材料与试剂

生物材料

1.雌性 C57BL/6 小鼠（8周龄）（Charles River，C57BL/6NCrl，目录号：000664）

试剂

1.Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM、高葡萄糖、GlutaMAX 补充剂、丙酮酸盐）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：31966021）
2.RPMI 1640 培养基（Thermo Fisher，目录号：11875093）
3.最低必需培养基（MEM）（Sigma，目录号：M0446-500ML）
4.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A8412）
5.胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10082147）
6.L-谷氨酰胺（Corning，目录号：25005CI）
7.丙酮酸钠（康宁，目录号：25-000-CIR）
8.青霉素-链霉素（Gibco，目录号：15070063）
9.β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
10.磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4 （ Gibco，目录号： 10010-023）
11.EDTA（康宁，目录号：46-034-CI）
12.分散酶（Sigma-Aldrich，目录号：42613-33-2 ）
13.Liberase研究级（Sigma-Aldrich，目录号：5401119001）
14.DNase（Sigma-Aldrich，目录号：11284932001）
15.GentleMACS C 管（ Miltenyi ，目录号：130-093-237）
16.红细胞（RBC）裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：00433357）
17.MojoSort 小鼠抗 CD45 纳米珠（BioLegend，目录号：480027）
18.MojoSort 小鼠抗 APC 纳米珠（BioLegend，目录号：480072）
19.重组鼠 GM-CSF（Peprotech，目录号： 315-03）
20.重组鼠IL-2（Peprotech，目录号：212-12）
21.Zombie Aqua Fixable Viability 套件（BioLegend，目录号：423101）
22.Sytox Blue 死细胞染色剂（Thermo Fisher，目录号：s34857）
23.抗小鼠CD16/32 Fc块克隆93（BioLegend，目录号：101301）
24.多聚甲醛（PFA）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-281692）
25.皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：47036）
26.叠氮化钠（NaN3）（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
27.TRIzol 试剂（Thermo Fisher，目录号：15596026）

流式细胞术抗体

1.用于骨髓 MO 富集（基于微珠的阴性选择）和分选的抗体：
a.负选择
我。抗小鼠 B220/CD45R APC（克隆 RA3-6B2）（BioLegend，目录号：103212）
二.抗小鼠 Ly6G APC（克隆 1A8）（BioLegend，目录号：127613）
b.流式细胞仪预混液染色
我。抗小鼠 CD11b BV711（克隆 M1/70）（BD Biosciences，目录号：563168）
二.抗小鼠 Ly6G APC-Cy7（克隆 1A8）（BD Biosciences 目录号：560600）
三.抗小鼠 Ly6C BV785（克隆 HK1.4）（BioLegend，目录号：128041）
四.抗小鼠 IA/IE PE/Cyanine7（克隆 M5/114.15.2）（BioLegend，目录号：107630）
v. 抗小鼠 CD3e FITC（克隆 145-2C11）（BioLegend，目录号：100306）
2.用于肺 EC 富集（基于 CD45 珠的阴性选择）和分选的抗体：
a.流式细胞仪预混液染色
我。抗小鼠 CD45 PE/Cyanine7（克隆 30-F11）（BioLegend，目录号：103114）
二.抗小鼠EpCAM FITC（克隆 G8.8）（BioLegend，目录号：118207）
三.抗小鼠 CD31 PE（克隆 390）（BioLegend，目录号：102407）
3.用于肺 ILC2 富集（基于微珠的阴性选择）和分选的抗体：
a.负选择
我。抗小鼠 B220/CD45R APC（克隆 RA3-6B2）（BioLegend，目录号：103212）
二.抗小鼠 CD11c APC（克隆 N418）（BioLegend，目录号：117310）
三.抗小鼠 CD3e APC（克隆 145-2C11）（BioLegend，目录号：100312）
四.抗小鼠 CD4 APC（克隆 RM 4-5）（BioLegend，目录号：100515）
v.抗小鼠CD49b APC（克隆DX5）（BioLegend，目录号：108910）
六.抗小鼠 CD5 APC（克隆 53-7.3）（BioLegend，目录号：100626）
七.抗小鼠 CD8a APC（克隆 53-6.7）（BioLegend，目录号：100711）
八.抗小鼠 F4/80 APC（克隆 BM8）（BioLegend，目录号：123116）
九.抗小鼠FcεRI α APC（克隆 MAR-1）（BioLegend，目录号：134316）
X。抗小鼠 Gr-1 APC（克隆 RB6-8C5）（BioLegend，目录号：108412）
xi.抗小鼠Siglec -F APC（克隆 E50-2440）（BioLegend，目录号：155507）
b.流式细胞仪预混液染色
我。抗小鼠 CD45 PE/Cyanine7（克隆 30-F11）（BioLegend，目录号：103114）
二.抗小鼠 B220/CD45R APC（克隆 RA3-6B2）（BioLegend，目录号：103212）
三.抗小鼠 CD11c APC（克隆 N418）（BioLegend，目录号：117310）
四.抗小鼠 CD3e APC（克隆 145-2C11）（BioLegend，目录号：100312）
v.抗小鼠CD4 APC（克隆RM 4-5）（BioLegend，目录号：100515
六.抗小鼠 CD49b APC（克隆 DX5）（BioLegend，目录号：108910
七.抗小鼠 CD5 APC（克隆 53-7.3）（BioLegend，目录号：100626
八.抗小鼠 CD8a APC（克隆 53-6.7）（BioLegend，目录号：100711
九.抗小鼠 F4/80 APC（克隆 BM8）（BioLegend，目录号：123116）
X。抗小鼠FcεRI α APC（克隆 MAR-1）（BioLegend，目录号：134316）
xi.抗小鼠 Gr-1 APC（克隆 RB6-8C5）（BioLegend，目录号：108412）
十二.抗小鼠Siglec -F APC（克隆 E50-2440）（BioLegend，目录号：155507）
十三.抗小鼠 CD25 Alexa Fluor 700（克隆 PC61）（BioLegend，目录号：102024）
十四.抗小鼠 ST2 PE（克隆 DIH9）（ BioLegend ，目录号：145304）
十五.抗小鼠 CD90.2 BV711（克隆 53-2.1）（BD Biosciences，目录号：740647

解决方案

1.洗涤缓冲液（参见配方）
2.MACS 缓冲区（参见食谱）
3.FACS 缓冲液（参见配方）
4.完全培养基（参见食谱）
5.肺消化液（参见食谱）
6.MO 和 EC 培养基（参见食谱）
7.ILC2 培养基（参见食谱）
8.透化缓冲液（参见配方）
9.细胞内染色缓冲液（参见配方）

食谱

1.洗涤缓冲液
PBS-EDTA 2 mM，含 10% FBS

2.MACS缓冲区
含有 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS
保持缓冲液低温 (2–8 °C )

3.流式细胞仪缓冲液
含有 0.5% BSA、2 mM EDTA、2 mM 叠氮化钠 (NaN 3 )的 PBS

4.完全培养基
RPMI 培养基补充有 10% FBS、1% MEM、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、50 μM β-巯基乙醇

5.肺消化液
新鲜制备 1.5 mL/样品的 RPMI，其中含有 50 μg/mL Liberase 和 100 μg/mL DNase I

6.MO和EC培养基
RPMI 培养基补充有 10% FBS、1% MEM、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、50 μM β-巯基乙醇和 10 ng/mL 重组鼠 GM-CSF

7.ILC2培养基
RPMI-1640 培养基补充有 10% FBS、1% MEM、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、50 μM β-巯基乙醇和 10 ng/mL 重组小鼠 IL-2

8.透化缓冲液
含0.1%皂苷的PBS
过滤后保持缓冲液低温和无菌

9.细胞内染色缓冲液
含有 0.1% 皂苷的 FACS 缓冲液（参见配方 3）

实验室用品

1.15 和 50 mL 锥形离心管（Corning，目录号：352096 和 352070）
2.细胞培养 60 × 15 mm 培养皿（ Thermo Fisher Scientific，目录号：150288）
3.24孔细胞培养板（Falcon，目录号：353047）
4.96孔圆形（U）底板（ Thermo Scientific，目录号： 163320）
5.10 mL注射器（Terumo，目录号：SS+10ES1）
6.25 G 针（Terumo，目录号：AN*2516R1）
7.Falcon ® 70 μm细胞过滤器（Corning，目录号： 352350）
8.LD 柱（ Miltenyi ，目录号：130-042-901）

设备

1.吊桶离心机（Eppendorf，型号：5810R）
2.台式离心机（Eppendorf，型号：5427R）
3.倒置光学显微镜（NIKON、Eclipse TS100）
4.荧光激活细胞分选仪（BD Biosciences，型号：Aria IIIu）
5.流式细胞仪（BD LSR Fortessa X-20）
6.层流罩（FASTER SafeFast Classic）
7.手术刀（Swann-Morton 210 毫米3号编号 0933）
8.镊子（Bochem 不锈钢 18/10 参考号 1141）
9.GentleMACS 分离器 (Miltenyi)
10.QuadroMACS 分离器 (Miltenyi)
11.血细胞计数器（ Marienfeld ，0640710）

软件和数据集

1.FlowJo v10（FlowJo LLC）
2.FACSDiVa软件

程序

为了获得足够的肺 EC 和 ILC2 来执行共培养设置，从五只小鼠中纯化肺 EC 和 ILC2。这将使您在每次富集后获得 12-15 个含有 5 × 10 3肺 EC 和 2.5 × 10 3 ILC2 的孔。
注意：整个过程必须在层流罩下进行，以保持培养物无菌。

A.骨髓 M Os 分离

1.骨髓细胞悬液的制备
a.安乐死小鼠并用 75% 乙醇喷洒皮肤。
b.去除身体下部的皮肤。
c.用剪刀从腿上取下组织。
d.将股骨与股骨囊分离。小心不要折断骨头；最好的方法是使骨头脱臼，而不是切割它们。将一条腿的股骨和胫骨放入装有 20 mL DMEM 的 50 mL 管中，置于冰上。
e.取出骨头，在培养皿中用手术刀切掉两端。
f.使用带有 25 G 针头的 10 mL 注射器，将骨髓细胞冲洗到带有洗涤缓冲液的 50 mL 管中（参见配方）。
g.μm细胞过滤器过滤至新的 50 mL 管中。
h.250 × g离心 5 分钟，弃去上清液。
i.重悬于 1 mL 的 RBC 裂解缓冲液中。在室温 (RT) 下孵育 5 分钟，然后添加 9 mL 洗涤缓冲液。使用血细胞计数器对细胞进行计数。
注意：从未感染的 8 周大雌性 C57BL/6 小鼠的股骨和胫骨中收集骨髓细胞时，预计会产生大约 40 × 10 6 –60 × 10 6个细胞，活力约为 94%–98%。
2.负选择
a.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。
b.在含有与 APC 荧光染料偶联的抗 Ly6G 和 B220 抗体（参见流式细胞术抗体 1.ai）的MACS 缓冲液（10 8 个细胞/mL）（参见食谱）中重悬，并在黑暗中于 4°C 孵育 20 分钟。
注： B220 和 Ly6G 抗体分别靶向 B 细胞和中性粒细胞，这些细胞将被进一步耗尽，从而促进 FACS 分选。
c.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。重悬于1 mL含有纯化抗 CD16/32 抗体（稀释 1:500）的冰冷 MACS 缓冲液中，以阻断Fc 受体。
d.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。
e.适应体积的 MojoSort APC Nanobeads （10 μL /10 7 个细胞）重悬 MACS 缓冲液（10 7 个细胞/100 μL）中的细胞（根据MojoSort 小鼠抗 APC Nanobeads 方案）。在冰上孵育 15 分钟。
f.添加 MACS 缓冲液至 4 mL 来清洗细胞。以250 × g离心细胞 4°C 5 分钟。丢弃上清液。
g.在 MACS 缓冲液中重悬（5 × 10 7 个细胞/500 μL ）。
h.通过 70 μm细胞滤网过滤细胞。
i.继续进行磁性阴性选择：将细胞悬浮液施加到准备好的 LD 柱上（根据 Miltenyi LD 柱方案）。用 2 × 1 mL 的 MACS 缓冲液洗涤后收集含有未标记细胞的流穿液。未标记的细胞含有 MO。
3.用于 FACS 分选的 MO 染色
a.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。将沉淀重新悬浮在含有抗体（抗 CD19、CD3、Ly6G、B220、CD11b、Ly6C）的FACS 缓冲液（10 7 个细胞/mL）（参见食谱）中，在黑暗中 4°C 下 20 分钟。以250 × g离心细胞 4°C 5 分钟。丢弃上清液。将沉淀重新悬浮在 5 mL 的 PBS 中并重复离心。
b.弃去上清液并添加 SYTOX 进行活力染色蓝色至 FACS 缓冲液（1 µL/10 mL/5 × 10 7 个细胞）。在黑暗中室温孵育 5 分钟。
c.使用 FACS Aria IIIu 执行 FACS 排序。骨髓 MO 门控为 Ly6G - MHCII - CD3 - CD11b + Ly6C +活细胞（图 1）。

图1.骨髓单核细胞( MO) 的 FACS 分选的门控策略，被描述为排除中性粒细胞 (Ly6G + CD11b + ) 、B 细胞 (MHCII + CD11b - ) 和排除后的 SSC-A低Ly6C + CD11b + 活细胞通过 MACS 阴性选择富集细胞后的T 细胞 (CD3 + CD11b - )

d.使用血细胞计数器对细胞进行计数。
e.× g离心 4°C 5 分钟。弃去上清液并以 10 5 个细胞/100 μL 完全培养基重悬细胞（参见配方）。

B.肺 EC 隔离

1.肺细胞悬液的制备
a.安乐死小鼠并用 75% 乙醇喷洒皮肤。
b.插入气管并添加 1 mL 的 PBS 和 10 U/mL 的分散酶。
c.用 5 mL 冰冷的 PBS 通过右心室灌注。分离肺叶并将其放入含有 2 mL DMEM 介质和 10 U/mL 分散酶的 24 孔板中，在 RT 下放置 10 分钟。
d.将一只小鼠的肺叶转移到单独的 GentleMACS 中装有肺消化溶液的管（参见食谱）并用gentleMACS分离器进行处理（肺程序01）；最后，37°C 孵育 30 分钟。消化后，使用gentleMACS 分离器运行肺部程序02。
e.将细胞悬浮液通过 70 μm 细胞滤网过滤到 50 mL 管中，并用洗涤缓冲液加满至 25 mL。
f.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。将沉淀重新悬浮在 1 mL 的 RBC 裂解缓冲液中。在 RT 下孵育 5 分钟，添加 9 mL 洗涤缓冲液，并将所有样品汇集到一根 50 mL 管中。使用血细胞计数器对细胞进行计数。
8 周龄雌性 C57BL/6 小鼠的每个肺中应该有大约 6 × 10 6 –12 × 10 6 个细胞。
2.负选择
a.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。根据制造商方案，用适应体积的 MojoSort 小鼠 CD45 纳米珠（10 μL/10 7 个细胞）重悬于MACS缓冲液（ 10 7个细胞/100 μL）中。 4°C 孵育 15 分钟。
b.添加 MACS 缓冲液至 4 mL 来清洗细胞。 250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。
c.在 MACS 缓冲液中重悬（5 × 10 7 个细胞/500 μL）
d.通过 70 μm 细胞滤网过滤细胞。
e.继续进行磁性阴性选择：将细胞悬浮液应用到准备好的 LD 柱上（遵循 Miltenyi LD 柱方案）。用 2 × 1 mL 的 MACS 缓冲液洗涤后收集含有未标记细胞的流穿液。
注意：未标记的细胞包含非免疫细胞。
3.ECs 染色用于 FACS 分选
a.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。用抗体（抗 CD45、CD31、EpCAM）在 FACS 缓冲液（10 7 个细胞/mL）中重悬，4°C 避光 20 分钟。
b.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。将沉淀重新悬浮在 5 mL 的 PBS 中并重复离心。
c.弃去上清液并添加 SYTOX 进行活力染色 FACS 缓冲液中呈蓝色（1 μL/1 mL/5 × 10 7 个细胞）。在黑暗中室温孵育 5 分钟。
d.继续进行 FACS 分选。肺 EC 被门控为 CD45 - CD31 - Epcam +活细胞（图 2 ）。使用血细胞计数器对细胞进行计数。

图2.通过 MACS 阴性选择 (CD45 ) 富集细胞后，肺上皮细胞 (EC) 的 FACS 分选的门控策略，描述为 CD45 - CD31 - EpCAM +活细胞。

e.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。将细胞以 5 × 10 3 个细胞/50 μL 重悬于完全培养基中（参见配方）。

C.MO 和肺 EC 的培养

注意：肺EC与骨髓MO的存在将有助于在分化为AM的过程中获得MO。
1.将 50 μL（5 × 10 4 个细胞）的骨髓 MO 和 50 μL（5 × 10 3 个细胞）的肺 EC 添加到 96 孔圆底板的孔中。
2.每孔中加入 100 μL 含有 20 ng/mL 重组鼠 GM-CSF（终浓度为 10 ng/mL）的完全培养基，轻轻重悬。注意：提供不含 GM-CSF 的对照孔以及不含 EC 的条件。
3.在 37 °C、5% CO 2下孵育三天。

D.肺 ILC2 隔离

1.肺细胞悬液的制备
a.安乐死小鼠并用 75% 乙醇喷洒皮肤。
b.用 5 mL 冰冷的 PBS 灌注通过右心室。将肺叶转移到含有肺消化溶液的 GentleMACS 管中（参见食谱）并用gentleMACS 分离器进行处理（肺程序 01）；最后，37°C 孵育 30 分钟。消化后，使用gentleMACS 分离器运行肺部程序02。将细胞悬浮液通过 70 μm 细胞滤网过滤到 50 mL Falcon 管中，并用洗涤缓冲液加满至 25 mL。
c.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。将沉淀重新悬浮在 1 mL 的 RBC 裂解缓冲液中。在 RT 下孵育 5 分钟，添加 9 mL 洗涤缓冲液，一次将五个样品合并到一个 50 mL Falcon 管中。使用血细胞计数器对细胞进行计数。
对于 8 周龄雌性 C57BL/6 小鼠，您的每个肺中应该有大约 6 × 10 6 –10 × 10 6细胞总数。
2.负选择
a.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。用与 APC 荧光染料缀合的谱系标记抗体（抗 B220、CD11c、CD3、CD4、CD5、CD8α、F4/80、FcεR1、CD49b 和 Siglec-F）将沉淀重新悬浮在 10 8 个细胞/mL 的 MACS 缓冲液中，用于4°C 避光 20 分钟。
注： ILC2 约占肺白细胞总数的 1%；该谱系将针对其他免疫细胞，如 T 细胞、B 细胞、NK 细胞和巨噬细胞，然后改进 FACS 分选。
b.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。将沉淀重新悬浮在 5 mL 的 MACS 缓冲液中并重复离心。
c.弃去上清液，并用适应体积的 MojoSort APC 纳米珠（10 μL/10 7 个细胞）重悬于 MACS 缓冲液（10 7 个细胞/100 μL ）中（遵循制造商的方案）。在冰上孵育 15 分钟。
d.添加 MACS 缓冲液至 4 mL 来清洗细胞。以250 × g离心细胞 4°C 5 分钟。丢弃上清液。
e.在 MACS 缓冲液中重悬（5 × 10 7 个细胞/500 μL）。
f.通过 70 μm 细胞滤网过滤细胞。
g.继续进行磁性阴性选择：将细胞悬浮液施加到准备好的 LD 柱上（遵循 Miltenyi LD 柱方案）。用 2 × 1 mL 的 MACS 缓冲液洗涤后收集含有未标记细胞的流穿液。
注意：未标记的细胞包含肺 ILC 和非免疫细胞。
3.用于 FACS 分选的 ILC2s 染色
a.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。用抗体（抗 B220、CD11c、CD3、CD4、CD5、CD8α、F4/80、FcεR1、Ly6G、Siglec-F、CD45、CD90.2、ST2 和 CD25）重悬于 FACS 缓冲液（10 7 个细胞/mL ）中) 4°C 避光 20 分钟。以250 × g离心细胞 4°C 5 分钟。丢弃上清液。将沉淀重新悬浮在 5 mL 的 PBS 中并重复离心。
b.弃去上清液并添加 SYTOX 进行活力染色蓝色至 FACS 缓冲液（1 μL/1 mL/5 × 10 7 个细胞）。在黑暗中室温孵育 5 分钟。
c.按照制造商的协议，使用 FACS Aria IIIu 继续进行 FACS 排序。肺 ILC2 门控为 CD45 + Lin - CD90.2 + ST2 + CD25 +活细胞（图 3）。使用血细胞计数器对细胞进行计数。

图3. 通过针对谱系标记（B220、CD11c、CD3、CD4、CD49b、CD5、CD8α、F4/80、 FcεR1、Gr1 和Siglec -F)。 ILC2被鉴定为Lin - CD45 + ST2 + CD90.2 + CD25 + 。

d.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。以 2.5 × 10 3 个细胞/200 μL ILC2 培养基重悬细胞（参见配方）。关键： IL-2 对于在离体培养中维持 ILC2 是必需的。

E.ILC2 与 MO 和 EC 的共培养

1.此步骤可以研究 ILC2 和分化为 AM 的 MO 之间的相互作用的作用，并研究靶向配体-受体相互作用的潜在重要性。
a.将 96 孔板与骨髓 MO 和肺 EC 共培养物以250 × g离心 4°C 5 分钟。轻轻吸出上清液，不要接触沉淀。
b.在 ILC2 培养基中添加 200 μL ILC2（2.5 × 10 3 个细胞）。轻轻地将细胞混合在一起。在37°C、5%CO 2环境下孵育三天。
注意：提供没有 ILC2 的控制条件。
2.用于 FACS 分析的收获和染色
注意：通过 CD11c 的表达观察到，大部分骨髓 MO 分化为 AM 样细胞。 MO 衍生的 AM 与来自幼鼠的 ILC2 共培养时获得 M2 标记 Arg1。
a.250 × g离心板 4°C 5 分钟。
b.TM的 PBS 中，在黑暗中 RT 15 分钟，进行活力染色。关键：如果评估需要胞浆内染色（例如 Arg1），请使用可固定活力试剂盒。
c.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。
d.使用以下抗体（抗 CD45、CD11c、Siglec-F、MHC-II、CD90、ST2）或您感兴趣的靶标的任何抗体，将细胞沉淀以 50 μL/孔重悬于 FACS 缓冲液中，在 4 °C 下悬浮 20 分钟在黑暗中。
e.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。在 100 μL/孔的 PFA 2% 中重悬至少 15 分钟，在 4°C 下避光（可以延长过夜）。
f.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。在 100 μL/孔的透化缓冲液中重悬（参见配方），并在 37 °C 下孵育 15 分钟。
g.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。用抗细胞内抗原的抗体重悬于 100 μL/孔的细胞内染色缓冲液（参见配方）中。在黑暗中室温孵育 30 分钟。
h.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。重悬于 200 μL/孔的 FACS 缓冲液中并重复离心。
i.弃去上清液，重悬于 200 μL/孔的 FACS 缓冲液中，然后使用 BD LSR Fortessa X-20 进行 FACS 分析（图 4 ）。

图4. 肺 ILC2 调节分化并在体外诱导 MOAM 的 M2 表型。 (A)骨髓单核细胞 (MO)、支气管肺泡灌洗肺泡巨噬细胞 (AM ) 和与肺上皮细胞 (EC) 和肺组 2 肺先天淋巴细胞 (ILC2) 共培养分化为 MOAM 的骨髓 MO 的代表性流式细胞术图）。 (B) 差异表达基因热图（错误发现率，FRD）< 0.05；从含有或不含 ILC2 的 MO 和 EC 的共培养物中分离出的 MO 衍生巨噬细胞中，表达变化超过两倍）。突出显示了在 ILC2 条件下表达较高的三个基因。

3.收获用于 RNA 测序
注意：为了进行更深入的分析，可以对离体分化的 MO 衍生的 AM 进行转录组分析。
a.250 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。在 100 μL 的 FACS 缓冲液中用抗体（抗 Ly6G、Ly6C、CD11c、CD45、CD90.2、ST2 和 CD25）在黑暗中 4°C 下重悬 20 分钟。以250 × g离心细胞 4°C 5 分钟。丢弃上清液。将沉淀重新悬浮在 5 mL 的 PBS 中并重复离心。
b.弃去上清液并添加 SYTOX 进行活力染色 FACS 缓冲液中呈蓝色（1 μL /1 mL/5 × 10 7 个细胞/）。在黑暗中室温孵育 5 分钟。
c.按照制造商的协议，使用 FACS Aria IIIu 继续进行 FACS 排序。 MO 衍生的 AM 被定义为 Ly6G - 、Ly6C - 、自发荧光和 CD11c +活细胞，并直接在 1 mL TRIzol 中分选，然后快速冷冻直至将来分析（图 4）。

数据分析

使用 FACSDiVa 软件在 BD FACS Aria IIIu 上对样品进行分类。使用 FlowJo 分析流式细胞术数据，以对不同群体进行门控、量化和分析。

根据特定标记的表达对细胞进行分类：
•骨髓MOs 门控为Ly6G - MHCII - CD3 - CD11b + Ly6C +活细胞（图1）。
•肺内皮细胞门控为CD45 - CD31 - Epcam +活细胞（图2）
•肺ILC2 门控为CD45 + Lin - CD90.2 + ST2 + CD25 +活细胞（图3）。
对于读数，MO 衍生的 AM 被定义为 Ly6G - 、Ly6C - 、自发荧光和 CD11c +活细胞，ILC2 作为 SSC-A低CD11c - CD90.2 + ST2 +活细胞。
有关数据分析的详细信息出现在原始研究文章中（Loos et al., 2023，图 6 和图 S4）。

协议验证

路斯等人。（2023）。伽马疱疹病毒感染抑制 2 组先天淋巴细胞的 2 型特性，从而重新编程肺泡巨噬细胞。科学免疫学（图 6 和图 S4）。

一般注意事项和故障排除

1.整个过程必须在层流罩下进行，以保持无菌条件并避免任何污染。
2.LC2和上皮细胞是肺中的少数群体，因此每种情况至少应汇集 5 个个体，以获得足够的感兴趣细胞，从而生成一式三份。
3.珠子富集将有利于 FACS 分选，负富集将避免早期细胞激活。
4.由于 ILC2 和上皮细胞表型直接受到环境条件的影响，因此实验结果在很大程度上取决于小鼠所经历的环境条件，例如 MuHV-4 感染（Loos 等人，2023）。

致谢

该协议改编自之前发表的论文：Loos 等人。（2023）。
这项工作得到了列日大学（VIRIMPRINT ARC to LG）、Léon Fredericq基金会（授予PL）、比利时科学研究基金会（FRS/FNRS）的部分支持，“ LG 的“credit de recherche” J007515F；LG 的“projet de recherche”T.0195.16；BM 的研究员支持；PL 和 CM 的研究员），由 Institut MERIEUX 启动资助（给 LG），由 FRS 的 EOS 联合计划/FNRS Fonds wetenschapellijk onderzoek–Vlaanderen-FWO（EOS ID：30981113 和 40007527）（致 LG）；并获得 ERC 启动补助金 (ERC-StG-2020 VIROME, ID:853608)（授予 BM）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

该协议开发的所有工作均得到了列日动物实验伦理委员会的批准（许可证号 1845）。

参考

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