材料与试剂

材料包括从 Thermo Inc.（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）获得的一次性无菌物品，例如管道和细胞培养用品。表 1 列出了所使用的试剂以及工作浓度。

表 1 .试剂
姓名试剂规格工作浓度提供者产品＃
推定的 PD 合成肽（N/C-生物素标记）测定底物/诱饵
HPLC级50 µg /下拉反应 (rxn)新英格兰肽 (MA)风俗
合成
泛素，人类合成Ub-部分供体1微克/次波士顿生化U-100H
Tris-HClpH缓冲液10毫米西格玛奥德里奇77-96-1
公共广播公司pH缓冲液1× 至最终接收卷。西格玛奥德里奇D1408
ATP磷酸部分供体4毫米西格玛奥德里奇A1852
数码地面电视还原剂4毫米西格玛奥德里奇D9779
二氯化锰Prot 激酶辅因子 (Mn++)2毫米西格玛奥德里奇1375137
氯化镁2Prot 激酶辅因子 (Mg++)2毫米西格玛奥德里奇1374248
NP40Rxn/下拉促进者0.05%西格玛奥德里奇9036-19-5
D5/W5 抑制剂混合物蛋白酶抑制剂参见食谱 2
万花筒预染蛋白质标记物宽范围可见
蛋白质标记6 µL/泳道伯乐公司1610324

WB-Master 蛋白质标准品化学发光
敏感标记10 µL/泳道金斯瑞M00521

SuperSignal TM West Femto 化学发光底物化学发光
超灵敏
试剂系统0.5 mL/试剂/
膜条
费舍尔
34095
抗原（/Ab 克隆）动物来源/克隆性工作浓度提供者克隆/产品#
泛素 (P4D1)小鼠单克隆1:1,000圣诞老人P4D1/sc8017
抗小鼠 IgG-HRP鸡单克隆1:2,000圣诞老人SC2954
抗 IgGk-LC-HRP小鼠单克隆1:1,000圣诞老人SC156102
链霉亲和素磁珠不适用2微升/毫升金斯瑞L00936

食谱

PTMe Pull-down 方法的关键组成部分在于下文所述的同名反应/孵育混合物。

1.PTMe 下拉反应混合物
PTMe 反应 (rxn) 库存浓度每次治疗的体积最终浓度
N-生物素 pDegron-肽偶联带 STP 磁珠（见正文）不适用50 μg -STP 结合/rxn
Tris-HCl，pH 7.580微升10毫米
DTT，100 毫米8微升4毫米
ATP，100 毫米8微升4毫米
MnCl 2 ,100 mM4微升2毫米
MgCl 2 , 100 mM4微升2毫米
人泛素1 µg / µL1微升1微克
细胞提取物（2.5–3.5 µg / µL ）高达 95 μL0.2–0.3 毫克
PBS，0.05% NP40
+D5/W5 蛋白酶抑制剂混合物至 200 μL （根据需要）1 ×

2.蛋白酶及相关活性抑制剂库存

水溶性抑制剂(W5)
抑制剂[库存]µL 待生产库存 [工作中]
为了 5 mL 下拉缓冲器[在职的]
氧化钠30.2M25微升 1毫米
苯甲酰胺0.25M40微升 2毫米
-磷酸甘油1M50微升 10毫米
氟化钠1M50微升 10毫米
数码地面电视1M5微升 1毫米*
小计量（165 µL）-
摩尔等级 H 2 O 至10 × 483.5微升不适用
PBS，0.05% NP40不适用4,500 µL 1 ×

DMSO 可溶性抑制剂原液 (D5)
抑制剂[库存]µL 待生产库存 [工作中]
5 mL 下拉缓冲器[在职的]
胃酶抑素10毫克/毫升5微升 10微克/毫升
亮肽素10毫克/毫升5微升 10微克/毫升
抑肽酶10毫克/毫升5微升 10微克/毫升
冈田酸100 µM5微升 100纳米
PMSF0.5M5微升 0.5毫米
小计量（25 µL）-
二甲基亚砜 10 ×487.5微升不适用
PBS，0.05% NP40不适用4,500 µL 1 ×

建议制备较大体积的 10 × W5 和 D5 库存，制成 0.5 mL 等分试样，并保存以进行单次快速解冻（水浴，室温）。在-20 °C 下保存三个月或在-80°C 下保存六个月。
*将 DTT 单独添加到含有水溶性和 DMSO 可溶性蛋白酶抑制剂的最终缓冲液中，以产生含有 1 mM DTT 的缓冲液。
在无菌去离子 H 2 O 中稀释 1倍并使用 0.001% (w/w) Tween 20 去污剂制备。
注：所有试剂均购自 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

设备

1.细胞培养设施（SterilGard III 组织培养罩；CO 2自动调零组织培养箱，Thermo Scientific，Waltham，MA 或类似型号）
2.4 ℃冰箱或同温冷室
3.-20 °C 和-80 °C 冷冻柜
4.台式微量离心机支持 14,000 × g旋转（例如 Eppendorf 5418 型号或类似型号）
5.温和轨道旋转仪（Boekel Orbital rotator，Feasterville，PA 或类似设备）
6.加热能力为 95 °C 的热块（Thermo Digital Block 干加热器、Thermo Scientific、Waltham MA 或类似产品）
7.蛋白质电泳/蛋白质印迹设备（NOVEX XCell II 和 NOVEX TransBlot 系统，Thermo Scientific，Waltham MA 或类似设备）
8.凝胶图像多信号检测系统（Odissey XF 成像系统、LICOR、Lincoln、NE 或类似系统）。建议的设备品牌仅供参考，并不被视为限制所述协议的结果

程序

该方案已通过三个连续的工作流程进行，这些工作流程可以在连续的几天内进行，但工作流程 B 除外，该工作流程必须继续进行，直到蛋白质转移到 PVDF 膜上。第三天可以从工作流程 C 中的隔夜后膜封闭步骤开始。作者承认，先前研究者在蛋白质免疫沉淀和蛋白激酶或其他基于 PTM 的体外的实践经验可能有利于本方案的优化化验。因此，为了加速本方法的优化，建议在直接进入本文描述的集成方法之前熟悉所提到的过程。

A.基准工作注意事项（图 3）

图3. 分步过程，工作流程 A

1.带有 pDegron 或相应生物素缀合合成肽的 N-/C-末端标记蛋白结构域在改良的下拉/泛素化/磷酸化体外测定中用作底物/诱饵（New England Peptides, Gardner, MA）旨在增强处理细胞提取物或平行未处理细胞提取物中泛素连接酶/磷酸化天然激酶活性诱导的特定翻译后修饰（泛素化和磷酸化）。
2.pDegron 蛋白/肽诱饵可以由商业提供商合成，也可以通过重组 DNA 克隆和蛋白纯化方法生成，具体取决于结构域的长度和实验室成本/时间效益评估。根据制造商的建议，将 pDegron 合成肽在无菌分子生物学级水中以 1 mg/mL 的浓度进行复溶，分装在无菌微量离心管中，并储存在 -20 °C 直至使用。我们在六个月内没有发现降解或损失的迹象，但没有测试更长的存储时间。因此，在预处理的细胞裂解物存在下，纯化的磷酸化降解决定子标记肽可用作体外蛋白质复合物捕获测定的诱饵，作为靶向降解决定子肽的天然酶因子的来源（即蛋白激酶或 PK）和 Ub 连接酶），以及明确的重组无机成分，旨在增强体外下拉孵化步骤期间体内处理触发的蛋白激酶和泛素化活性。在作者通过所描述的方法表征的 pDegron 的情况下，其在所研究的蛋白激酶 (PK) 中的推定存在首先通过观察癌症分泌的生长因子信号对（环己酰亚胺敏感）蛋白水平对过表达PK的影响[5] 。然后，相同的 GF 信号与 PK C 末端区域的磷酸化和泛素化状态特异性相关，从而将 pDegron 定义为磷酸抑制类型。这意味着 pDegron 具有活性，并导致蛋白质 UPS 介导的去磷酸化降解。因此，通过比较实验设计，增强了降解因子（即E3-E2-E1结合泛素连接酶）向pDegron（模拟PK C尾区的肽）的招募（如图1所示），其中包括未经处理的细胞提取物（具有完整的 GF 信号、受抑制的 pDegron 和过度表达的靶蛋白降解救援状态）与 GF 信号剥夺的细胞提取物（具有去磷酸化的 pDegron 和招募的降解因子）[6 ] 。

B.基准工作注意事项（图 4）

图4. 分步过程，工作流程 B

1.为了进行方案验证和在发现阶段，将半汇合时从 4 × 150 mm 板中汇集两个细胞沉淀（分别用于未处理和处理条件），并用于生成两批细胞提取物（生成几个冷冻等分试样以避免多次冷冻/解冻循环）如图 1 所示。具体而言，使用单一制剂（处理和未处理的细胞）在不同时间执行 (a) co-IP、(b) PTMe pull down 和 (c)来自单一生物来源的女士/女士分析。传统的 co-IP 方法需要最高的起始蛋白量（我们在每个 IP 条件下使用多达 0.5–0.7 mg 的细胞提取物，以获得如图 1 所示的结果），然后是 PTMe pull down（0.2–0.3 mg/条件） ;最敏感的是免疫富集的 LC-Ms/Ms（0.05–0.150 mg/条件）。
2.μg的全细胞提取物通过质谱检测结合蛋白，在PTMe Pull Down 上获得了良好的结果，但我们建议将蛋白量增加至用于 Pull-down 反应的归一化蛋白提取物的最大可用体积迈向免疫印迹检测（0.2–0.3 mg 酶活性蛋白提取物）。通过以下步骤获得具有酶活性的细胞提取物：（1）将所述蛋白酶抑制剂（配方2）添加到裂解缓冲液中，（2）在冰上进行所有无细胞步骤，（3）采用快速冷冻（液氮浸泡）和缓慢解冻（在冰上）测试细胞提取物，以及（4）避免多次冷冻/解冻循环。
3.首先，将 50 μg Nt-生物素标记的合成 pDegron 承载肽与 6.25 μL链霉亲和素 (STP) 磁珠（金斯瑞，新泽西州皮斯卡塔韦）在 4 °C下旋转2小时，然后加入 PBS 0.05% NP40 清洗。然后，使用 STP 珠偶联的 N-生物素肽诱饵组装 200 μL混合物，其中含有 0.75 mg 全癌细胞提取物（酶活性）以及 10 mM Tris pH 7.5、4 mM ATP、2 mM MnCl 2 、2 mM MgCl 2 、1 μg 人重组泛素和蛋白酶/磷酸酶抑制剂的最终浓度参见配方 2。
4.μL总细胞提取物平行用于SDS-PAGE，然后用考马斯蓝或银渍。通过将混合物在 4 °C下孵育 24-48 小时并轻轻旋转，可以发生蛋白质-蛋白质相互作用以及细胞提取物诱导的磷酸化/泛素化转录后修饰。
5.在下拉孵育结束时，使用含有 pDegron 珠子结合蛋白的微量离心管 (a) 不清洗进行 LC-Ms/Ms 分析，或 (b) 转移到 30 °C 预平衡的热块中进行进一步孵育，增强细胞提取物的内源蛋白激酶和泛素化事件。或者，将 PTMe 复合珠的等分试样（例如 1/3 体积）转移到微量离心管中，并用 1 mL 冰冷的 PBS 洗涤两次以终止反应；使用珠子进行 LC-Ms/Ms（如图形概述中所示）。通过对我们的细胞进行离体处理以增加与我们的 pDegron 的特定蛋白质相互作用，减少了 PTMe 通过质谱检测与我们的 pDegron 结合的天然蛋白质的需要[ 6 ] 。尽管如此，在没有关于假定的 pDegron 结构域调节的生物学背景的情况下，蛋白质组步骤和免疫印迹检测的 PTMe 可能成为首选方法。
6.°C下变性 3 分钟。短暂涡旋和全速离心后，将上清液样品加载到聚丙烯酰胺凝胶（固定 10%、12% 或 8%–16% 梯度）上进行 SDS-PAGE。
7.尽管为了概念简单起见，工作流程以 SDS-PAGE 上的蛋白质分离结束，但出于实际原因，它必须继续将蛋白质转移到建议的固体膜 (PVDF)，以便按照工作流程 C 中的建议暂停方案（图 5）。

C.基准工作注意事项（图 5）

图5. 分步过程，工作流程 C

1.将解析的蛋白质转移到 PVDF 上（这需要按照制造商的建议在有机溶剂中浸泡 5 秒进行预激活，然后在 PBST 缓冲液中平衡2-5 分钟）。
2.°C孵育过夜来封闭非特异性结合位点。
3.为了从每个细胞提取物制备和单个实验中获得最大收益，请从凝胶到膜转移后固相支持物 (PDVF) 上切下膜条，如图 2 所示，并在步骤 C3 后立即对每个条带进行 MW 特异性免疫印迹。相同提取物（限速或 PTMe）的膜分区和差异 p-Degron 结合成分免疫检测需要通过建议的富集蛋白质组方法或其他蛋白质组工作流程预先确定蛋白质复合物成分的身份和分子量。
4.使用增强的发光信号（我们使用 Pierce 的 SuperSignal West Femto 试剂盒）来检测飞摩尔量的 PVDF 转移蛋白，结果是所述方法结果的关键因素（参见故障排除提示，表 2））。
5.本文描述的 PTMe Pull-down 方法使用带有先前鉴定的磷酸化降解子基序的所研究蛋白质的标记肽进行优化[5] 。
6.当与所研究的（标记的）磷酸化降解子肽结合的下拉复合物变性后，通过 SDS-PAGE 解析下拉内源蛋白并检测已解析的蛋白，继续进行蛋白质组学研究或 co-IP 测定。蛋白质印迹法的因素。
7.如果通过LC-Ms/Ms 分析（不是本方案的一部分）使用 PTMe 下拉至蛋白质复合物成分 ID，我们建议添加离体或体外可逆交联步骤，如 Scalia 等人所述。（2023） [6] 。

协议验证

考虑到驱动降解复合物形成的生物复杂性以及所涉及的特定环境变量，使用相同细胞提取物直接比较传统的 co-IP 与 Pull down 是我们建议用于方案验证的强制性策略。观察到的特定案例的优势将推动选择。如图 1 所示，PTMe pull down 为治疗提供了更大的特异性 -诱导所有降解复合物成分的 d 募集，而 co-IP 仅对于测试的两个 pDegron 结合成分（通过之前的蛋白质组筛选鉴定）是准确的，这包括完整的 Ub-E 连接酶以及参与基础过程的关键伴侣/解折叠酶辅因子。使用单个细胞提取物/制备/处理本身在单个实验中验证对所研究蛋白质的降解负责的所有生物学成分的优点本身证明了所提出的 PTMe pull-down 方法相对于其他协议的实施是合理的。

一般注意事项和故障排除

所描述的协议最适合具有预测 pDegron 功能的蛋白质和子域。这可以通过与已知体内泛素化的现有蛋白质域进行初步的子域比较来实现（最好的方法是使用可用的商业抗体通过蛋白质印迹对 K48 赖氨酸泛素化进行预先测试）。故障排除已在下表 2 中传达。

表 2. PTMe 下拉方法故障排除
问题潜在的技术问题解决方案
磷酸化降解子诱饵拉下的目标蛋白的免疫印迹信号
在 PTMe 检测中不是最佳的虚假蛋白质降解在细胞提取物/裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂（参见配方 2）。
裂解液中目标蛋白的含量或表达量较低通过银染或考马斯蓝方法确认特定 MW 范围内预期或先证者蛋白条带的存在。
预期条带的凝胶可视化不足增加下拉蛋白的量：
1)增加蛋白细胞提取物的起始量并平行；
2)增加STP偶联生物素标记的合成肽诱饵的量。
PVDF 膜中的 ECL 试剂可能会被研究蛋白以外的其他蛋白消耗切割并执行与感兴趣的蛋白质相对应的单条转膜 (WB)，如图 2 所示。
下拉蛋白因子的量低于所用化学发光检测系统的检测限使用飞摩尔级 WB 发光检测试剂盒（当使用 HRP 标记的二抗时）或使用 IR 标记的二抗。

致谢
本研究以及与所述方案相关的研究没有使用公共资金。
Scalia 等人首先报道了该方法。（2023） [6] ；用于当前协议开发的 pDegron 域的发现和设计：Scalia 等人。（2019） [ 5 ] 。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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2.Van Roey, K.、Uyar, B.、Weatheritt, RJ、Dinkel, H.、Seiler, M.、Budd, A.、Gibson, TJ 和 Davey, NE (2014)。短线性基序：普遍存在且功能多样的蛋白质相互作用模块指导细胞调节。化学。启示录114(13)：6733–6778。土井： 10.1021/cr400585q
3.内布拉斯加州戴维和 DO 摩根 (2016)。构建具有短线性序列基序的调控网络：从后期促进复合体的退化分子中得到的教训。摩尔。单元64(1)：12-23。 doi：10.1016/j.molcel.2016.09.006
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