材料与试剂

生物材料

1.Balb /c 小鼠（4-7 周龄）（ Envigo 、 Inotiv ）
2.野生型或mCherry杜氏利什曼原虫后鞭毛体（IS 株；MHOM/SD/00/S-2D）（Osorio 等人，2023）

试剂

1.RPMI 1640 培养基（ Thermo Fisher Science， Gibco TM ，目录号： 11875093)
2.M199 培养基（ Thermo Fisher Science， Gibco TM ，目录号： 11150067)
3.青霉素-链霉素溶液（ Thermo Scientific， Gibco TM ，目录号：15140163）
4.胎牛血清（FBS），通过在 56 °C 加热 20 分钟灭活（ Thermo Scientific， Gibco TM ，目录号：16000044）
5.0.4％台盼蓝溶液（ Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
6.腺嘌呤（Sigma-Aldrich 目录号：A8626）
7.血红素（Millipore，Sigma，目录号：H9039）
8.HEPES 缓冲溶液 1 M（Millipore，Sigma，目录号： 83264)
9.氯化钠（NaCl）（Millipore，Sigma，目录号：S9888）
10.氯化钾（ KCl ）（Millipore，Sigma，目录号：P3911）
11.氯化镁六水合物（MgCl 2 · 6H 2 O）适合细胞培养（Millipore，Sigma，目录号：M2393）
12.适用于细胞培养的氯化钙（CaCl 2 ）（Millipore，Sigma，目录号：C7902）
13.胶原酶 D（Millipore，Sigma，Roche，目录号： 11088858001）
14.DNase I（Millipore，Sigma，Roche，目录号： 10104159001）
15.Liberase TM TL（Millipore，Sigma，Roche，目录号：5401020001 ）
16.Accutase细胞分离溶液（STEMCELL Technologies，目录号：07920）
17.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7030 ）
18.10×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning® ，目录号：46-013-CM ）
19.二甲亚砜（DMSO）（杂交瘤级）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650 ）
20.MojoSort TM小鼠 Ly-6G 选择试剂盒（ BioLegend ，目录号： 480123)
21.MojoSort TM缓冲液（5 × ）（ BioLegend ，目录号： 480017)
22.MojoSort TM磁铁（ BioLegend ，目录号： 480020)
23.抗CD11b磁性颗粒DM Clone M1/70（RUO）（BD IMag TM ，目录号：558013）
24.来自花生（花生）的凝集素PNA 凝集素（Sigma-Aldrich，目录号：L-08881）
25.邻苯二甲酸二丁酯（Sigma-Aldrich，目录号： 524980）
26.1步固定/裂解溶液（10×）（ eBioscience TM ，目录号：00533354）
27.BD IMag TM缓冲器 (10×)（BD，目录号： 552362）
28.红细胞裂解缓冲液（10×）（ BioLegend ，目录号： 420301）
29.特鲁染色 FcX TM （抗小鼠CD16/32）抗体（ BioLegend ，目录号： 101320）
30.可固定活力染料eFluor 455UV（ eBioscience TM ，目录号： 65-0868）
31.流式细胞术用抗体（见表1）
32.细胞示踪染料（参见表 2）

表1.通过流式细胞术对骨髓细胞进行离体染色的抗体和探针
抗体名称（库存集中度）前/后 (纳米)工作浓度
μg /管（ μL ）克隆品牌和目录号
抗小鼠 CD3-FITC (0.5 mg/mL)495/5191.0 (0.25)17A2生物传奇, 100204
抗小鼠 CD19-FITC (0.5 mg/mL)495/5190.125 (0.25)1D3/CD19生物传奇，152404
抗小鼠NK-1.1-FITC (0.5 mg/mL)495/5190.25 (0.25)PK136生物传奇，108706
抗小鼠 CD45-PE-Cy7 (0.2 mg/mL)488、532、561/7670.125 (0.5)30-F11生物传奇，103114
抗小鼠/人 CD11b-eFluor 506
（0.2 毫克/毫升）419/5080.125 (0.5)M1/70电子生物科学，69-0112-82
抗小鼠 Ly6C-BV 785 (0.2 mg/mL)405/7850.25 (0.5)HK1.4生物传奇，128041
抗小鼠 Ly6G–APC-Cy7 (0.2 mg/mL)650、755/7670.25 (0.5)1A8生物传奇，127624
抗小鼠 CD11c-BV 605 (0.2 mg/mL)405/6050.25 (1)N418生物传奇, 117334
活力（固定活力染料 - eFluor 455）（100 次测试）355/4500.1 (0.01)不适用电子生物科学，65-0868
注意：建议进行抗体滴定以获得最佳性能。避免将标记的样品直接暴露在光线下。尽快在 4°C 下一周内用流式细胞仪采集样品（最好在 24 小时内）。使用 FMO、未染色的对照（无细胞痕迹对照组织）进行门控。对于骨髓细胞表型分析，请使用与流式细胞仪兼容的荧光染料。使用FluoroFinder或其他软件进行面板设计（根据流式细胞仪的配置避免荧光光谱重叠）。

表 2. 研究中使用的细胞示踪染料；列出的染料可用于追踪细胞或寄生虫*
细胞示踪剂名称
（库存集中度）贮存激发/发射（纳米）最终浓度品牌和目录号
CellTracker TM橙色 CMTMR (10 mM)-20℃541/565纳米2.5μM _英杰公司 C2927
CellTracker TM绿色 CMFDA (10 mM)-20℃492/517纳米5μM _英杰公司 C2925
CellTrace TM远红 (1 mM)-20℃630/661纳米1μM _英杰公司 C34572
PKH26 红色荧光细胞连接器4℃551/567纳米4μM _Sigma-Aldrich MINI26-1KT
PKH 67 绿色荧光细胞连接剂4℃490/502纳米4μM _Sigma-Aldrich MINI67-1KT
* mCherry (5871/610 nm)

解决方案

1.1× 磷酸盐缓冲盐水 (1× PBS)（参见配方）
2.1× PBS 与 0.1% BSA：FACS 缓冲液（参见配方）
3.1× PBS + 2% FBS（参见配方）
4.1× 1 步固定/裂解溶液（参见配方）
5.1× RBC 裂解缓冲液（参见配方）
6.1× BD IMag TM缓冲器（参见配方）
7.完整的 M199 培养基（参见食谱）
8.完整的 RPMI 1640 培养基（参见配方）
9.胶原酶 D +释放酶TL 混合物（参见食谱）
10.胶原酶 D 溶液 + DNase I（参见配方）

食谱

1.1× 磷酸盐缓冲盐水 (1 × PBS)，来自 10× PBS（4 °C 储存）
试剂最终浓度数量
10 × PBS1 ×100毫升
蒸馏水_ _不适用900毫升
全部的不适用1,000 毫升

2.1 × PBS，含 0.1% BSA 。 FACS 缓冲液（4°C 储存）
试剂最终浓度数量
1 × PBS1 ×1,000 毫升
牛血清白蛋白0.1%1克
全部的不适用1,000 毫升

3.1× PBS + 2% FBS （4℃保存）
试剂最终浓度数量
1×PBS1×980毫升
100% 胎牛血清2%20毫升
全部的不适用1,000 毫升

4.1× 1 步固定/裂解溶液（4 °C 储存）
试剂最终浓度数量
10× 1 步固定/裂解1×100毫升
蒸馏水_ _不适用900毫升
全部的不适用1,000 毫升

5.1× RBC 裂解缓冲液（4 °C 储存）
试剂最终浓度数量
10×红细胞裂解缓冲液1×10毫升
蒸馏水_ _不适用90毫升
全部的不适用100毫升

6.1× BD IMag TM缓冲液（4°C 储存）
试剂最终浓度数量
10× BD IMag TM缓冲器1×10毫升
蒸馏水_ _不适用90毫升
全部的不适用100毫升

7.完整的 M199 培养基（4°C 储存）
试剂最终浓度数量
M199中号不适用500毫升
胎牛血清10%50毫升
腺嘌呤1%6毫升
血红素0.1%1.2毫升
青霉素链霉素溶液1×6毫升
全部的不适用563.2 毫升

8.完整的 RPMI 1640 培养基（4 °C 储存）
试剂最终浓度数量
RPMI培养基不适用445毫升
胎牛血清10%50毫升
青霉素链霉素溶液1×5毫升
全部的不适用500毫升

9.胶原酶 D + Liberase TL 混合物（-20 °C 保存）
试剂最终浓度数量
20 毫克/毫升胶原酶 D2毫克/毫升2毫升
1 mg/mL释放酶TL160微克/毫升640微升
RPMI完全培养基不适用17.36毫升
全部的不适用20毫升

10.胶原酶 D 溶液 + DNase I（-20 °C 保存）
试剂最终浓度数量
20 毫克/毫升胶原酶 D2毫克/毫升5毫升
2 毫克/毫升 DNA 酶 I20微克/毫升500微升
1 M HEPES pH 7.410毫米500微升
5M 氯化钠150毫米1.5毫升
1M氯化钾5毫米250微升
0.5M 氯化镁21毫米100微升
0.5 M CaCl 21.8毫米180微升
蒸馏水_ _不适用42.5毫升
全部的不适用50毫升

实验室用品

1.带针头的超细胰岛素注射器（BD，目录号：324920）
2.无菌 5 mL 聚苯乙烯圆底管（Falcon，目录号：352054）
3.无菌 70 μm细胞过滤器（任何供应商）
4.无菌 15 mL 聚丙烯离心管（任何供应商）
5.无菌 50 mL 聚丙烯离心管（任何供应商）
6.无菌无核酸酶过滤吸头（10、200 和 1,000 μL ）（任何供应商）
7.细胞培养板，不同尺寸，6、12 和 24 孔平底，TC 处理，无菌（任何供应商）
8.通风烧瓶表面积 25 cm 2和 175 cm 2 （任何供应商）
9.显微解剖剪刀（Millipore，Sigma，目录号：S3271）
10.剪刀柄镊子（Millipore，Sigma，目录号：Z168831）
11.一次性塑料血清移液器，无菌，独立包装，10 mL、25 mL 容量（任何供应商）

设备

1.具有至少两个激光器和七个参数分析能力的流式细胞仪（BD LSRFortessa II TM细胞分析仪，BD Biosciences；SE500， Stratigm ）
2.Eclipse TE300 显微镜（尼康）

软件和数据集

1.面板生成器、 Fluorofinder （2014 年 3 月，免费）
2.FlowJo V10.6 软件（V10.6，2019，需要许可证）
3.BD FACSDiva 9.0（流式细胞仪软件）
4.GraphPad Prism 9.0 软件（2020 年 9 月，需要许可证）

程序

A.杜氏利什曼原虫和骨髓细胞的标记

1.选择杜氏乳杆菌后循环前鞭毛体（改编自 Sacks 和 Melby，2015）。此选择足以表达mCherry荧光蛋白的杜氏乳杆菌（图 1）。

图 1.杜氏利什曼原虫感染性前鞭毛体的代表性荧光信号。 A· L·多诺瓦尼表达mCherry荧光蛋白（红色）。 B. L. donovani用 PKH67（绿色）染色（步骤 A2）。如步骤 A1 中所述选择寄生虫。图像使用 Nikon Eclipse TE300 显微镜以 20 ×拍摄。

a.生长杜氏乳杆菌(MHOM/SD/00/S-2D)：将约 40 mL 处于培养对数期（3-4 天）的寄生虫以 1 × 10 6 个细胞/mL 添加到 400 mL 完全 M199 培养基中。在 27 °C 下孵育 5-6 天（直至稳定期）。
b.g离心 10 分钟收获寄生虫。
注意：除非文本另有说明，所有离心步骤均在室温 (RT) 下进行。
c.弃去上清液。警告！小心不要打扰颗粒。
d.将沉淀重新悬浮在 10 mL 的 RPMI 介质中，并取 10 μL来计数寄生虫。如果寄生虫数量过多且难以在 Neubauer 相机中计数，请使用稀释剂。
e.g离心10 分钟。
f.弃去上清液并重悬于 1× PBS 中，直至终浓度为 1 × 10 8寄生虫/ mL。
g.添加 50 μg /mL的PNA 或 10 μL / mL 。
h.涡旋 30 秒，并在室温下孵育 30 分钟（无需搅拌）。
i.×离心 g 2 分钟（低速）。
j.将上清液放入新管中。上清液含有后循环前鞭毛体。
k.用 10 mL 的 RPMI 介质清洗寄生虫。继续计算存活的寄生虫。寄生虫活力通过寄生虫的运动性来评估。
l.要计数活寄生虫，请将步骤 A1k 中的 10 μL寄生虫放入盖有盖玻片的 Neubauer 室中，并对活动寄生虫进行计数。对身体或鞭毛有任何运动的寄生虫进行计数。然后，使用以下公式计算寄生虫的数量：
每毫升寄生虫数=每象限活动寄生虫数×稀释倍数× 10,000。
m.700× g离心 10分钟。
n.以所需浓度（通常 1 × 10 6寄生虫/10 μL PBS）重悬寄生虫以进行皮内（ID）接种或 2 × 10 7寄生虫/ mL。如果寄生虫没有荧光，则继续用 PKH26/67 染色（步骤 A2）。
笔记：当杜氏乳杆菌菌株表达荧光蛋白 ( mCherry )时，不需要进行寄生虫染色。在这种情况下，请跳过步骤 A2。樱桃_ 杜氏乳杆菌寄生虫已准备好进行皮内感染（步骤 A7）。要进行皮内接种，请检查Machholz 等人。（2012）。
2.使用 PKH26（红色）或 PKH67（绿色）对皮内感染进行寄生虫染色（根据制造商的方案进行修改）：
a.× 10 7 个单一寄生虫的悬浮液放入 15 mL 聚丙烯管中，并使用不含血清或 1× PBS 的培养基洗涤一次。
b.×离心寄生虫在室温下g 5 分钟，形成松散的颗粒。
c.，小心不要除去任何细胞，但留下的上清液不超过 25 μL 。
d.通过向沉淀中添加 1 mL 稀释剂 C 来制备2 ×寄生虫悬浮液，并通过轻轻移液重悬以确保完全分散。警告！不要涡旋，也不要让细胞长时间在稀释液 C 中静置。
e.染色前，在聚丙烯离心管中将 4 μL PKH26添加到 1 mL 稀释剂 C 中，在稀释剂 C 中制备 2 × 染料溶液 (4 μM) ，并充分混合以分散。
f.将 1 mL 2 ×寄生虫悬浮液快速添加到 1 mL 2 ×染料溶液中，并立即通过移液混合样品。混合指定体积后的最终浓度将为 1 × 10 7 个细胞/mL 和 2 μM PKH26/67。
g.将寄生虫/染料悬浮液在黑暗中于 27°C（或最适合您使用的细胞）下孵育 5 分钟，并定期混合。由于染色速度非常快，因此较长的时间并没有任何优势。
h.通过添加等体积 (2 mL) 的血清或 10 mL 完全培养基来停止染色，并孵育 1 分钟以结合过量的染料。
i.×离心寄生虫室温下g 10 分钟，小心除去上清液。将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全培养基中，转移至新鲜无菌锥形聚丙烯管中，400 ×离心 g在 RT 下 5 分钟，并用 10 mL 完全培养基洗涤寄生虫颗粒两次以上，以确保去除未结合的染料。
j.最后一次洗涤后，将寄生虫沉淀重新悬浮在 10 mL 的完整 RPMI 培养基中，以评估细胞回收率和细胞活力。可选：在荧光显微镜中检查荧光强度（图 1）。继续计数活寄生虫（步骤 A1l）。
k.至10 μL体积中所需的活寄生虫终浓度（1 × 10 6 /10 μL 1× PBS）。
注：上述程序使用 2 mL 作为最终染色体积，其中包含终浓度为 2 μM的 PKH26/67 和 1 × 10 7 个细胞/ mL。将体积调节至所获得的寄生虫的浓度。
可选： L. donovani 可以使用表达mCherry荧光蛋白（图 1A）代替用荧光细胞示踪剂标记的后循环前鞭毛体。感染性后循环前鞭毛体的选择应如前所述进行。
3.骨髓单核细胞的分离：
a.根据批准的 IACUC 方案（暴露于二氧化碳，然后颈椎脱位）对小鼠进行安乐死，然后进行骨髓采集。将小鼠放入装有 70% 酒精的容器中消毒 30 s。在层流罩中工作。
b.使用剪刀和镊子去除小鼠的股骨和胫骨。将组织放在含有 1 mL RPMI 完整介质的板上。将组织放在冰上，直到所有小鼠都准备好。
c.使用无菌器具，从骨头上取出肌肉，并将干净的骨头放入培养皿中。（估计一根小鼠股骨可产生大约 100 万个单核细胞。）
d.骨髓细胞的获取：使用无菌器具，用剪刀尽可能靠近关节剪断骨头的两端。将冰冷的 RPMI 完全培养基填充到 1 mL 胰岛素注射器中，将注射器针头插入骨髓腔末端，并将骨髓冲洗到冰上的 15 mL 离心管中。冲洗五次 (5 mL)，直至骨头完全变白。通过上下移液打碎任何细胞团。或者，将骨头放入无菌研钵中，然后用杵小心地敲碎骨头。将骨碎片转移到含有 1 mL Accutase溶液的无菌培养皿中。 37°C 孵育 5 分钟。添加 1 mL 培养基，并将材料从骨骼中冲洗出来（通过上下移液直至细胞从骨骼上分离）。如有必要，重复此操作，直到微红的骨头变成白色。
e.μm细胞滤网过滤，获得单细胞悬液，将其置于新鲜的 15 mL 离心管中，500 ×离心 g在室温下 5 分钟。丢弃上清液。
f.将骨髓细胞沉淀重悬于 1–3 mL 1× RBC 裂解缓冲液中，并在 RT 下孵育 5 分钟。
g.添加 10 mL 1× PBS + 2% FBS 停止裂解反应。立即500 ×离心 g在室温下 5 分钟。倒出上清液并将细胞重悬于 RPMI 完全培养基 (5 mL) 中。
h.MojoSort TM小鼠 Ly-6G 选择试剂盒继续去除中性粒细胞（步骤 A4）。
注意：细胞纯化试剂盒根据待追踪细胞谱系的不同而不同。
4.使用MojoSort TM小鼠 Ly-6G 选择试剂盒（根据制造商的方案修改）去除中性粒细胞。此步骤排除中性粒细胞并富集样品中的单核细胞。
a.将上述获得的骨髓细胞300 ×离心 g 5 分钟，然后重悬于 4 mL 1× MojoSort缓冲液中。用 0.4% 台盼蓝计数细胞，并在 1× MojoSort缓冲液中调整至 1 × 10 8细胞/mL 。
b.将 100 μL细胞悬液（10 7 个细胞）放入新的 5 mL 聚丙烯管中。每 100 μL细胞悬液（10 7 个细胞/100 μL ）添加 10 μL生物素抗小鼠 Ly-6G 抗体（克隆 1A8 ）。充分混合并在冰上孵育 15 分钟。
c.以最大速度涡旋 10 秒，重新悬浮链霉亲和素纳米珠，并向细胞悬浮液中添加 10 μL链霉亲和素纳米珠。充分混合并在冰上孵育 15 分钟。
d.孵育时间后，添加 2.5 mL MojoSort缓冲液。
e.将管子放入磁铁中 5 分钟。
f.可选：在将管放入磁铁之前取一小部分以监测纯度和产量。
g.将液体倒入新的 5 mL 管中，转移仍处于悬浮状态（未由磁铁固定）的未标记细胞组分。未标记的部分是感兴趣的细胞。
h.将标记的细胞重新悬浮在MojoSort缓冲液中，并对标记的细胞重复步骤 A4e-A4g 至少两次。
i.汇集未标记的分数。
j.继续用 CD11b 磁性颗粒 DM 进行单核细胞阳性选择（步骤 A5）。
注意：当使用少于 10 7 个细胞时，请使用 10 7 个细胞的指定体积。要扩大规模，请按比例调整细胞和珠子的体积。例如，添加 100 μL纳米珠以在 1 mL MojoSort缓冲液中分离 1 × 10 8个细胞。为了最大限度地提高产量，您可以通过上下吹打溶液来破坏聚集体。使用 70 μm细胞滤网过滤悬浮液。
5.用 CD11b 磁性颗粒 DM 阳性选择单核细胞（根据制造商的方案进行修改）。
a.将先前程序中未标记的阴性分数以 400 × g离心 5 分钟。
b.将细胞重悬于 3 mL 的 1× BD IMag缓冲液中。用 0.4% 台盼蓝计数细胞，并在 1× BD IMag缓冲液中调整至 1 × 10 7细胞/mL 。
c.× g离心5 分钟，小心吸出所有上清液。
d.以最大速度涡旋 BD IMag抗 CD11b 磁性颗粒 DM。每 1 × 10 7总细胞添加 50 μL颗粒。充分混合。在 4 °C 下冷藏 30 分钟。
e.使用 1× BD IMag缓冲液将 BD IMag颗粒标记体积达到 1 × 10 7 –8 × 10 7细胞/mL ，并立即将管放在细胞分离磁体上。室温孵育 8 分钟。
f.将管子放在细胞分离磁体上，并用巴斯德吸管小心地吸出上清液。该上清液含有阴性部分。（这一次，我们想要 CD11b 正分数，它附着在磁铁上。）
g.从细胞分离磁体中取出管，并添加 1×BD IMag缓冲液至与步骤 A5e 中相同的体积。通过短暂移液轻轻重悬细胞，然后将管放回细胞分离磁体中再 4 分钟。
h.将管子放在细胞分离磁体上，小心吸出上清液并丢弃。
i.再重复一次步骤 A5g 和 A5h。
j.后，将阳性组分重悬于 1× PBS 中，并将纯化的单核细胞调整至 1 × 10 6 个细胞/500 μL ，用于细胞示踪剂染色（步骤 A6）。
6.使用细胞示踪剂进行单核细胞染色：
a.使用配方 9 中的任何细胞示踪剂标记单核细胞。但是，请确保激发/发射波长与寄生虫不同。为此，将冻干的 CMTMR（橙色）或 CMFDA（绿色） CellTracker TM溶解在高质量 DMSO 中以获得 10 mM 储备液，或用高质量 DMSO稀释 Far-Red CellTrace TM以获得 1 mM 储备液。
b.μL无血清培养基或 1× PBS中将储备液稀释至 2 ×工作浓度 2.5 μM CMTMR（橙色）、5 μM CMFDA（绿色）或 1 μM Far-Red CellTrace TM （图 2）。为此，将 0.5 μL CMTMR、1 μL CMFDA 或 2 μL Far-Red 添加到 500 μL无血清培养基或 1× PBS 中。涡流。
注意：细胞示踪染料和 PKH 连接器对于追踪淋巴细胞和寄生虫同样有用。

图 2. 用细胞示踪剂染色的单核细胞的代表性荧光信号。 A. 小鼠骨髓单核细胞用 5 μM CMFDA 染色（绿色）。 B. 单核细胞用 1 μM远红细胞痕迹（洋红色）染色。如步骤 A3-A6 中分离和标记单核细胞。图像使用 Nikon Eclipse TE300 显微镜以 40 ×拍摄。

c.将 2 ×细胞追踪器工作溶液加热至 37 °C，并向步骤 A5 中获得的细胞添加 500 μL （1 × 10 6 个细胞，溶于 500 μL 1× PBS），最终体积为 1 mL。通过倒置混合管。
d.2避光条件下孵育 20 分钟。
e.向细胞中加入原染色体积五倍的完全培养基，孵育 5 分钟。此步骤去除溶液中残留的任何游离染料。计数细胞。
f.×离心细胞 g 5 分钟。用移液器小心地除去所有上清液。
g.添加 RPMI 完全培养基，将细胞调整至每 10–20 μL 2.5 × 10 6 –4 × 10 6 。
可选：检查显微镜上的荧光信号（图 2）。
7.细胞示踪剂标记的单核细胞的皮内转移和使用荧光杜氏乳杆菌的皮内感染（体内）。
a.细胞示踪剂标记的单核细胞（步骤A6）和荧光寄生虫（ mCherry ）或用细胞示踪剂预先标记（步骤A2）。
b.将寄生虫（1 × 10 6寄生虫/10 μL ）放入超细胰岛素注射器（避光）中。
c.× 10 6 –4 × 10 6每 10 μL ）转移细胞示踪剂标记的单核细胞（图 2）。
d.在每只脚（背后爪）或根据需要皮内接种荧光寄生虫（1 × 10 6 /10 μL ）。
e.转移细胞示踪剂标记的细胞并感染后二十四至四十八小时，继续进行腘淋巴结和脾脏分离，以进行流式细胞术采集和分析（遵循 B 和 C 部分）。

B.体内样本采集和组织处理

1.从皮肤中分离细胞
a.如前所述安乐死小鼠并继续收集皮肤组织。为此，用镊子夹住皮肤，并用手术刀切割受感染后爪的皮肤。
注意：收集引流淋巴结和脾脏并按照 C 节进行处理。
b.将接种部位组织（后爪皮肤）放入 24 孔板中，置于冰上（4°C）的 1 mL 完整 RPMI 介质中。
c.将皮肤组织转移至 500 μL 2 mg/mL 胶原酶 D + 160 μg /mL Liberase （参见配方）。将上述步骤 (B1b) 中的完整介质保留在 4°C 下，以在步骤 B1e 中使用。
d.用刀片或剪刀 (< 2 mm) 将组织切成小块，在 37°C 下孵育30 分钟，如果有带摇床的培养箱，则以 200 rpm 混合。或者，在孵育期间每 5 分钟翻转一次以混合管。
e.添加上面保存的 1 mL 完全培养基 (B1c) 以停止酶消化 (B1d)。
f.将细胞悬浮液与悬浮液中的任何组织收集在一起，并用 1 mL 注射器柱塞将组织压过 70 μm细胞过滤器。使用另一个孔或小培养皿收集细胞悬浮液。
g.将 1 mL 培养基添加到细胞过滤器中，以帮助通过细胞。
h.将细胞匀浆转移至 5 mL Falcon 管中。
i.×离心沉淀细胞 g ，4°C 7 分钟。
j.去除上清液并添加 1 mL 的 FACS 缓冲液（参见配方）。
k.用 0.4% 台盼蓝（使用 1:10 稀释）对细胞进行计数。
l.300 ×离心细胞 4℃ 7 分钟，除去上清，加入 FACS 缓冲液将细胞计数调整至每管1 × 10 6 / 50 μL 。
m.继续进行流式细胞术的细胞表面染色（见下文）。
注意：使用未感染的（无寄生虫的染色样品）作为对照来建立受感染细胞的流式细胞术阈值[点图感兴趣的细胞群的前向散射（FSC）与寄生虫的荧光通道]。
2.从脾脏和引流淋巴结 ( dLN )中分离细胞
a.用 70% 酒精对安乐死的小鼠进行消毒。
b.继续在小鼠左侧、肋骨下方高处、脾脏所在的位置做一个切口。收集脾脏并将其放入带有 RPMI 完全培养基的培养皿中，温度为 4°C。
c.用剪刀在左右后腿上做一个切口。向上推膝盖以暴露腘窝并使用镊子，小心地取出引流感染部位的腘淋巴结（图3）并将其放入带有RPMI完全培养基的培养皿中，温度为4°C。使用立体镜作为替代方案，以促进淋巴结的可视化。

图 3. 小鼠腘淋巴结 ( pLN ) 定位。 A. 腘淋巴结绘图。 B. 使用立体镜进行定位和隔离的pLN （圆点）照片。 C.立体镜下未感染的pLN （左）和杜氏利什曼原虫感染的pLN （右）视图之间的比较。

d.将组织转移到装有胶原酶 D 溶液 + DNase I 的培养皿中（参见食谱）。
e.使用 1 mL 注射器向每个脾脏注射 1 mL 胶原酶 D 溶液 + DNase I，然后使用锋利的剪刀将组织切成更小的 (1 mm) 块。对于腘淋巴结，请跳过此步骤。
f.2下孵育 30 分钟。
g.通过添加 1 mL 的 RPMI 完整介质来灭活反应。
h.将组织碎片的悬浮液转移到置于培养皿上的70 μm细胞过滤器中。将 1 mL 的 1× PBS 添加到过滤器中，并用 1 mL 注射器柱塞轻轻地将组织压过过滤器。
i.将细胞悬浮液转移至 5 mL 聚丙烯管中。
j.×离心 g 5 分钟。丢弃上清液。对于淋巴结，跳过步骤 B2k–m。
k.为了消除脾组织中的红细胞，将沉淀重悬于 1 mL 1× RBC 裂解缓冲液中 5 分钟。
l.添加 3 mL 1× PBS + 2% FBS 停止裂解反应。
m.×离心 g在室温下 5 分钟。倒出上清液。
n.将细胞重悬于 300 μL至 1 mL PBS 中，将细胞浓度调整至 1 × 10 6 个细胞/50 μL 。
o.继续进行细胞表面染色以进行骨髓细胞表型流式细胞术。
p.最后，进行流式细胞仪采集和分析。
注意：如果您处理的是小鼠组，可以使用 24 孔板在 4 °C 下保存脾脏或其他器官。然而，重要的是要快速工作以避免细胞死亡。

C.收获细胞的表型分析

1.用于骨髓细胞表型分析的细胞表面染色流式细胞术
a.将样品调整为 1 × 10 6 /50 μL的 1× PBS（B 部分）。将 50 μL细胞悬浮液分配到 5 mL 聚丙烯管中。
b.每管添加 50 μL含有 FC 块抗体（稀释度 1:100）的 1× PBS 和 Fixable Viability Dye eFluor 455UV（稀释度 1:1,000）。仅将 PBS 添加到一根未染色的对照管中。
注意：活力染色按照制造商的说明在 1× PBS 中进行；否则使用 FACS 缓冲液。
c.4°C 避光孵育 20 分钟。
d.使用 2 mL 的 FACS 缓冲液洗涤细胞并以 300 ×离心 g在 4°C 下保持 5 分钟。倒出上清液。
e.将样品重新悬浮在 50 μL FACS 缓冲液中，每管使用抗体染色混合物，如下所示。保留管：未染色并根据门控需要进行 FMO 控制。
f.准备抗体染色混合物以识别感兴趣的细胞群。在这种情况下，我们使用一个面板来识别主要的骨髓细胞群：单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞和单核细胞衍生的树突状细胞（参见表 1 中建议的流式细胞术面板）。标记物的数量取决于流式细胞仪的配置和可用的抗体。在冰上避光孵育 30 分钟。
g.孵育后，添加 3 mL FACS 缓冲液并以 400 ×离心 g在 4°C 下保持 5 分钟。
h.弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 300 μL 1× Fix/Lyse 中。
i.在黑暗中室温孵育 15 分钟。
j.添加 3 mL 的 FACS 缓冲液，并在 4°C 下以 400 × g离心 5 分钟。
k.用 3 mL 的 FACS 缓冲液清洗颗粒。
l.将细胞沉淀重悬于 300 μL FACS 缓冲液中。
m.将固定细胞储存在 4°C 的黑暗中，以进行流式细胞仪采集和分析。
注意：确保流式细胞术分析中包含荧光减一 (FMO)对照。
2.流式细胞仪采集和分析
a.对于 BD LSRFortessa II TM细胞分析仪，打开机器并检查液位。设置仪器设置（如果用户不熟悉流式细胞术，可能需要样品采集和分析的帮助）。继续获取单色补偿控制、FMO 控制和负控制。
b.收集 100,000 到 1,000,000 个事件以捕获足够的受感染细胞进行分析。
注意：要生成补偿矩阵，最好使用补偿珠 ( UltraComp 电子珠，赛默飞世尔科技）。为了补偿细胞示踪剂，有必要使用从荧光细胞示踪剂标记中保留的细胞或表达荧光蛋白的寄生虫（如果是这种情况）。

数据分析

流式细胞术分析

1.对于流式细胞术分析，我们建议使用FlowJo 。每个仪器都可能提供基本分析功能。
2.要分析FlowJo中的数据，请遵循图 4 中的门控方案（改编自罗斯等人，2012；奥索里奥等人，2023）。我们根据要分析的细胞群执行不同的门控策略。

淋巴组织上受感染骨髓细胞中荧光利什曼原虫的代表性门控策略。 A. 评估引流淋巴结 ( dLN ) 和脾脏中感染细胞的代表性门控策略（分别在感染后 6 小时和 12 小时评估）。 B.确定用感染利什曼原虫的细胞示踪剂染色的细胞的门控策略。转移 48 小时后，用荧光利什曼原虫寄生虫（ mCherry + 或 PKH26 细胞示踪剂 +）呈阳性的远红细胞示踪剂标记的单核细胞的代表性点图皮肤（左）或淋巴结（右）。 Ly6G - CD11b +细胞的点图（门 A6）。该阈值建立在 FMO 对照和未感染组织对照的荧光信号之上。请参阅数据分析中的详细门控策略。
3.用于识别中性粒细胞、单核细胞、传统树突细胞 ( cDC ) 和单核细胞衍生树突细胞 ( MoDC )（ dLN和脾）中细胞示踪剂标记的利什曼原虫的门控策略：首先，FSC-A 和 SSC-A 上的门控事件 (A1) ），然后对 FSC-A 与 FSC-H 进行门控以排除双峰 (A2)。对细胞进行亚门控以排除 455 UV (A3) 中的死细胞，然后排除FITC 转储通道中的T 细胞 (CD3 + )、B 细胞 (CD19 + ) 和 NK 细胞 (NK-1.1 + )，用于 T、B、和 NK 细胞 (A4)。白细胞 CD45 + (PE-Cy7) 是亚门控的 (A5)。然后，使用Ly6G + (APC-Cy7) 的表达对 CD11b + ( eFluor 506)群体进行亚门控，以确定单核细胞 (CD11b + Ly6G - ) (A6) 或中性粒细胞 (CD11b + Ly6G + )。使用CD11c +和 CD11b +的表达对cDC和MoDC进行亚门控，以确定cDC (CD11c + CD11b - ) (A7) 或MoDC (CD11c + CD11b + )。单核细胞被确定为 CD11c - CD11b + (A9)。根据 Ly6C 表达，单核细胞可以进一步分类为常驻单核细胞 (Ly6C low/- ) 或炎症单核细胞 (Ly6C hi+/int ) (A10)。
4.利什曼原虫荧光（ mCherry或用细胞示踪剂如 PKH26 标记）进行子门控，以识别受感染的细胞（利什曼原虫）（A8 和 11）。
5.同样，可以使用上面解释的门控策略来识别分离、标记和转移的单核细胞（图 4B）。此处，在将单核细胞亚门控为 CD11b + Ly6G - （A6 或 B6）后，用远红细胞示踪剂标记的转移单核细胞用荧光利什曼原虫门控。双重染色表明转移的单核细胞感染了利什曼原虫寄生虫。

协议验证

这些程序的部分内容之前已经过标准化和验证（Ibrahim 等人，2013 年和 Osorio 等人，2023 年）。对于流式细胞术分析，阈值被确定为高于 FMO 对照和未感染组织对照的荧光信号。使用 GraphPad Prism 9.0 软件 (GraphPad, LLC) 分析数据。

一般注意事项和故障排除

故障排除（表 3）

表 3. 故障排除
问题可能的原因解决方案
使用胶原酶 D 或其他蛋白酶后细胞聚集使用酶降解延长时间•减少细胞暴露于胶原酶 D 溶液的时间
•确保将 DNase I 添加到胶原酶 D 溶液中，以去除受损组织中的游离 DNA
未实现细胞/细胞悬液的不完全解聚特性使用酶降解时间短或过滤效果不佳当细胞聚集发生时，将细胞悬浮液通过 70 或 50 μm 的过滤器会有所帮助。这也可以避免使用流式细胞仪时发生堵塞
赔偿问题荧光染料面板设计不足

缺乏控制•使用专用软件（ Fluorofinder ）设计您的荧光染料面板。向流式细胞仪寻求帮助
•减少荧光染料的数量以使实验方案适应您的仪器配置。如有必要，重新配置面板
•使用无细胞痕迹阴性组织和FMO 对照进行阈值和分析。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院 (NIH/NISID) 向 PCM 授予的编号 AI107419 和 AI13012 的支持。我们感谢德克萨斯大学医学分部动物资源中心的工作人员为实验动物提供的优质护理。该协议改编自不太详细的原始协议（Ibrahim 等人，2013 年和 Osorio 等人，2023 年）。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益。

道德考虑

该方案得到了德克萨斯州加尔维斯顿德克萨斯大学医学分部机构动物护理和使用委员会的批准（方案号 1306027）。

参考

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补充资料

在此处下载以下支持信息：
1.图S1。光激活小鼠 (PA-GFP) 中存在绿色荧光蛋白 (GFP)
2.视频S1。单细胞光活化
3. 表 S1。在光转换模型 PA-GFP 中测试的条件，用于识别皮肤中光激活的迁移细胞。大多数条件没有表现出明显的光转换。