材料与试剂

生物材料

CoLoC-seq 在从人Flp-In T-REx 293 细胞（Thermo Fisher Scientific，目录号：R78007 ）分离的线粒体上进行。一套完整的 CoLoC-seq 和模拟 CoLoC-seq 样品需要约 2,500 cm 2的无支原体污染的近汇合细胞（相当于约 3 × 10 8 HEK293 细胞）。要将 CoLoC-seq 应用于其他系统和细胞区室，应凭经验确定起始材料的最佳量。

试剂

EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E4884）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：11814273001）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
牛血清白蛋白，冻干，不含脂肪酸（ Euromedex ，目录号：1035-70-C）
NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：655104）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
去离子甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：S4117）
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS 1 × ）（Sigma-Aldrich，目录号：D5773）
20% 十二烷基硫酸钠（SDS）（Euromedex，目录号：EU-0660-B）
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（Sigma-Aldrich，目录号：D4641）；储存于-20°C
糖原（Sigma-Aldrich，目录号：G8876）； 4℃保存
TBE 10 ×（ Euromedex ，目录号：ET020-C）
尿素（Sigma-Aldrich，目录号 U5378）
40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1）（Carl Roth，目录号：A516.1）； 4℃保存
过硫酸铵（ Euromedex ，目录号：EU0009-B ）
N ， N ， N' ， N'-四甲基乙二胺（TEMED）（ Euromedex ，目录号：50406 ）
溴化乙锭1%（Biosolve BV，目录号：05412341）； 4℃保存
SSC 缓冲液 20 × （Euromedex，目录号：BI-D0623-1L）
Denhardt 溶液 50 × （ Thermo Fisher Scientific，目录号： 750018）；储存于-20°C
TE（Tris-EDTA 缓冲液），pH 7.4 (10 × )（Euromedex，目录号：BI-USD8211-1L）
DNase I（Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0525）；储存于-20°C
RNase A，不含 DNase 和蛋白酶，10 mg/mL（Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0531）；储存于-20°C
SUPERase In RNase 抑制剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM2694）；储存于-20°C
AMPure XP 套件（Beckman Coulter，目录号：A63881）
Bradford测定ROTI Nanoquant（Carl Roth，目录号：K880.1）； 4℃保存
TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：15596026）； 4℃保存
γ-[ 32 P]-ATP（10 Ci/L，3,000 Ci/mmol）（PerkinElmer，目录号：BLU002A100UC）。应在大约1个月内使用（ 32 P半衰期为14.268天）；储存于-20°C
多核苷酸激酶（PNK）和10 ×激酶反应缓冲液A（Promega，目录号：M4101）；储存于-20°C
氯仿（Carl Roth，目录号：6340.4）
异丙醇（Carl Roth，目录号： CP41.1）
乙醇（Dutscher，Carlo Erba，目录号：3086072-CER ）

解决方案

无菌 0.1 M EDTA（参见配方）
无菌 EDTA-DPBS （参见配方）
Tris-HCl 0.1 M，pH 6.7（参见配方）
蔗糖 3.3 M（参见食谱）
山梨醇 3 M（参见食谱）
氯化钠 1 M （参见食谱）
NaOH 6%（参见食谱）
缓冲液 A （参见配方）
缓冲液 B （参见配方）
缓冲液 C （参见配方）
缓冲液 D （参见配方）
缓冲液 E （参见配方）
缓冲液 F （参见配方）
缓冲液 H （参见配方）
RNA 上样缓冲液（参见配方）
RNA 变性聚丙烯酰胺凝胶（参见配方）
过硫酸铵 10% （参见配方）
预杂交缓冲液（参见配方）
杂交缓冲液（参见配方）
洗涤缓冲液（参见配方）
剥离缓冲液（参见配方）
乙醇 80% （参见食谱）
RNase A 在缓冲液 D 中的稀释液（参见配方）
糖原 20 μg/μL （参见食谱）
溴化乙锭 0.0001% （参见配方）

食谱

无菌 0.1 M EDTA（储存于 4 °C）
将 37.2 g EDTA 在 800 mL H 2 O 中搅拌。添加 NaOH 将 pH 调节至 8。用水将溶液稀释至 1 L。通过 0.22 μm 过滤器过滤溶液。
试剂最终浓度数量
乙二胺四乙酸0.1M37.2克
水分子_不适用不适用
氢氧化钠不适用不适用
全部的不适用1 , 000 毫升

室温保存）
试剂最终浓度数量
DPBS (1 × )1 ×9.6克
乙二胺四乙酸 (0.1 M)2.5毫米25毫升
水分子_不适用975 毫升
全部的不适用1,000 毫升

Tris-HCl 0.1 M，pH 6.7 （室温保存）
将 12.11 g Tris 碱在 800 mL H 2 O中搅拌。在通风橱下添加浓HCl，将pH调节至6.7。用水将溶液稀释至 1 L。
试剂最终浓度数量
Tris碱基0.1M12.11克
HCl（浓）不适用不适用
水分子_不适用不适用
全部的不适用1,000 毫升

蔗糖 3.3 M （储存于 4 °C）
试剂最终浓度数量
蔗糖3.3M112.86克
水分子_不适用不适用
全部的不适用100毫升

山梨醇 3 M （短时间高压灭菌；储存于 4 °C）
试剂最终浓度数量
山梨醇3M54.65克
水分子_不适用不适用
全部的不适用100毫升

NaCl 1 M （室温保存）
试剂最终浓度数量
氯化钠1M5.84克
水分子_不适用不适用
全部的不适用100毫升

NaOH 6%（室温保存）
试剂最终浓度数量
氢氧化钠6%0.6克
水分子_不适用10毫升
全部的不适用10毫升

缓冲液 A（4°C 保存）
试剂最终浓度数量
山梨醇 (3 M)0.6M20毫升
Tris-HCl（0.1 M，pH 6.7）10毫米10毫升
水分子_不适用70毫升
全部的不适用100毫升

缓冲液 B（4°C 保存）
试剂最终浓度数量
蔗糖 (3.3 M)1.65米50毫升
Tris-HCl（0.1 M，pH 6.7）10毫米10毫升
水分子_不适用40毫升
全部的不适用100毫升

缓冲液 C（4°C 保存）
试剂最终浓度数量
蔗糖 (3.3 M)0.6M18毫升
Tris-HCl（0.1 M，pH 6.7）10毫米10毫升
水分子_不适用72毫升
全部的不适用100毫升

缓冲液 D（4°C 保存）
试剂最终浓度数量
山梨醇 (3 M)0.6M20毫升
氯化钠 (1 M)200毫米20毫升
乙二胺四乙酸 (0.1 M)2毫米2毫升
Tris-HCl（0.1 M，pH 6.7）10毫米10毫升
水分子_不适用48毫升
全部的不适用100毫升

缓冲液 E（4°C 保存）
试剂最终浓度数量
山梨醇 (3 M)0.6M20毫升
乙二胺四乙酸 (0.1 M)5毫米5毫升
Tris-HCl（0.1 M，pH 6.7）10毫米10毫升
水分子_不适用65毫升
全部的不适用100毫升

缓冲液 F（4°C 保存）
试剂最终浓度数量
山梨醇 (3 M)0.6M20毫升
乙二胺四乙酸 (0.1 M)1毫米1毫升
Tris-HCl（0.1 M，pH 6.7）10毫米10毫升
水分子_不适用69毫升
全部的不适用100毫升

缓冲液 H（4°C 保存）
试剂最终浓度数量
山梨醇 (3 M)0.6M0.2毫升
正十二烷基-β-D-麦芽糖苷1%10毫克
Tris-HCl（0.1 M，pH 6.7）10毫米0.1毫升
水分子_不适用0.7毫升
全部的不适用1毫升

RNA 上样缓冲液
准备无RNase的水，加入少量溴酚蓝晶体，直至溶液颜色变深但仍透明；以 1 mL 等分试样储存在 -20 °C 下。
试剂最终浓度数量
安全数据表 (20%)0.025%0.0125毫升
乙二胺四乙酸(0.1 M)18毫米1.8毫升
去离子甲酰胺不适用8.1875毫升
全部的不适用10毫升

RNA变性聚丙烯酰胺凝胶
使用不含 RNase 的水进行准备。如果尿素沉淀，请储存在 4 °C 下并在使用前预热。
试剂最终浓度数量
TBE 10 ×1 ×10毫升
尿素8M48克
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (19:1)6%15毫升
水分子_不适用不适用
全部的不适用100毫升

过硫酸铵10%（4℃保存1个月）
试剂最终浓度数量
过硫酸铵10%10克
水分子_不适用不适用
全部的不适用100毫升

预杂交缓冲液（室温保存）
试剂最终浓度数量
SSC 20 ×6 ×300毫升
登哈特溶液 50×5 ×100毫升
安全数据表 (20%)0.2%10毫升
水分子_不适用590毫升
全部的不适用1,000 毫升

杂交缓冲液（使用前立即制备）
试剂最终浓度数量
预杂交缓冲液1 ×0.45 ×9毫升
TE 10 ×0.5 ×1毫升
氯化钠 (1 M)0.5M10毫升
全部的不适用20毫升

洗涤缓冲液（室温保存）
试剂最终浓度数量
SSC 20 ×5 ×250毫升
安全数据表 (20%)0.1%5毫升
水分子_不适用745毫升
全部的不适用1,000 毫升

剥离缓冲液（室温保存）
试剂最终浓度数量
SSC 20 ×0.01 ×0.5毫升
安全数据表 (20%)0.1%5毫升
水分子_不适用994.5毫升
全部的不适用1,000 毫升

乙醇 80%
试剂最终浓度数量
乙醇（100%）80%800毫升
水分子_20%200毫升
全部的不适用1,000 毫升

RNase A 在缓冲液 D 中的稀释液（最终体积 200 μL；使用前立即制备并保存在冰上）
要制备 10 μg/mL 的 RNase A 工作溶液，请将 2 μL RNase A (10 mg/mL) 稀释到 1,998 μL 缓冲液 D 中并充分混合。
试剂最终浓度数量缓冲液 D 体积
RNase A 工作溶液 (10 μg/mL)

0.1微克/毫升
0.2微克/毫升
0.6微克/毫升
1.2微克/毫升
2.0微克/毫升
2.6微克/毫升
3.2微克/毫升
4.0微克/毫升
6.0微克/毫升2微升
4微升
12微升
24微升
40微升
52微升
64微升
80微升
120微升198微升
196微升
188微升
176微升
160微升
148微升
136微升
120微升
80微升

糖原 20 μg/μL（等分并储存在 -20 °C）
试剂最终浓度数量
糖原20微克/微升200毫克
水分子_不适用10毫升
全部的不适用10毫升

用无 RNase 的水制备的 0.00001% 溴化乙锭（储存于 4 °C）
试剂最终浓度数量
溴化乙锭1%0.0001%10微升
无RNase水不适用100毫升
全部的不适用100毫升

实验室用品

Stericup Quick Release-GV 无菌真空过滤系统 0.22 µm 孔径（Merck，目录号：S2GVU10RE）
酵母 tRNA 衍生的掺入转录本，不会与人类基因组交叉映射，以实现数据标准化：
5'-GAGAAGUAAGCACUGUAAAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUGCCUUGUUGGCGCAAUCGGUAGCGCGUAUGACUCUUAAUCAUAAGGUUAGGGGGUUCGAGCCCCCUACAGGGCUCCA-3 '
注意：根据生物材料，应使用兼容的掺入转录物，其序列不与所检查生物体的基因组交叉作图。可以购买或通过体外 T7 转录合成掺入转录物（如本例所示）。
针对核酸转移进行优化的 Amersham Hybond-N+ 膜（Cytiva，目录号：RPN203B）
一次性分光光度计比色皿 1.6 mL 半微量型 ClearLine（Dutscher，目录号：030101）
Micro Bio-Spin P-6 色谱柱（Bio-Rad，目录号：7326200）
用于 Northern 印迹杂交的定制 DNA 寡核苷酸探针。 Jeandard 等人列出了用于人类线粒体 CoLoC-seq 的寡核苷酸。 (2023)，表 S1。

设备

微量移液器 PIPETMAN P2，0.2–2 μL（Gilson，目录号：F144054M）
微量移液器 PIPETMAN P20，2–20 μL（Gilson，目录号：F144056M）
微量移液器 PIPETMAN P200，20–200 μL（Gilson，目录号：F144058M）
微量移液器 PIPETMAN P1000，100–1,000 μL（Gilson，目录号：F144059M）
真空抽吸系统（Integra Bioscience VACUSAFE Aspiration System， Fisher Scientific，目录号：11636620）
用于 50 mL 管的冷冻台式离心机（Eppendorf 5810R，Eppendorf，目录号： 5811000015 ）
适用于 2 mL 管的冷冻台式离心机（Eppendorf 5427R，Eppendorf，目录号：5409000010）
冷冻高速离心机（Avanti JE，Beckman Coulter，目录号：369005），配有 F0850 定角铝转子（Beckman Coulter，目录号：364640）
适用于 F0850 转子的带螺帽的聚碳酸酯 50 mL 瓶（Beckman Coulter，目录号：357002）
韦林两速搅拌机（实验室商店，目录号：8010EB）
冷冻超速离心机奥普玛 XPN-100 （Beckman Coulter，目录号：A94469 ），带有摆动铲斗 SW 32 Ti（Beckman Coulter，目录号：369694）
用于摆动铲斗 SW 32 Ti 的顶部开口薄壁聚丙烯管（Beckman Coulter，目录号：326823）
水浴（例如，VWR，目录号：76308-830）
杜恩斯均质机（VWR，目录号： 432-0200）
分光光度计（例如， Eppendorf BioPhotometer 6131， Marshall Scientific，目录号： E-BP6131）
分光光度计 NanoDrop（Thermo Fisher Scientific，NanoDrop 2000，目录号：ND-2000）
块式加热器（例如，Stuart，DD Biolab，目录号：001150）
凝胶电泳室（例如 BT Lab Systems，目录号：BT206）
低电流电源（例如，Consort EV233，Fisher Scientific，目录号：10369312）
凝胶文档系统（例如，EASY Doc Plus，Herolab，目录号：2809300）
湿式转移罐（例如 BT Lab Systems，目录号：BT306）
高电流电源（例如，PowerPac HC、Bio-Rad，目录号：1645052）
用于 RNA 交联的紫外线灯（例如，Hoefer UVC 500 紫外线交联剂，Amersham Life Science，目录号： 80-6222-50）
旋转杂交炉（例如，Problot 12 杂交炉、Labnet，目录号：H1200A-230V）
塑料封口机（例如，手动热封机 SK-SK 210 系列，FALC Instruments，目录号： 638.1430.20）
磷光成像板（例如，VWR，目录号： 28-9564-75）
展示盒（例如，VWR，目录号：29-1755-23）
用于 Phosphorimager 板的光擦除器（例如 InmoClinc Screen X 射线胶片查看器、 MedicalExpo，目录号：16300）
Phosphorimager 扫描仪（例如GE Typhoon Trio Imager、GMI、 SKU： 8149-30-0017 ）
便携式盖革计数器（例如，Mini900 Ratemeter，Thermo Scientific，目录号：MFG017）

软件和数据集

ImageQuant TL（v.7.0，GE Healthcare）
Cutadapt（版本 2.8）（可在https://pypi.org/project/cutadapt/2.8/获取）
READemption（版本 0.4.3）（可在https://reademption.readthedocs.io/en/latest/获取）
人类基因组序列（Genome Reference Consortium Human Build 38 补丁版本 13）
READemption 使用 segemehl 版本 0.2.0-418 作为读取对齐器
Zenodo 上的数据分析管道 ( https://doi.org/10.5281/zenodo.6389451 )
集成基因组浏览器 (v. 9.1.8)（可在https://bioviz.org/获取）
Origin 2021b（v9.8.5.212，OriginLab Corporation）或类似的非线性回归软件

程序

细胞收获和粗分级分离

2烧瓶中培养的 2,500 cm 2贴壁 HEK293 细胞的示例程序）：
使用真空抽吸系统轻轻吸出介质。向每个烧瓶中添加 25 mL 无菌 EDTA-DPBS，并在 37°C 下孵育 20 分钟。
用手轻轻敲打烧瓶，以促进细胞脱离。将细胞悬浮液收集到六个 50 mL 管中。
为了收集最多的细胞，将溶液从一个烧瓶转移到另一个烧瓶，用 25 mL 的 EDTA-DPBS 冲洗烧瓶。将获得的细胞悬浮液分配到上一步中的六个半填充的 50 mL 管中。
室温下以 600 × g离心 10 分钟，沉淀细胞。丢弃上清液。
在室温下将 15 mL 的无菌 DPBS 添加到每个管中，并将细胞悬浮液合并到两个 50 mL 管中。
室温下以 600 × g离心 10 分钟，沉淀细胞。丢弃上清液。
粗线粒体的制备（所有程序均在冰上用预冷的溶液和管进行）：
将细胞重悬于 30 mL 缓冲液 A 中。
用预冷的实验室搅拌机高速破碎细胞 3 次，每次 15 秒，间隔 1 分钟，以防止过热。将匀浆放入 50 mL 管中。
在冷冻台式离心机中，在 4 °C 下以 1,000 × g低速离心3 分钟，去除细胞碎片和细胞核。将上清液转移到新的 50 mL 管中。
重复 A2c 中描述的过程两次。
注意：细胞碎片/细胞核沉淀很容易脱落和分散；应非常小心地移液以限制这种不良污染。
将上清液转移至带螺帽的聚碳酸酯 50 mL 瓶中。通过在冷冻高速离心机中在 4°C 下以 21,000 × g离心30 分钟沉淀粗线粒体。
将形成褐色颗粒。小心地吸出上清液。
小心但彻底地将线粒体沉淀重悬于 8 mL 缓冲液 A 中，并分成四份 2 mL 部分。
注意：重要的是重新悬浮粗线粒体沉淀并获得均匀的悬浮液。但是，不要过度，以防止线粒体裂解。
在 SW 32 Ti 离心管中制备四个两垫蔗糖梯度。首先，将 10 mL 缓冲液 B 放入管中。然后，使用柔软、平滑的移液器沿着管壁在第一个垫子顶部小心地缓慢地分层 15 mL 缓冲液 C。避免扰动下部坐垫。
小心地将粗线粒体的每 2 mL 部分加载到两垫梯度上。
在冷冻超速离心机中离心 Optima XPN-100 ，配备吊桶式 SW 32 Ti 转子，在 45,000 × g 、4 °C 下运行 1 小时。
用移液器收集含有线粒体的混浊间相。
× g沉淀线粒体 30 分钟。
小心地吸出上清液。
轻轻但彻底地将线粒体沉淀重悬于 800 μL 缓冲液 A 中。关键：线粒体的悬浮液应该是均匀的。保存 500 μL 悬浮液用于 CoLoC-seq 实验（B 部分），并保留另外 300 μL 用于模拟 CoLoC-seq 实验（D 部分）。将它们放在冰上。

CoLoC程序

除非另有说明，所有程序均在 4 °C 下使用预冷溶液和试管进行；所有离心均在 2 mL 管的冷冻台式离心机中进行。
通过 Bradford 测定测量 CoLoC-seq 实验样品中的蛋白质浓度。
注意：分光光度计应按照制造商的说明针对 Bradford 测定进行校准。为此，通常使用一系列含有 1-10 μg 蛋白质的牛血清白蛋白溶液。
将 2 μL 线粒体悬浮液溶解在 40 μL 6% NaOH 中。对于空白，使用 2 μL 缓冲液 A。
添加 760 μL MilliQ 水并充分混合。
添加 200 μL Bradford 溶液，充分混合，并将悬浮液转移至一次性塑料分光光度计比色皿中。
室温孵育 60 s 后，在 595 nm 处读取空白 OD。然后在相同波长下读取线粒体蛋白样品OD，并利用标准曲线确定其蛋白浓度。从 2,500 cm 2几乎汇合的 HEK293 细胞中，通常可以获得 5–10 mg 的粗线粒体。
使用缓冲液 A 将线粒体悬浮液调整至每毫升 1.6 毫克蛋白质。
将所得线粒体悬浮液分成一系列相同的 80 μL 样品。十个样本必须足以创建信息丰富的 RNA 消耗曲线。
在缓冲液 D 中制备两个系列的 80 μL RNase A 稀释液，浓度范围为 0 至 6 μg/mL（例如，0、0.1、0.2、0.6、1.2、2.0、2.6、3.2、4.0 和 6.0 μg/mL）。将一个系列用于 CoLoC，另一个系列用于模拟 CoLoC 程序。
在 25°C 水浴上预热 RNase A 稀释液 1 分钟。
将 80 μL 线粒体样品与相应的 80 μL RNase A 稀释液混合，并在 25°C 水浴上孵育 10 分钟。
用冰冷的缓冲液 E 将反应稀释至 1.6 mL。
在 4 °C 下以 16,000 × g离心20 分钟。
将沉淀彻底重悬于 100 μL 缓冲液 F 中。

RNA提取

注意： RNA 提取应在通风橱中进行，并采取个人防护措施。
添加 1 mL TRIzol 并摇动样品 10 秒（不要涡旋）。暂停点：一旦将 TRIzol 添加到样品中，即可将其保存在 -80 °C 下；否则，进行步骤C2。
注： TRIzol保存于 2–25 ° C；但是，使用前应将其预热至室温。
将样品在室温下孵育 5 分钟。
添加 0.2 mL 氯仿并牢固盖住管子。
用手用力摇动管子 15 秒。
室温孵育 3 分钟。
将样品在 4°C 下以 14,000 × g离心 15 分钟。
将管倾斜至约 45°，然后用 P200 微量移液器将溶液移出，小心地将含有 RNA 的上层水相转移至新管中。关键：尽可能完全吸收水相，但避免接触含蛋白质的界面。 RNA 样品被蛋白质污染可能会导致 RNA 质量低下和/或人为降解。
向样品中添加 2 μL 20 μg/μL 糖原，以促进 RNA 沉淀。
向样品中添加 0.5 mL 异丙醇并充分混合。
让 RNA 在 -20 °C下沉淀 1小时。暂停点：样品可保存在- 80 °C。
× g离心 4°C 20 分钟。小心地将上清液倒入干净的管中。
注意：RNA 颗粒有时不能很好地粘附在管壁上。将上清液倒入另一管中可防止沉淀损失；如果需要，只需将带有漂浮沉淀的上清液转移回并重复离心即可。
用 0.5 mL 80% 乙醇清洗沉淀。
× g离心 4°C 下10 分钟。如前所述倒出上清液。
用 0.5 mL 的 100% 乙醇清洗沉淀。
× g离心 4°C 下10 分钟。
如前所述，倒出上清液。将管子在工作台上打开 5-10 分钟，干燥颗粒。
将 RNA 完全溶解在 45 μL 无 RNase 水中。暂停点：分离的 RNA 样品可保存在- 80 °C。
将提取的 RNA 的每个样本与 90 ng 的掺入转录物混合，以实现后续数据标准化。
向每个样品中添加 5 μL 10× DNase I 反应缓冲液、1 U DNase I 和 20 U SUPERase In。 37°C 孵育 30 分钟以消化残留 DNA。
使用 TRIzol 重新提取 RNA，如步骤 C1–C7 中所述。将其沉淀，如步骤 C9–C16 所示。
注意：不需要进一步添加糖原，因为之前添加的糖原在提取过程中与 RNA 分开。将 RNA 沉淀重新溶解在20 μL 无 RNase 水中。
使用 Nano Drop 测量每个样品中的 RNA 浓度。预期 RNA 浓度在 50–200 ng/μL 范围内。暂停点： RNA 样品可保存在- 80 °C。

模拟 CoLoC 程序

将步骤 A2n 中保留的 300 μL 粗线粒体提取物与 300 μL 冰冷缓冲液 H 混合。
在小型杜恩斯匀浆器中用 50 次冲程裂解冰上的线粒体。
× g离心 20 分钟以清除裂解物。将上清液转移至新管中。
注意：剩余的沉淀必须相对较小，上清液必须为黄色至棕色，表明线粒体内容物溶解良好。如果沉淀仍然很大且上清液无色，则添加更多缓冲液 H 重复裂解。
重复步骤 D3 以除去任何剩余的不溶物质。
通过 Bradford 测定法测量澄清裂解液中的蛋白质浓度，如步骤 B1 中所述。
用冰冷的缓冲液 A 将裂解液调整至蛋白质浓度为 1.6 mg/mL。
将所得溶液分装在 2 mL 管中的一系列相同的 80 μL 样品中。
以与常规 CoLoC 程序相同的方式进行 RNase 处理（步骤 B4-B6）。
将反应物在 4°C 下以 16,000 × g离心 40 分钟。
添加 1.44 mL TRIzol。暂停点：样品可保存在-80°C。否则，进行到步骤D11。
将样品在室温下孵育 5 分钟。添加 320 μL 氯仿并提取 RNA，如步骤 C4–C21 中所述。

北方印迹

注意：在专门配备的实验室中使用放射性材料时，请使用个人防护装置。
注意：虽然此处描述的 Northern 印迹协议基于放射性探针，但也存在可行的非放射性替代品，例如 irNorthern，使用近红外荧光（Miller 等人，2018）和地高辛标记探针，利用 Western-像化学发光检测（Höltke et al., 1992）。
取 1 μg 0 RNA 样品（用 0 μg/mL RNase A 处理）。取系列中所有剩余样品的相同体积。（例如，如果0 号样品的 RNA 浓度为 200 ng/μL，则应从该系列中的每个样品中取出 5 μL，与其他样品的 RNA 浓度无关。）（注：样品中 RNA 产量自然会降低用较高的 RNase A 浓度进行处理。保持相同的体积分数可以确保系列中所有样品的正确剂量。测量掺入 RNA 的水平将进一步确保样品上样量相等。）将 RNA 按 1:1（按体积）与RNA 上样缓冲液。注意： RNA 加载缓冲液含有甲酰胺，应在引擎盖下操作。
通过添加 1/100 体积的 10% 过硫酸铵和 1/1,000 体积的 TEMED，聚合凝胶溶液，制备大（15–20 厘米）和厚（1.5 毫米）6% RNA 变性聚丙烯酰胺凝胶。
在块加热器中将样品在 95°C 下变性 5 分钟。
将凝胶槽安装到电泳槽中，加入足量的1 × TBE缓冲液。
在加载样品之前，用 P1000 移液器用力移液，彻底清洗口袋中的尿素 10 次。
将样品放在工作台上 1 分钟，并在最后一次清洗凝胶上的口袋后，使用带有细长尖端的平滑移液器立即将其装入。
注意：重要的是，将样品牢固且快速地装载到孔的最底部，避免喷射和气泡。
关闭腔室并以 10 V/cm 和 30 mA 运行凝胶，直到溴酚蓝距底部约 3 cm。
小心地拆开三明治。将凝胶在 200 mL 0.0001% 溴化乙锭中染色 5 分钟。借助合适的基于紫外线的凝胶记录系统，可视化乙锭荧光并记录生成的图像。
注意：尽量减少凝胶在紫外线下的暴露，以避免 RNA 交联。
湿式转移槽制造商的说明组装 Northern blot 三明治。例如，使用三张 Whatman 纸，其尺寸与凝胶的尺寸相匹配。用 0.5 × TBE润湿它们，然后将它们一个接一个地涂抹在盒式磁带阳极 (+) 侧的海绵顶部。每片完成后，使用滚筒轻轻地去除三明治中的气泡。然后，在 Whatman 片上应用用于核酸转移的 Hybond-N+ 膜（在 0.5 × TBE 中润湿）。然后，小心地将凝胶放在膜上，并用另外三张湿润的 Whatman 纸覆盖它。关闭三明治。
将盒式磁带放入装有冷的、新鲜制备的TBE 0.5 × 缓冲液的相应湿转移室中，并在冷室中以 75 V 和高达 3 A 的电压进行转移 1.5 小时，并轻轻磁力搅拌。
注意：虽然 1.5 小时通常足以完成完整转移，但根据实验者的方便，此步骤可以延长至 3 小时。
拆开三明治并将膜放在一张吸水纸上风干。在Hoefer UVC 500 紫外线交联剂中将 RNA 与膜交联 3 分钟。暂停点：干燥的膜可在 4 °C 下保存。
将膜置于杂交玻璃管中，加入 20 mL 预杂交缓冲液，并在缓慢旋转的杂交炉中于 65 °C 孵育 30 分钟。确保膜在试管中均匀展开，并且不会自行折叠（如果发生这种情况，只需翻转试管），并且所有进行杂交的区域都处于最大程度相同的条件，并均匀地覆盖有液体。
用杂交缓冲液替换预杂交缓冲液，并添加 3–5 μL 纯化的标记探针。
注意：对于 5′-[ 32 P]-寡核苷酸标记，请参见 F 部分。
将膜与探针在 42°C 下孵育至少 2 小时（通常是一天或过夜），并在杂交炉中连续旋转。
注意：如果探测的转录物丰度较低，可以增加探针的量。如果探针较长或高度结构化，则应在将其添加到杂交缓冲液之前将其变性并置于冰上，如步骤 F1 中所述。如果探针很长（> 40 nt），建议将孵育温度提高至 50–60 °C，以避免非特异性杂交。可以针对每个寡核苷酸单独调整最佳杂交温度，42°C 对于大多数探针来说表现良好。
要清洗印迹，将杂交混合物丢弃到专用的放射性废物容器中，添加 20 mL 的清洗缓冲液，并在相同温度下将管在杂交炉中旋转 15 分钟。注意：请勿将放射性溶液丢弃在水槽中。
将洗涤缓冲液丢弃在专用的放射性废物容器中。从玻璃管上取下膜。
将膜放在长凳上的一张吸水纸上晾干。用塑料薄膜将其密封。
使用适当盒中的磷成像板将膜暴露过夜（或更长，长达一周，如果信号预计较弱）。仅当信号非常强（可使用便携式计数器测量）并且很快饱和时才需要较短的暴露。
使用适当的仪器设置扫描 Typhoon 或类似设备上的磷光成像仪板。
用橡皮擦擦除板上的残留信号。
注意：还建议在曝光前立即对磷成像板进行漂白（步骤 E18）以减少背景。
要移除先前的探针以进行进一步杂交，请在杂交炉的玻璃管中将膜在 20-30 mL 剥离缓冲液中在 63-65 °C 下旋转 30 分钟。如果探针很长和/或信号很强，则用过量的剥离缓冲液在 80°C 水浴中摇动膜 30 分钟，将其去除。然后，从步骤E13开始进行下一个杂交。

寡核苷酸标记

注意：在专门配备的实验室中使用放射性材料时，请使用个人防护装置。
通过混合 13 μL 水、1 μL 10 μM 待标记 DNA 寡核苷酸溶液、2 μL 10× PNK 缓冲液、3 μL [ 32 P]-γ-ATP 和 1 μL，制备 20 μL标记反应的PNK。
注意：如果探测的转录物非常丰富，可以取 1 μL [ 32 P]-γ-ATP 和 15 μL 水代替（其余混合物相同）。如果探针很长（> 40 nt）或高度结构化，则将13 μL 水和 1 μL 10 μM DNA 寡核苷酸溶液混合，并在 95 °C 下变性 1 分钟，然后立即置于冰上 1 分钟。分钟并快速添加标签混合物的剩余成分，如上所述。这通常会提高标记效率。
将反应混合物在 37°C 孵育 30 分钟至 1 小时。注意：用有机玻璃屏蔽加热块，以保护您自己和他人免受放射性照射。
寡核苷酸纯化：
短暂涡旋 Micro Bio-spin P-6 色谱柱。
摇匀液滴，打开底部塞子，将色谱柱插入相应的收集管中。
打开上盖，再次关闭以排出气泡，然后再次打开。
在工作台上让柱中的液体通过重力流滴出 3-4 分钟。
将柱在台式离心机中于室温下以1,000 × g离心 2 分钟。
丢弃收集管。
小心地将标记溶液涂在柱上，不要接触树脂，并将其插入干净的 1.5 mL 收集管中。
在台式离心机中于室温下以 1,000 × g离心 4 分钟。通常应获得大约 20 μL 干净的标记探针。关键：根据供应商的不同，[ 32 P]-γ-ATP 溶液有时含有着色剂以方便追踪。这个应该留在专栏上。如果洗脱液仍然有色，请用另一根色谱柱重复该过程。
使用便携式计数器测量探针溶液：通常应超过刻度并发出蜂鸣声。
注意：将标记的寡核苷酸储存在-20°C 的放射性实验室的专用冰箱中。每次使用前，用便携式计数器验证探头是否仍具有足够的放射性。

文库制备和 RNA 测序

注：cDNA 文库制备和 RNA-seq 可以外包。在Jeandard等人中。 (2023)，图 S2显示了确保完整转录本选择性测序的关键文库制备步骤，简要总结如下。
用 RNA 5'-焦磷酸水解酶去除帽子。
5'-适配器连接到 5'-磷酸化末端。
3'-适配器连接到 3'-羟基末端。
3'-适配器退火引物进行第一链 cDNA 合成。
使用高保真 DNA 聚合酶和带条形码的 TruSeq 引物 PCR 扩增所得 cDNA（15 个循环）。
使用 AMPure XP 试剂盒纯化 cDNA。
进行 cDNA 片段化和末端修复，然后进行另一轮接头连接和 PCR 扩增。
等摩尔汇集 cDNA 样品，并在琼脂糖凝胶上进行 10-220 nt 范围内的大小选择（不包括侧翼序列）。
在 Illumina NextSeq 500 仪器（75 nt 单端读数）或类似仪器上对池进行测序。
注意：虽然片段化步骤可能会破坏协议的链特异性，但我们的映射结果（Jeandard 等人，2023）表明第一个 5'-适配器连接（步骤 G2）在很大程度上决定了读数的搁浅性，这允许明确的转录分配和量化。还可以实施其他强制保存链信息的策略（JZ Levin 等，2010；Dar 等，2016）。

数据分析

乙锭染色凝胶和 Northern 印迹的分析。这些步骤的结果有助于评估 RNA 样品的质量并决定其是否适合后续文库制备（图 2）。每个样品中全尺寸转录物的 Northern 印迹信号通过 ImageQuant TL 或类似的密度测定软件进行分析，并通过同一样品中掺入 RNA 的信号进行标准化。这使得能够在 RNase A 浓度梯度上直接测量完整的转录物水平。行为良好、信息丰富的 CoLoC/Mock CoLoC 系列：
包含至少 9-10 个没有人为降解迹象的样本（非特异性、不规则的 RNA 降解有时表现为涂片或随机条带的出现），
0个样品（用 0 μg/mL RNase A 处理）中显示出全尺寸转录物的强大信号，这允许可靠地测量感兴趣的 RNA 的起始水平，
随着 RNase 浓度的增加，至少一些探测的全尺寸转录物具有单调递减的模式，表明所选的 RNase 浓度范围提供了足够的活性和分辨率来绘制信息丰富的消化动力学。
注意：我们强烈建议探测更广泛的转录本，这些转录本的大小（50-1,500 nt）、结构（松散结构与紧密折叠）和定位不同，包括真正的驻留 RNA 和一些丰富的污染物。如果它们的行为符合 CoLoC 模型的预期（污染物逐渐消失；居民趋于稳定），通常很好地表明此类样本可以用于通过 RNA-seq 进行全基因组分析。

图 2. 根据溴化乙锭染色和 Northern blot 数据评估 CoLoC 样品的质量。答：这种溴化乙锭染色的凝胶显示了一系列表现良好的 CoLoC样品的示例。添加 RNase A 会逐渐引起大量 RNA 降解，随着 RNase 浓度的增加，这种降解变得更加明显。 B. _这种溴化乙锭染色的凝胶提供了一个失败实验的例子：添加 RNase A 对大体积 RNA 几乎没有影响；事实证明，RNase 活性不足以产生有意义的消化动力学。 C. 这些 Northern 印迹说明了 CoLoC 实验的两个成功结果。上图显示了 RNase 抗性转录本：其水平在整个 RNase 浓度梯度中保持相对不变。下图为 RNase 敏感 RNA，随着 RNase 浓度的增加而逐渐被消化。 D. 这些 Northern 印迹显示了两个不太成功的实验的例子。在上图中，转录水平以模糊的、实际上是随机的模式演变，阻止了任何合理的动力学模型的拟合。在下图中， 0样本中的信号太低，无法可靠地测量。因此，人们无法确定该 RNA 的起始水平并可靠地缩放其分布。

Jeandard 等人的材料和方法中描述了 RNA-seq 数据处理的重要步骤。（2023）。简而言之，使用 cutadapt 2.8 版（Martin，2011）对测序读数进行预处理，以修剪接头序列。使用 READemption 0.4.3 版（Forstner et al., 2014）进行读段比对和基因特征量化，并使用segemehl 0.2.0-418 版（Otto et al., 2014）作为读段比对器。所有文库均与从 RefSeq (O'Leary et al., 2016)检索的人类基因组（Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 13）进行比对。用于对齐、覆盖计算和特征量化的参数可以在 Zenodo ( https://doi.org/10.5281/zenodo.6389451 )存放的脚本中找到。重复基因的条目被复合，并且它们的读数被总结。对所有0 个样品应用 30 次读数的截止值，以确保可靠的初始水平测量。每个文库中的读数计数通过映射到掺入 RNA 的相应读数数进行标准化，如 Northern 印迹所述。读取分布可以在 Integrated Genome Browser (v. 9.1.8)、Integrative Genomics Viewer 或其他类似软件中可视化。由于文库制备策略的特殊性，读数通常聚集在转录本的 5 '端。相比之下，如果我们发现某个 mRNA 或 lncRNA 编码位点的绝大多数读数与嵌入的 tRNA、snRNA、7SL、5S rRNA 或 mtDNA 样 (NUMT) 序列（通常在内含子），我们将此类基因作为明显的交叉作图假象排除在分析之外。
从 Northern blot 或 RNA-seq 获得的定量数据可以使用 Jeandard 等人详细描述的动力学模型来推断 RNase A 消化转录物的速率以及不受核酸酶保护的非反应池的相对大小。（2022）材料与方法：

f(A)=(1-P_0 ) e^(-〖k^'〗_i A)+P_0(1)

其中f ( A ) 是用A μg/mL RNase A处理后剩余的第i个转录本的相对比例， P 0是第 i个转录本的初始受保护比例（即第 i个转录本池中被保护的部分） RNase A 无法获得（在 0 μg/mL RNase A 下测量）， k' i是第 i个转录物的有效消化速率常数。由于f ( A ) 以相对单位表示，因此起始转录水平（ 0 个样本）必须标准化为 1，并且该系列的其余样本必须相应地缩放。为了将反应模型拟合到数据中，我们在 Origin 2021b 中使用了定制的非线性回归函数，但也可以使用任何其他类似的软件。注意：不要为了使用线性回归而对方程 1 进行线性化！这种方法具有误导性，因为它会导致错误建模，从而导致过度乐观，或者相反，输出统计数据异常糟糕。非线性回归软件现在已广泛使用并且非常直观。 Motulsky (2010)中提供了非线性回归和相关主题的良好通用入门读物。
首先尝试拟合完整模型（Jeandard 等人，2023 年称为模型 1 ），该模型具有两个参数：有效消化速率常数k'和免受消化的 RNA 初始比例P 0 。自然地将k'限制为非负 ( k' ≥ 0) 并将P 0限制在 [0,1] 范围内是有用的。如果软件有这样的选项的话还建议指定初始P 0估计转录物的最低测量水平（通常在用最高 RNase 浓度处理的样品中观察到）。这大大加快了拟合速度，并增加了拟合收敛于反映系统实际状态的具有生化意义的参数组合的机会。
可能有多种回归结果（图 3）。在成功的实验中，绝大多数转录本产生收敛拟合，即，已经达到了残差平方和的某个预先指定的水平。这意味着对于大多数动力学，可以可靠地估计k'和P 0 （图 3A）。如果情况并非如此，回归软件会报告不收敛拟合（图 3B），这可能是由于数据质量低（点过于分散并且没有形成任何明显的模式）或因为模型1太复杂了。不幸的是，在第一种情况下，该特定转录本的数据无法使用。在第二种情况下，拟合一个更简单的嵌套模型可能会挽救分析（请参阅下面对此模型的讨论）：

f(A)=e^(-〖k^'〗_i A)(2)

人们应该注意并正确解释与每次拟合相关的三组统计数据。第一个是决定系数 R 2 。当R2 _ = 1，拟合完美：模型遍历了每个数据点。当R 2 = 0时，模型实际上是一条水平直线。（在非线性回归中， R 2也可能为负，这意味着模型对数据的拟合效果比水平线更差。这种情况在 CoLoC-seq 中非常罕见。请参见例如图 3B。）注意：认为低R 2意味着模型拟合差是一种常见的误解！拟合的质量只能通过看残差来评估，如果回归软件说拟合收敛，则意味着残差足够小。因此，拟合实际上可以收敛于水平线 ( R 2 = 0)，作为拟合数据的最佳模型（图 3C）。这种情况对于驻留或RNase 抗性转录本来说是典型的：它们的水平不受 RNase 浓度增加的影响，并且在随机误差的范围内保持恒定（即，图形是水平线）。

图 3. CoLoC-seq 数据的现实示例及其在Origin 2021b中执行的非线性回归分析。 A. 表现良好的系列显示典型的 RNase 敏感转录本。 P 0接近于0，不显着； k'较高且显着。相关性较低，表明P 0和k'是相互独立估计的； R 2高；拟合收敛。 B. 失败系列示例：数据点过于分散；结果，拟合没有收敛。 C. 这个成功的系列显示了受 RNase 保护的转录本的典型行为：除了几个异常值外，数据点与P 0 ≈ 1 的水平线接近对齐。k' 不显着，表明没有明显的降解这段文字记录的发生。 R 2接近0（即水平线），但拟合收敛得很好。 D. 这个表现良好的系列显示了部分受 RNase 保护的转录本。 P 0和k'均显着非零，表明该RNA 的群体在一定程度上被消化并稳定在0.224 的水平（即，估计该转录物池的22.4% 受到RNase 的保护）。 E. 将模型 1（实线）拟合到该序列中会导致高度纠缠且不可靠的P 0和k'估计（相关性 0.729），表明这两个变量显着共线，并且模型不必要地复杂。拟合更简单的模型 2（没有P 0参数；虚线）可以更可靠地估计k' 。请注意，这两个模型产生的拟合几乎没有区别；然而，模型 2 更加简洁，这解释了它在估计k'方面的成功。参见 Jeandard 等人。 (2023)，表 S2 了解更多示例。

第二组统计数据涉及参数的最佳拟合值和相关的不确定性度量。主要关注的参数是P 0 。当P 0 ≈ 0 时，第i个 RNA没有相当大的保护池，这意味着它完全参与反应（图 3A）。因此，在 CoLoC-seq 设置下，这样的 RNA 是一种常规的、可降解的污染物。我们在操作上认为所有P 0 < 0.1 的转录本都是潜在的污染物（参见 Jeandard 等人，2023 年的图 3C）。相比之下，当P 0相当大时（ P 0 > 0.1，图 3D），第i个RNA的很大一部分（> 10%）不参与反应，即，它以某种方式受到 RNase A 的保护（使用P 0 = 1 表示 100% 的转录本受到保护）。具体保护程度取决于 CoLoC-seq 与模拟 CoLoC-seq 实验的结果。如果转录本在 CoLoC-seq 中显示高 P 0，但在细胞器膜已溶解的模拟 CoLoC-seq 中却没有，则可以将此视为该转录本池真正存在于细胞器内部的证据，并且其保护是应有的到膜。相比之下，如果 CoLoC-seq 和 Mock CoLoC-seq 都返回高P 0值，则意味着相关转录本本质上对 RNase A 具有抗性，并且其保护与细胞器膜无关。正如 Jeandard 等人的几个例子所讨论的。（2023），这样的成绩单很可能是误报。
k'的最佳拟合值也可能令人感兴趣。例如，当k' ≈ 0（图 3C）时，这意味着所讨论的转录本实际上不会发生退化，并且初始模型 1 退化为简单的模型 3，即一条水平线：

f ( A ) = 1 ( 3)

最佳拟合值应与随附的不确定性统计数据一起解释。这些通常以标准误差( SE ) 或更方便的置信区间( CI )的形式返回。窄SE或CI意味着相应的参数（ P 0或k' ）被精确估计。重要的是，当P 0的CI包括0时，这意味着P 0与0没有显着差异，即，没有强有力的证据表明该转录本存在受保护池。当k'的 CI包括 0 时，意味着消化率不显着，没有强有力的证据表明 RNase A 确实切割该 RNA（即转录物受到保护）。在 CoLoC-seq 设置下，常规可降解污染物通常显示出较低的P 0值（CI 包括 0）和相对较高的k'值（CI 远离 0）（图 3A）。相比之下，受保护的转录本具有相对较高的P 0值，CI 远离 0；它们的k'值可能会有所不同，具体取决于可用于降解的第 i个 RNA的比例（图 3C 和 3D）。
参数的最佳拟合值通常伴随着传达相似信息的P值（原假设是参数的真实值为 0）。低P值表明该参数可能不为零。在 CoLoC-seq 设置下，可降解污染物通常显示P 0的高P值和k'的低P值（图 3A）。相比之下，驻留转录本通常应具有较低的P 0值（图 3C、D）。高P值（且 CI 包括 0）意味着相应的参数没有用处，即完整的模型 1 可以简化为嵌套模型 2（简单的伪一阶衰减）或模型 3（无衰减））。
回归统计的最后一部分是参数之间的依赖性，这一点非常重要。依赖性是估计参数之间的纠缠程度。在某些情况下，特别是 RNase 介导的消化非常缓慢甚至不存在的情况下， P 0和k'变得显着共线，并且回归软件很难单独拟合它们，因为它们中的任何一个的微小变化都会产生几乎相同的结果（图 3E ）。在Jeandard等人中。 (2023)，我们任意使用 0.3 的依赖性截止值，高于该值我们认为P 0和k'纠缠得太深，无法谈论它们的独立拟合。将 CoLoC-seq 应用于其他系统时可以检查此阈值。就像上面讨论的不确定性参数一样，高度依赖性意味着模型 1 不必要地复杂，必须删除其中一个参数。
R 2的讨论），因此只能从模型中省略P 0 ，从而产生模型 2。因此，如果使用完整的模型 1，则拟合不会不收敛，或者估计参数之一不显着，或者参数之间存在很强的相互依赖性，应该尝试将更简单的模型2拟合到数据中。这通常有助于保存大多数剩余转录本的概况以供分析，尤其是那些具有高水平的 RNase A 保护的转录本（即 CoLoC-seq 最感兴趣的转录本）。模型 2 只有一个显式参数k' 。对此回归结果的解释遵循与模型 1 相同的推理，高显着k'对应于可降解转录本，而低不显着k'表示保护（可以为此类转录本分配标称P 0为 1）。决策总结如表 1 所示。
我们建议对 CoLoC-seq 和模拟 CoLoC-seq 至少使用两个生物重复。如果重复项彼此非常相似，则将它们组合起来进行模型拟合是有意义的，从而提高回归的功效和精度，同时保留有关原始样本的生物变异性的信息。重复的相似性可以在几个层面上进行评估：(i) 通过绘制相同 RNase 浓度下不同重复的相同转录本的读数计数，或 (ii) 通过分别为每个重复拟合模型 1 并将 P 绘制在一起来自不同重复的0值（参见 Jeandard 等人，2023 年的图 S6 示例）。后者的测试更为严格。

协议验证

CoLoC-seq在经过充分研究的人胚胎肾 293 (HEK293) 细胞线粒体转录组上的可行性和性能( Jeandard et al., 2023) 。为此，通过 Northern blotting 和 RNA-seq 分析了CoLoC-seq和模拟CoLoC-seq样品的两个生物重复系列。重复数据彼此非常相似，并产生高度相关的P 0值（ Jeandard等人，2023 年的图 S6），证实了方法内的重现性。 RNA 水平和从 RNA- seq和 Northern blotting 测量中获得的拟合P 0值也表现出极好的一致性（ Jeandard等人，2023中的图 2 和图 S5 ），表明CoLoC-seq正确捕获了有关动力学行为的定量信息分析的转录本。在转录本丰度、序列或结构水平上没有观察到显着偏差（ Jeandard等人的图 S7，2023 ）。然而，由于标准 RNA- seq协议的限制，RNA- seq文库中 tRNA 的表示通常对广泛修饰的物种存在偏见（ Jeandard等人的图 S8，2023 ）。
CoLoC-seq和模拟CoLoC-seq设置中转录本的行为显着不同（ Jeandard等人，2023中的图 3 和 4 以及图 S6 ），表明线粒体膜确实为一部分 RNA 分子提供了庇护。正如预期的那样，线粒体 DNA 编码的线粒体 RNA 在CoLoC-seq设置中大部分对 RNase A 具有抗性，但在模拟CoLoC-seq中迅速降解，证实它们确实存在于细胞器内。相比之下，绝大多数核 DNA 编码的转录本，例如丰富的 5.8S rRNA 和 U6 snRNA，在这两种情况下都被快速降解，证实它们是表面附着的可降解污染物（Jeandard 等人的图 2-4 ）。，2023 ）。值得注意的是，一些短的、高度结构化的、蛋白质结合的非编码转录本，例如 5S rRNA 以及 RNases P 和 MRP 的 RNA 成分，在 CoLoC- seq和模拟CoLoC-seq实验中都稳定在中间水平。这表明，即使线粒体膜已溶解，它们在很大程度上仍能抵抗 RNase 降解，因此可能代表顽固污染物。我们还鉴定了一些 RNA Pol III 转录本，例如 Y RNA、SNAR-A 和 tRNA，可能部分线粒体定位（ Jeandard等人，2023 年的图 4 和图 S8 ），这通过生化和检测进一步证实。 smFISH检测（ Jeandard等人，2023 年的图 5 ）。

CoLoC-seq回归数据的决策标准
模型1（完整）
CoLoC测序模拟CoLoC-seq解释
P 0P 0 CI 包括0？P 0 P值k'k' CI 包括 0？k' P值P 0P 0 CI 包括0？P 0 P值k'k' CI 包括 0？k' P值
≈0通常是的*通常较高*高的不低的≈0通常是的*通常较高*高的不低的可降解污染物
远离 0 但 < 1不低的高的不低的≈0通常是的*通常较高*高的不低的部分驻留在细胞器内
≈1不低的≈0是的高的≈0通常是的*通常
高的*高的不低的完全驻留在细胞器内
远离 0 但 < 1不低的高的不低的远离 0 但 < 1不低的高的不低的部分 RNase 抗性转录本
≈1不低的≈0是的高的≈1不低的≈0是的高的RNase 抗性转录本
模型 2（伪一阶衰减）
k'k' CI 包括 0？k' P值k'k' CI 包括 0？k' P值决定
高的不低的高的不低的可降解污染物
≈0是的高的高的不低的完全驻留在细胞器内
≈0是的高的≈0是的高的RNase 抗性转录本
*CI 宽度和P值在很大程度上取决于样本大小，并且在足够高的n下，即使对于非常小的P 0值（接近 0），也很常见获得统计显着的结果。在这种情况下，人们应该更多地依赖P 0的绝对值：如果它非常小，则可以合理地认为这样的转录本是完全可降解的（即，在CoLoC-seq设置下的污染物），即使不确定性措施看来意义重大。在Jeandard等人中。 (2023)，考虑到 Northern blotting 和 RNA- seq测量 RNA 水平的精度有限，我们任意选择P 0截止值 0.1。这意味着至少 10% 的转录本需要从反应中排除，才能达到显着水平的保护。另请参见Jeandard等人的表 S2 中对异常小但重要的k'值的讨论。（2023）。

由于人类细胞的线粒体转录组已成为亚细胞转录组学的流行基准（Mercer et al., 2011; Kaewsapsak et al., 2017; Fazal et al., 2019; P. Wang et al., 2019; Zhou et al., 2019）。，2019），我们可以直接将CoLoC-seq性能与其他全基因组方法（尤其是最强大的邻近标记技术）进行比较。我们发现CoLoC-seq在长转录本（rRNA、mRNA、 lncRNA ）上表现同样出色，并且在较短转录本（tRNA、snRNA、snoRNA、 scaRNA等）上显着优于替代方法，而这些转录本通常很难被邻近标记方法覆盖。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

在为 CoLoC-seq 实验选择 RNase 时，应考虑两个重要点：(i) 它应该表现为一种动力学上完美的酶，即其催化作用必须仅受扩散限制（Park 和 Raines，2003）和（ii））它应该产生5'-羟基和2'-或3'-磷酸末端。第一个属性可以直接使用 CoLoC-seq 动力学模型，这意味着样品中的不同转录本是独立切割的，没有明显的 RNase 隔离效应；因此，RNase浓度可以认为是恒定的，整个反应变成伪一级反应。第二个特性允许对完整转录本进行选择性测序（根据 CoLoC-seq 模型的要求，该模型仅查看剩余的完整 RNA；参见方程式 1）：此类 RNase 的单次切割会生成与标准接头连接不兼容的末端（参见G 部分：文库制备和 RNA-seq）。（这里需要注意的是，人们无法通过 RNA-seq 研究具有天然 5 ' -OH 或 2 ' - 或 3 ' - 磷酸化末端的转录本。但是，它们仍然可以通过 Northern blotting 进行分析。）其他产生 5 ' -羟基的高活性 RNase原则上也可以使用2'-或3'-磷酸末端（微球菌核酸酶、RNase I、RNase T 1 ）。然而，我们和其他人发现它们总体上比 RNase A 性能较差且更特殊 [Yang，2011；阿雅尼和德内克，2015； Jeandard 等人，2023（图 S1 ）]。
CoLoC-seq 中使用的精确 RNase 浓度取决于酶批次的比活性和所研究生物材料的性质。应针对每个新应用程序单独调整它们。选定的浓度范围必须能够观察污染物转录物的逐渐消化动态，而不影响最终 RNA 样品的质量（图 2A、2B）。人们应该努力在低 RNase 浓度下获得特别高分辨率，其中 RNase 的微小变化通常会导致剩余转录物水平的巨大变化（图 3A、3D）。这有利于k'拟合并由此提高P 0估计的精度。
CoLoC-seq 可以应用于几乎任何膜结合的细胞器（例如，参见之前发布的叶绿体和顶端质体的分离方案： Kunst，1998；Botté 等人，2018 ）以及已知或怀疑含有 RNA 的其他实体（病毒、内共生生物、细胞外囊泡）。由于细胞外 RNA 可以被包装在膜囊泡（例如外泌体）中并受到游离RNP 的保护，因此希望使 CoLoC-seq 适应此类系统的研究人员可能需要结合蛋白酶 K 预处理步骤以暴露嵌入的 RNP污染物并使其能够被 RNase 消化（Arroyo 等人，2011；Hill 等人，2013；Mateescu 等人，2017；Jeppesen 等人，2019；Murillo 等人，2019；Gruner 和 McManus，2021）。
最后，由于 miRNA 本质上对 RNase 介导的降解敏感性较低（特别是当它们与蛋白质相关时，通常就是这种情况），我们不鼓励使用 CoLoC-seq（或实际上其他基于 RNase 的方法）来推断其定位拓扑（Arroyo 等人，2011；Aryani 和 Denecke，2015）。

故障排除（表 2）

表2.故障排除
问题可能的原因解决方案
样品中存在非特异性 RNA 降解（涂片、额外随机条带）•水中的RNase 污染。
•空气中的RNase 污染。
•移液器过滤器的RNase 污染。•使用无RNase 的水制备所有溶液。
•在专用的无RNase 环境中工作。
•更换移液器过滤器。
RNA产量低•原材料不足。
•细胞器产量低。•增加起始材料的量。
•尝试采用更高产量的替代细胞器分离方案。
溴化乙锭染色或 Northern blotting 后样品中的图案不均匀（例如，图 2D）•样品之间的细胞器沉淀不均匀或不充分重悬。
• RNA 分离不均匀。

• RNA 沉淀溶解不充分。•在将细胞器沉淀分成样品系列之前，小心而彻底地重新悬浮细胞器沉淀。如果需要，请使用较窄的移液器吸头。
•确保样品之间的水相均匀吸收。始终以相同的顺序处理样品，以使它们的处理最大限度地相同。
•如果您怀疑RNA 沉淀未完全溶解（通常是由于蛋白质污染），请用TRIzol 重新提取所有样品。
消化动力学较差，表明样品中的 RNA 降解不显着（例如图 2B）或相反，过快• RNase 活性或浓度范围太低/太高。
•反应条件欠佳。增加/减少 RNase 的量。
更换酶批次。
•升高/降低反应温度（0 至37 °C 之间）。
•增加/减少反应时间（1-15 分钟）。
•根据已知的 RNase 偏好，尝试调整盐浓度、特定二价阳离子或 pH 值。
•我们建议，在尝试完整的 CoLoC-seq 实验之前，使用各种酶和反应条件对总细胞或细胞器裂解物进行测试消化（如方案 D 部分所述）（参见 Jeandard 等人的图 S1） .，2023）。
在 CoLoC-seq 设置中，真正的驻留转录本会被降解，就好像它们是污染物一样•过于苛刻的分离方案损害了细胞器的完整性。•使用较温和的细胞破碎和/或细胞器分离方案。
在 CoLoC-seq 设置中，所有 RNA 看起来至少受到部分保护•细胞未充分破碎。
•细胞碎片污染了细胞器制备物。•使用额外的/更强的破坏并在光学显微镜下检查材料。
•添加额外的低速离心步骤以进一步去除细胞碎片。
•更干净地吸取低速离心后的上清液，将上清液的下部与碎片颗粒一起丢弃。
模拟 CoLoC-seq 设置中的 RNA 产量较差•细胞器裂解不充分。•使用更强/更浓缩的非离子清洁剂。
•施加额外的机械力（Dounce 匀浆器、注射器、超声处理；但要小心 RNA 剪切！）。

致谢

这项工作得到了斯特拉斯堡大学通过 IdEx Unistra [ANR-10-IDEX-0002]、SFRI-STRAT_US 项目 [ANR 20-SFRI-0012]、EUR IMCBio [ANR17-EURE-0023] 和 IdEx 的支持 - Attractivité [ANR-10-IDEX-0002-02 至 Al.S.]，由国家科学研究中心 (CNRS) 提供。 CoLoC-seq 方法首先发表于Jeandard 等人。（2023）。

利益争夺

不存在利益冲突或利益竞争。

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补充资料

https://doi.org/10.5281/zenodo.6389451 )上找到。
Jeandard等人发表的CoLoC-seq和Mock-CoLoC-seq测序数据。 (2023) 被保藏在 NCBI 基因表达综合数据库 (GEO) 中，登录号为GSE183167 ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE183167 ) 。