼酸（Sigma-Aldrich，目录号： B6768）
19.MgCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号： M2670）
20.Tris-HCl pH 7.5（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 15567027）
21.Suc -LLVY-AMC（ Bachem ，目录号： 4011369.0100）
22.十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号： BP166-500）
23.Na 2 CO 3 （Sigma-Aldrich，目录号： S7795）
24.2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号： M6250）
25.甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号： G8898）
26.甲醇（Sigma-Aldrich，目录号： 179337）
27.Tris 缓冲盐水（TBS 20 ×）（VWR，目录号： J640）
28.Tween 20（Sigma-Aldrich，目录号： P7949）
29.TTBS 中的封闭缓冲液（LiCOR Biosciences，目录号： 927-60001）
30.核心蛋白酶体单位（20S），Psma1-7抗体（1:1,000）（Enzo Life Sciences，目录号： BML-PW8195-0100）
31.调节蛋白酶体单位 (26S)，Psmc3 抗体 (1:1,000)（Cell Signaling Technology，目录号： 25430S）
32.小鼠二抗（1:10,000）（LiCOR Biosciences，目录号： 925-32210）
33.兔二抗（1:10,000）（LiCOR Biosciences，目录号： 926-68073）

解决方案

1.4× PIPES 缓冲区（参见配方）
2.细胞质提取缓冲液 (pH 6.8)（参见配方）
3.核提取缓冲液 (pH 6.8)（参见配方）
4.4× 上样缓冲液 (pH 7.3)（参见配方）
5.8× TBE 缓冲液 pH 8.3（参见配方）
6.天然凝胶电泳缓冲液 (pH 8.3)（参见配方）
7.250× ATP/MgCl 2 （参见配方）
8.用于凝胶内蛋白酶体活性测定的反应缓冲液（参见配方）
9.变性缓冲液（参见配方）
10.Tris-甘氨酸转移缓冲液（参见配方）
11.T-TBS（参见食谱）

食谱_

1.4 × PIPES 缓冲区
试剂最终浓度数量
氯化钠400毫米5.8克
管道40毫米3克
1M 氢氧化钠1M足以溶解管道
氯化镁2水合物12.5毫米0.64克
最终体积250毫升
将 NaCl 溶解在 150 mL 的 ddH 2 O 中。将 PIPES 溶解在少量 NaOH 中（从 2 mL 开始，小心地增加，仅在必要时添加）。将 PIPES 溶液与 NaCl 溶液混合。将 MgCl 2水合物添加到混合物中。将最终体积调整至 250 mL。通过 0.45 μm无菌过滤器过滤。储存于 4 °C 或等分并冷冻（用于更长时间储存）。

2.细胞质提取缓冲液 (pH 6.8)
试剂最终浓度数量
4 × PIPES 缓冲区1 ×25毫升
洋地黄皂甙0.015%18.75毫克
乙二胺四乙酸3毫米0.6毫升
蛋白酶抑制剂1 片剂用于 10 mL 缓冲液
最终体积100毫升
将洋地黄皂苷溶解在 10 mL 的 4 × PIPES 缓冲液中。添加剩余的 4 × PIPES 缓冲液、EDTA 和 20 mL ddH 2 O。让混合物在 4 °C下冷却。将 pH 调节至 6.8，并添加 ddH 2 O，使总体积为 100 mL。细胞质提取缓冲液可在 4 °C下保存长达 1 个月。蛋白酶抑制剂应新鲜添加到混合物中。

3.核提取缓冲液（pH 6.8）
试剂最终浓度数量
4 × PIPES 缓冲区1 ×25毫升
伊杰帕尔 0.1%100微升
乙二胺四乙酸3毫米0.6毫升
蛋白酶抑制剂1 片剂用于 10 mL 缓冲液
最终体积100毫升
添加 4 × PIPES 缓冲液、 Igepal 、EDTA 和 20 mL ddH 2 O。让混合物在 4 °C下冷却。将 pH 调节至 6.8，并添加 ddH 2 O，使总体积为 100 mL。核提取缓冲液可在 4 °C下保存长达 1 个月。蛋白酶抑制剂应新鲜添加到混合物中。

4.4 ×上样缓冲液 (pH7.3)
试剂最终浓度数量
橙G0.01%1克
甘油 (87%)43.50%5毫升
Tris（pH 7.5，500 mM）250毫米5毫升
最终卷10毫升
2 O中，最终体积为 10 mL ；缓冲液应保存在 4 °C 。

5.8 × TBE 缓冲液 pH 8.3
试剂最终浓度数量
Tris碱基712毫米86.4克
硼酸712毫米44克
乙二胺四乙酸钠216毫米5.6克
最终体积1升
6.天然凝胶电泳缓冲液 (pH 8.3)
试剂最终浓度数量
8x TBE 缓冲器1 ×100毫升
ATP413微米200毫克
氯化镁2 (1 M)2毫米1.6毫升
数码地面电视 (1 M)0.5毫米400微升
最终体积800毫升
将所有化学品溶解在 600 mL ddH 2 O 中，调节 pH 至 8.3，并用 ddH 2 O完成最终体积为 800 mL。该溶液可提前配制并保存于4 ℃；然而，ATP、MgCl 2和DTT 需要新鲜添加到混合物中。

7.250 × ATP/氯化镁2
试剂最终浓度数量
氯化镁2水合物2.5M1.0165克
ATP250毫米0.3026克
最终体积2毫升
2 O中，最终体积为 2 mL ；缓冲液应保存在-80 °C或新鲜制备。

8.用于凝胶内蛋白酶体活性测定的反应缓冲液
试剂最终浓度数量
Tris（pH 7.5，100 mM）1 ×12.5毫升
250 × ATP/氯化镁21 ×100微升
数码地面电视 (1 M)1毫米25微升
Suc -LLVY-AMC（2 mM，溶解于 DMSO）48μM _600微升
最终卷25毫升
将所有化学品溶解在 25 mL 的 ddH 2 O 中。反应缓冲液可以提前制备并保存在 4 °C。然而，ATP 和 DTT 应新鲜添加到混合物中，而蛋白酶体底物Suc -LLVY-AMC 应在凝胶在反应缓冲液中孵育之前立即添加。

9.变性缓冲液
试剂最终浓度数量
安全数据表2%10克
钠2 CO 366毫米3.5克
β-巯基乙醇1.50%7.5毫升
最终体积500毫升
在通风橱中，将所有化学品溶解在 500 mL 的 ddH 2 O中。

10.Tris-甘氨酸转移缓冲液
试剂最终浓度数量
特里斯48毫米
甘氨酸39毫米
安全数据表1.3毫米
甲醇20%200毫升
最终体积1升
将 Tris 和甘氨酸溶解在 600 mL ddH 2 O 中并调节至pH 8.3。添加 SDS 和甲醇。用 ddH 2 O将体积调整至1 L。转移缓冲液应保存在 4 °C直至使用。

11.TBS
试剂最终浓度数量
20 × TBS1 ×100毫升
吐温200.10%2毫升
最终体积2升
在 1.7 L ddH 2 O 中稀释 10 × TBS ，添加 Tween 20，并用 ddH 2 O调整最终体积为 2 L。

时间考虑

天然蛋白质分级分离：2–3 小时。
天然凝胶电泳：4小时。
活性测定：45 分钟。
转移到膜上并进行免疫印迹：2 天。

软件

1.Image Studio TM采集软件 ( LiCOR Biosciences)
2.斐济ImageJ ( https://imagej.net/software/fiji/ )

程序

A.天然蛋白质分级分离

该方案描述的是在一个 10 厘米培养皿中保存的 600,000 个细胞的一个重复。
1.根据需要维护细胞。在这里，我们按照已发布的方案将细胞保存在 10 厘米培养皿中（Mazzoni 等人，2013 年；An 等人，2019 年）。以下所有步骤都是针对 600,000 个细胞的起始材料开发的。预计细胞的密度/汇合度不会改变细胞内蛋白酶体亚基的可用性。
2.收集当天，从板中吸出介质，并用 5 mL 冰冷的 PBS 清洗板一次。
3.添加 500 μL细胞质提取缓冲液，并使用细胞提升器从平板上刮下细胞。悬浮液应保存在冰上，直至 90%–95% 的细胞裂解。
a.通过使用少量悬浮液、用台盼蓝染色并在光学显微镜下检查来确定细胞裂解。简要地，取10μL细胞悬液，与等体积的台盼蓝溶液混合。轻轻混合以确保染色均匀。让细胞-台盼蓝混合物在室温下孵育 3-5 分钟，并用盖玻片覆盖混合物。在显微镜下检查细胞并区分未染色和染色的蓝色细胞。成功的细胞裂解将因膜破裂而导致细胞染色。我们建议在刮擦细胞后 10-15 分钟通过显微镜评估裂解情况。
b.在我们手中，大约 30 分钟后达到 95% 裂解。预计相似的时间足以实现培养物中其他细胞类型的适当裂解。
4.将裂解的细胞在 4°C 下以 480 × g离心 10 分钟。富含细胞核的白色沉淀将出现在管底部。
5.将上清液（细胞质部分）转移至新管中并速冻。将细胞质部分储存在-80°C直至进一步使用。
6.用 200 μL细胞质提取缓冲液清洗细胞核沉淀 3 次，并在 4 °C 下以 480 × g离心 10 分钟。
7.将沉淀重悬于 50 μL核提取缓冲液中，上下吹打沉淀。
8.将悬浮液置于冰上 30 分钟。 10 分钟后重新悬浮沉淀。
9.在 4°C 下对悬浮液进行超声处理。此处，超声仪被编程为 5% 占空比，三个超声处理周期，每个周期 10 秒，每个周期之间间隔 30 秒。
10.以 6,780 × g离心10 分钟。
11.将上清液（核部分）转移至新管中并速冻。将核部分储存在-80°C直至使用。

B.天然凝胶电泳和活性测定

1.在冰上解冻样品。
2.按照制造商的说明，使用 DC 蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。这是一种与洗涤剂兼容的定量试剂盒。如果使用不同的试剂盒，请确保其与裂解缓冲液中的去污剂兼容。
3.细胞质部分的最终蛋白质浓度为 0.5 μg / μL ，核部分的最终蛋白质浓度为0.2 μg / μL 。
4.将 5 μL 4 ×上样缓冲液添加到每个分数的15 μL中。
5.在 NU-PAGE 中将样品在 150 V 和 4 °C 下在天然凝胶电泳缓冲液中分离 4 小时。运行时间长是由于蛋白酶体亚基尺寸较大。
6.使用摇床将凝胶在反应缓冲液中室温孵育 30 分钟。
a.反应期间保护凝胶避光。
b.正确处理凝胶对于这部分分析的成功至关重要。请查看重要注释以获取有关正确处理的提示。
7.使用 Gel Doc 检测 A360 激发/A460 发射（溴化乙锭滤光片）处的荧光（图 1）。

图 1. 通过 SDS-PAGE/免疫印迹确认诱导脊髓运动神经元中 Psma1-7 和 Psmc3 的分离成功和定位：在用 DMSO (-) 处理的诱导脊髓运动神经元中检测到细胞质或细胞核 Psma1-7 和 Psmc3或注册会计师 (+)。为了确保准确分级，还检测了细胞质标记物突触素 (Syn) 和 α-微管蛋白，以及核标记物LaminA /C (Lam A/C) 作为分级对照。

C.将蛋白质转移至 PVDF 膜并通过免疫印迹进行丰度分析

1.通过在摇床中室温下在变性缓冲液中孵育 10 分钟来使凝胶中的蛋白质变性。
2.在 40 mAV下转移到 TRIS-甘氨酸转移缓冲液中的低背景 PVDF 膜上16 小时。
a.在 20% 甲醇中孵育 5 分钟，激活 PVDF 膜。
b.激活后，使用前将膜和凝胶在摇床上的转移缓冲液中平衡 5 分钟。
3.将膜在封闭缓冲液中室温封闭 1 小时。
4.将膜在封闭缓冲液中与一抗（Psma1-7 和 Psmc3）在 4°C 下孵育过夜。
5.用 T-TBS 洗膜 5 次，每次 10 分钟。
6.将膜与小鼠和兔二抗在 TBS 中室温孵育 1 小时。我们在扫描前使用了二抗，因为两种一抗来自不同的物种。
7.使用凝胶成像系统扫描膜图像。
8.根据制造商的说明，使用 ImageJ 软件量化图像（带密度测定）。将测量值标准化为整个凝胶上的条带强度总和。

数据分析

我们通过 SDS/免疫印迹证实了分离的成功，如图 1 所示。我们检测到 Psma1-7 和 Psmc3 的细胞质或核定位。作为分级对照，我们检测了细胞质标记物突触素 (Syn) 和 α-微管蛋白以及核标记物LaminA /C (Lam A/C)。
nM CPA，蛋白毒性应激）处理分化的脊髓运动神经元 12 小时。我们如上所述制备细胞质和核提取物并测定蛋白酶体活性和丰度。
图 2A 中的第一泳道 (1) 显示来自对照细胞的蛋白酶体亚基，第二泳道 (2) 描述来自用 CPA 处理的细胞的蛋白酶体亚基。带强度表示通过荧光底物的蛋白水解测量的亚基活性。
图2B显示了各自凝胶针对Psmc3和Psma1-7的免疫印迹，这是在如上所述的活性测定之后进行的。
图 2A/B 中的右图显示了量化结果。在实验中，通过五次重复实验，关于应激下蛋白酶体活性和丰度的变化，实现了统计显着性（p 值 < 0.05）。核提取物中20S亚基的活性低于检测限。

图 2. 应激条件下诱导脊髓运动神经元中蛋白酶体活性和颗粒丰度的表征。 A. 用对照 (1) 或应激诱导物 (2) 处理 12 小时的诱导脊髓运动神经元的分级提取物的凝胶内蛋白酶体活性测定。在非变性条件下对蛋白质进行凝胶分离，然后通过底物肽Suc -LLVY-AMC 的蛋白水解来测量不同蛋白酶体颗粒的活性。印迹旁边的图表显示了定量结果。通过计算各个条带的测量值与整个凝胶的所有测量值之和之间的比率，对凝胶中测量的强度进行归一化。 B. 图 2A 中描述的样品的免疫印迹蛋白提取物。在非变性条件下对蛋白质进行凝胶分离，并转移到膜上，使用特异性抗体定量不同蛋白酶体颗粒的丰度：Psmd2（红色）表示单帽和双帽 26S 颗粒，Psma1-7（绿色）表示 20S 颗粒。印迹旁边的图表显示了定量结果。通过计算各个条带的测量值与整个凝胶的所有测量值之和之间的比率，对凝胶中测量的强度进行归一化。

协议验证

该协议的设计和实施是为了评估细胞质和核蛋白酶体活性以及对错误折叠蛋白质应激具有不同敏感性的两种运动神经元的组装。活性和丰度测定是在五个独立实验中的两个生物学重复中进行的。该分析的结果如当前可用预印本的图 7C 和 7D 所示： https://doi.org/10.1101/2022.04.10.487765 （ Petisco Fiore 等人，2022）

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

仅从单个 10 厘米培养皿（重复）中分别为细胞质和核部分提供 5 和 1 μg的蛋白质。蛋白质的量足以进行所描述的蛋白酶体活性和丰度测量。
分级分离的成功应通过 SDS-PAGE/免疫印迹来确认，使用细胞质和核裂解物检测标记。我们使用针对核纤层蛋白 A/C（核标记物）、α-微管蛋白（细胞质标记物）和突触素（神经元细胞质标记物）的特异性抗体。

关键参数和故障排除

1.细胞裂解不充分会降低细胞质和细胞核部分的数量和纯度。
2.轻轻地并定期移液在细胞裂解期间增强质膜破坏。它有助于实现有效的细胞裂解。
3.Igepal 0.1% 用于在实验过程中裂解细胞核，同时避免破坏蛋白质复合物。超过这个浓度可能会导致不希望的复杂破坏。
4.该方案包括新鲜添加的 ATP 和 DTT 补充剂，即使使用前一天准备的缓冲液也是如此。
5.提取物应在冰上解冻，以防止蛋白质复合物分解和蛋白酶体活性丧失。
6.方案中用于活性测定的Suc -LLVY-AMC 应新鲜添加到活性缓冲液中以获得最佳结果。
7.使用的高质量凝胶可确保蛋白质复合物的准确可视化和分析。为了方便和一致性，建议使用预制天然凝胶。
8.当将凝胶转移到透照仪进行成像时，可以使用用于处理软天然凝胶的抹刀来防止凝胶折叠或撕裂。
9.将蒸馏水喷洒到成像板上有助于移动凝胶并防止其在操作过程中粘附和撕裂。

致谢

该协议源自两个已发布协议的改编：DOI:10.1101/ pdb.prot 098582 ( DeCaprio and Kohl, 2020)和 DOI:10.1016/j.xpro.2021.100526 ( Yazgili et al., 2021) 。 CV 感谢美国国立卫生研究院 (R35 GM127089) 和陈·扎克伯格倡议的资助。

利益争夺

作者披露没有利益冲突。

参考

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