材料与试剂

1.GentleMACS C 管（Miltenyi，目录号：130-093-237）
2.Hank 缓冲盐水溶液（HBSS）（Lonza，目录号：BE10-543F）
3.DNase I（Roche，目录号：11284932001）
4.胶原酶 D（Roche，目录号：11088866001）
5.Falcon，15 和 50 mL 锥形离心管（Corning，目录号：352096 和 352070）
6.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A8412）
7.胎牛血清（FCS）（Gibco，目录号：10082147）
8.EDTA（ Corning TM ，目录号：46-034-CI）
9.Falcon ® 70 μm细胞过滤器（Corning，目录号：352350）
10.完整的TM 蛋白酶抑制剂混合物（Roche，目录号：11697498001）
11.红细胞裂解缓冲液（ Thermo Fisher Scientific，目录号：00433357）
12.台盼蓝溶液，0.4%（Sigma-Aldrich，目录号：93595）
13.96 孔圆形 (U) 底板，TC 表面，1 件装（ Thermo Scientific TM ，目录号： 163320）
14.RPMI 1640 培养基（Gibco TM ，目录号：11875093）
15.莫能菌素溶液（ BioLegend ，目录号：420701）
16.Brefeldin A溶液（ BioLegend ，目录号：420601）
17.β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：3148）
18.L-谷氨酰胺（Corning TM ，目录号：25005CI）
19.丙酮酸钠（ Corning TM ，目录号：25-000-CIR）
20.叠氮化钠（Sigma，目录号：8223350100）
21.青霉素-链霉素（ Gibco TM ，目录号：15070063）
22.纯化的抗小鼠CD28抗体（ BioLegend ，目录号：102102）
23.Ultra-LEAF TM纯化的抗小鼠 CD3ε 抗体（ BioLegend ，目录号：100340）
24.Ultra-LEAF TM纯化的抗小鼠 CD49d 抗体（ BioLegend ，目录号：103709）
25.抗小鼠 CD107a 别藻蓝蛋白（APC）缀合抗体（ BioLegend ，目录号：121613）
26.抗小鼠 CD16/32 Fc 块（ BioLegend ，目录号：101301）
27.Zombie Aqua Fixable Viability 套件（ BioLegend ，目录号：423101）
28.多聚甲醛（PFA）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-281692）
29.皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：47036）
30.BD FACSuite TM CS&T 研究珠（BD Biosciences，目录号：650621）
31.肺消化介质（参见食谱）
32.胶原酶 D 工作原料（参见配方）
33.DNase I 工作液（参见食谱）
34.培养基（参见食谱）
35.洗涤缓冲液（参见配方）
36.FACS 缓冲液（参见配方）
37.透化缓冲液（参见配方）
38.细胞内染色缓冲液（参见配方）
39.Fc 受体阻断（参见食谱）
40.细胞内染色混合物（参见配方）
41.表面染色混合物（参见配方）
42.Zombie Violet TM可修复活力套件（参见配方）
43.再刺激介质 1（参见配方和表 1）
44.再刺激介质 2（参见配方和表 1）

表格1。刺激介质具体鸡尾酒的总结
特定介质环境 a（产生 IL-10 和IFNγ的 T 细胞）Milieu b（产生颗粒酶 B 和颗粒酶 A 的 T 细胞）产生穿孔素 1 的T细胞）
媒体RPMI完全培养基RPMI完全培养基RPMI完全培养基
蛋白质转运抑制剂莫能菌素(2 μM ) 和布雷菲德菌素( 2 μM )莫能菌素(2 μM ) 和布雷菲德菌素( 2 μM )莫能菌素(2 μM ) 和布雷菲德菌素( 2 μM )
添加剂β-巯基乙醇( 50 μM )β-巯基乙醇( 50 μM )β-巯基乙醇( 50 μM )
的CD28 抗体（1 μg /mL）的CD28 抗体（1 μg /mL）
纯化的CD3ε抗体（2 μg /mL）纯化的CD3ε抗体（2 μg /mL）
的CD49d 抗体（1 μg /mL）
APC 抗小鼠 CD107a (0.5 μg / mL ; LAMP-1) 抗体

食谱

1.肺消化介质
添加 5% 热灭活胎牛血清的 HBSS 培养基

2.胶原酶 D 工作液
重新暂停冻干胶原酶 D 与 HBSS，浓度为 20 mg/mL（储备液）。重新配制的溶液可保存在-15 至-25 °C下。

3.DNase I 工作液
重新暂停用浓度为 1 mg/mL 的无核酸酶水冻干 DNase I（储备液）。重新配制的溶液可保存在-15 至-25 °C下。

4.培养基
RPMI 培养基补充有 10% 热灭活 FCS、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和 50 μM β-巯基乙醇。

5.洗涤缓冲液
2 mM PBS-EDTA，含 10% FCS

6.流式细胞仪缓冲液
PBS、0.5% BSA、EDTA 2 mM、2 mM NaN 3叠氮化钠
注意：F ACS Buffer 是一种缓冲盐水溶液，可用于免疫荧光染色方案、抗体和细胞稀释步骤、表面染色所需的洗涤步骤以及流式细胞术分析。该缓冲液含有叠氮化钠作为防腐剂和动物血清蛋白 (BSA)，以帮助最大限度地减少抗体的非特异性结合。添加 EDTA 可防止细胞间粘附和结块。

7.透化缓冲液
PBS、0.1% 皂苷

8.细胞内染色缓冲液
FACS 缓冲液，0.1% 皂苷

9. Fc 受体阻断
添加在 FACS 缓冲液中稀释 1:500 的纯化抗小鼠 CD16/32 抗体。每孔加入 100 μL总体积。

10.表面染色混合物
在 FACS 缓冲液中添加通过滴定实验预先确定的适当稀释度的抗体。每孔加入 100 μL总体积。

11.Zombie Violet TM可固定工作枪托
将套件附带的 DMSO 放入 37°C 水浴中，直至完全解冻。将 100 μL DMSO 添加到一小瓶 Zombie Violet TM染料中，并混合直至完全溶解。以 10 μL等分试样储存在 -20 °C下。添加适当体积的 Fixable Viability 溶液，并通过滴定实验预先确定在PBS 中的稀释度 (1:1,000)。每孔加入 100 μL总体积。

12.细胞内染色混合物
添加通过滴定实验预先确定的适当稀释度的抗体。每孔加入 100 μL总体积。

设备

1.BD LSR Fortessa X-20 流式细胞仪（BD Biosciences）
2.贝克曼库尔特Allegra X-15R离心机（贝克曼库尔特）；用于 SX4750A 的 μ 板载体 (392806)
3.温和的MACS 解离器（米尔天尼）

软件

1.FACS Diva 软件（6.0 版）
2.FlowJo软件 v10

程序

A.肺细胞悬浮液的制备

1.打开胸腔（图1）。

图 1. 图片说明了在呼吸道病毒感染的情况下对肺部进行流式细胞术分析的免疫细胞的解剖、灌注和分离的不同步骤。 (A) 将鼠标固定在平台上以卡在该位置。 (B) 解剖皮肤和皮下组织，以可视化呼吸系统的上部和胸腔。 (C) 通过在基础上切割胸肋骨来打开胸腔，以可视化肺部到位。在腋腔中，切断血管。将针插入心脏的右侧部分（心脏较暗的一侧），并用注射器小心地滴注冰冷的 PBS（5 mL）。随着滴注的进行，肺部变白。 (D)在培养皿上隔离灌注的肺叶。

2.通过心脏的右心室用冰冷的 PBS 灌注肺部。
3.将肺叶收集到预热的GentleMACS C 管中，其中含有 3 mL 的完整 HBSS、胶原酶 D（最终浓度：1 mg/mL）和 DNase I（最终浓度 50 μg /mL）。
4.温和的 MACS处理肺部解离者。
5.运行 m_lung_01.01 协议（由制造商预编程：每次运行 168 发，8 秒（不加热）。
重要：在解离过程中，一些组织可能会粘在 C 管中的塑料刀片上。如果发生这种情况，请在离心前使用镊子将组织转移到液体中。
6.在搅拌 (200 rpm) 下在水浴中于 37°C 孵育 30 分钟。
7.再次使用gentleMACS 解离器并运行 m_lung_02.01 协议（由制造商预编程： 38 秒，每次运行 2,083 发（不加热），精细研磨肺部。
8.将细胞悬浮液通过带有洗涤缓冲液的 70 μm Falcon 过滤器过滤到 50 mL 离心管中。
9.×的转速向下旋转管 g在 4°C 下保持 5 分钟。
10.弃去上清，用 1 mL 1 × RBC 裂解缓冲液重悬，混匀，孵育 5 分钟。
11.用 20 mL 的洗涤缓冲液填充管。
12.×的转速向下旋转管 g在 4°C 下保持 5 分钟。
13.丢弃上清液并将颗粒重新悬浮到 1 mL 的 FACS 缓冲液中。
14.使用台盼蓝染色用血细胞计数器计数细胞。
15.200 万个细胞放入 96 孔U 型底板中。

B.肺细胞的离体刺激
1.根据要量化的特定介质/细胞因子制备培养基。
a.IL-10 和IFN γ 的T细胞：在含有蛋白转运抑制剂（2 μM 莫能菌素和 2 μM布雷菲德菌素），50 μM β-巯基乙醇、纯化的 CD28 抗体 (1 μg /mL) 和纯化的CD3ε抗体 (2 μg / mL)。
b.的T 细胞：小鼠肺细胞在含有蛋白转运抑制剂（2 μM 莫能菌素和 2 μM布雷菲德菌素）和50 μM β-巯基乙醇。
c.的T 细胞：在含有蛋白转运抑制剂（2 μM 莫能菌素和 2 μM布雷菲德菌素），50 μM β-巯基乙醇、纯化的CD28抗体(1μg / mL)、纯化的CD3ε抗体(2μg / mL)、纯化的CD49d抗体(1μg / mL )和APC抗小鼠CD107a(0.5μg / mL ； LAMP-1) 抗体。
2.将细胞在 4°C 下以350 × g离心 5分钟。
3.丢弃上清液。
4.如上所述，将细胞重悬于 200 μL特定培养基中。
5.°C下孵育4 小时，并通过每小时移液一次定期混合。
6.将细胞在 4°C 下以350 × g离心 5分钟。
7.丢弃上清液。
8.用 200 洗细胞 μL冰冷的 FACS 缓冲液。
9.将细胞在 4°C 下以350 × g离心 5分钟。
10.丢弃上清液。

C.流式细胞术染色

1.在冰冷的 FACS 缓冲液中稀释 1:500 的纯化 CD16/32 抗体来封闭 Fc 受体。每孔加入 100 μL总体积。
2.孵育 15分钟在4°C。
3.350 ×离心细胞 g在 4°C 下保持 5分钟。
4.丢弃上清液。
5.冰冷的 FACS 缓冲液中稀释的抗体对细胞表面抗原进行染色。每孔加入 100 μL总体积。图 2 和图 3 中提供了所使用的表面抗体（面板、稀释液、克隆、提供者）。
6.4°C孵育 30分钟。
7.350 ×离心细胞 g在 4°C 下保持 5分钟。
8.丢弃上清液。
9.每孔用 200 μL FACS 缓冲液清洗细胞。
10.350 ×离心细胞 g在 4°C 下保持 5分钟。
11.丢弃上清液。
12.将细胞重悬于 100 μL可固定活力溶液中。
13.4°C孵育 30分钟。
14.350 ×离心细胞 g在 4°C 下保持 5分钟。
15.丢弃上清液。
16.μL PBS清洗细胞。
17.350 ×离心细胞 g在 4°C 下保持 5分钟。
18.将细胞重悬于 PFA 4%（用 PBS 稀释）中 15 分钟，或者在 4°C 下于 PFA 1% 中重悬过夜。
19.400 ×离心细胞 g在 4°C 下保持 5分钟。
20.丢弃上清液。
21.将细胞重悬于 200 μL透化缓冲液中。
22.37°C 孵育 20 分钟。
23.400 ×离心细胞 g在 4°C 下保持 5分钟。
24.丢弃上清液。
25.使用细胞内染色缓冲液中稀释的抗体对细胞内细胞因子进行染色。本研究中使用的细胞内抗体（组、稀释液、克隆、提供者）如图 2 和 3 所示。
26.4°C 孵育 20 分钟。
27.400 ×离心细胞 g在 4°C 下保持 5分钟。
28.丢弃上清液。
29.将细胞重悬于 200 μL细胞内染色缓冲液中。
30.400 ×离心细胞 g在 4°C 下保持 5分钟。
31.丢弃上清液。
32.将细胞重悬于 200 μL FACS 缓冲液中。
33.通过流式细胞仪进行分析。

图 2.第 1 组抗体、有用的对照以及颗粒酶 A、Interleukin-10 和 IFN-γ 染色的板设计。（A）。第 1 组中使用的针对表面和细胞内抗原的抗体的详细信息（荧光染料、克隆、稀释液、参考文献）。（二）。可用于设置和验证所提出的多色面板 1 的各种控件以及与用于设置面板 (C) 的控件相对应的 96 孔板设计示例。

图 3. 第 2 组抗体、有用的对照以及颗粒酶 B 和 Perforin-1 染色的板设计。（A）。第 2 组中使用的针对表面和细胞内抗原的抗体（荧光染料、克隆、稀释液、参考文献）。（二）。可用于设置和验证所提出的多色面板 1 的各种控件以及与用于设置面板 (C) 的控件相对应的 96 孔板设计示例。

D.流式细胞仪染色装置

一般来说，在进行多参数流式细胞术时需要考虑一些重要的因素。图 4 提供了协议中要遵循的步骤的示意图。

图 4. 协议流程图。方案中要遵循的步骤以及关键时刻要包含的控制措施的重要性的示意图。

因此，为了避免可能影响数据解释的技术差异，通过添加技术和生物控制，按照以下步骤正确设置仪器至关重要。为了避免任何问题，生物对照样品和实验样品必须同时处理和分析。
1.每次使用前，必须通过运行 BD Biosciences 提供的 CST 微珠来校准流式细胞仪。
2.我们强烈建议对每种抗体、单染色对照和荧光减一 (FMO) 对照进行滴定，以获得细胞群的最大分辨率以及这些多色面板中实验的一致结果。 FMO 对照等技术对照样本对于帮助界定阴性群体和阳性群体之间的界限至关重要。所有这些控件都允许调整流式细胞仪电压的设置并自动计算补偿矩阵，这取决于溢出扩散。我们建议使用感兴趣的细胞（除了补偿珠子之外）添加未染色的对照，以便识别和校正任何固有的潜在自发荧光。
3.除了这些技术对照外，我们建议每个实验添加生物对照，以控制细胞内染色并正确放置门。作为生物对照，我们始终包括对照模拟小鼠、带或不带高尔基止动剂（布雷菲德菌素、莫能菌素）的离体未刺激样品对照。这些控制对于验证信号和正确解释通过消除技术问题造成的偏差而获得的数据至关重要。

具体特点

我们在这里详细描述的协议用于定义由伽玛疱疹病毒引起的急性呼吸道感染期间肺浸润 CD4 + T 细胞的功能概况，并了解控制 CD4 + T 细胞激活的细胞间相互作用。为了表征 CD4 +细胞的表型并研究控制其体内发生的激活和脱粒水平的机制，我们建立了体外刺激方案，随后我们使用多色染色和多参数流式细胞术。具体来说，我们从整个肺中分离出细胞（未经事先富集或分选）并每孔铺板 200 万个细胞，以尊重现有的体内化学计量并保留参与细胞毒性 CD4 + T 局部控制的细胞间相互作用细胞。

数据分析

关于门控策略，首先根据细胞的大小和颗粒度选择细胞，并排除双联体。然后，我们关注活细胞（未用可固定的水僵尸活力染料染色），并根据 CD11c 标记物表达和 FITC 通道中的自发荧光排除肺泡巨噬细胞。随后，我们根据谱系标记（Ly6G、CD19）排除了 B 细胞和中性粒细胞，并重点关注 lin - CD11b -细胞。在这些 lin - CD11b -细胞中，根据 CD3 表达选择 T 细胞，随后根据这些各自的标记选择CD4 +和 CD8 + T 细胞亚群。
有关数据分析的详细信息出现在原始研究文章（Maquet 等人，2022）和本生物协议中提供的图 5 中。图 4 中的流程图提供了该过程中包括的技术和生物控制。

图 5.病毒感染后从小鼠肺部分离的CD4 + T 细胞的免疫分析。 (A) 用于通过流式细胞术识别感染后第 8 天从模拟和 MuHV-4 感染小鼠中分离的肺 CD4 + T 细胞的门控策略。第一步是根据分别与细胞大小和粒度相关的前向 (FSC) 和侧向散射特性来区分细胞群。根据 FSC-W 与 FSC-A 分布排除双联体细胞后，死细胞（由可固定活力染料染色）被识别并从门控中消除。在活细胞中，肺泡巨噬细胞 (AM) 根据 FITC 通道中的自发荧光信号和阳性 CD11c 标记进行门控。通过排除这些 AM，可以按如下方式识别其他免疫细胞：中性粒细胞门控为活的、非自发荧光/CD11c - CD19 - CD3 - Ly6G + CD11b + ；单核细胞 (MO) 门控为活体、非自发荧光/CD11c - CD19 - CD3 - Ly6G - CD11b + Ly6C + ； CD4 +或 CD8 + T 细胞分别门控为活的、非自发荧光/CD11c - CD19 - CD3 + CD4 +或 CD8 + 。选择感兴趣的细胞子集后，根据 FMO、生物对照以及阳性和阴性对照调整细胞毒性标记物和 Interleukin-10 的特定门控。肺 CD4 + T 细胞的代表性流式细胞术图，在抗 CD3ε 和抗 CD28离体刺激 4 小时后，对所示细胞毒性介质 (B) 和白细胞介素 10 (C) 进行染色。 (D)如方法中所述，在肺消化和流式细胞术多色染色后恢复的活总肺细胞、CD4 + T 细胞和 MO 的预期数量。 (E)如方法中所述，在细胞分离、再刺激和染色后表达指定细胞毒性标记物或白细胞介素 10 的肺 CD4 + T 细胞的百分比。

协议验证

该方案可以成功分离肺细胞。成功的解离/消化应产生 70% 或更高的活力。细胞数量取决于小鼠的状态（对照或病毒感染的小鼠）。在图 5 中，我们详细介绍了在 Maquet 等人发表的研究背景下用于识别感兴趣的肺细胞的门控策略。 (2022) MuHV-4 感染后第 8 天，以及这些靶细胞的预期百分比和总数。

一般注意事项和故障排除

一般考虑

需要强调的是，我们以细胞内细胞因子 IL-10 和IFNγ的染色为例进行了描述，并且其他细胞因子（在其他炎症环境中）可以以类似的方式靶向。事实上，我们在这里详细介绍的方法与我们在《科学免疫学》上发表的研究直接相关，该研究表明，肺部缺乏募集的单核细胞会将无症状的病毒感染转化为严重的免疫病理学。特别是，在受感染的 WT 小鼠中，单核细胞在细胞毒性反应和浸润肺部的 CD4 + T 细胞产生的调节反应之间提供平衡。在这种伽玛疱疹病毒呼吸道感染的特定背景下，量化 IL-10 和IFN γ的产生以确定 CD4 + T 细胞的功能异质性是相关的。以这种细胞内染色为例：可以解决其他细胞因子的定量问题，例如 IL-6 (Th17)、IL-12 (Th1) 或 Th2 反应背景下的细胞因子 IL-5 和 IL-13使用类似的协议。
此外，还需要注意的是，用单克隆抗 CD3 和抗 CD28 抗体处理 CD4 + T 细胞可提供与 T 细胞受体 (TCR) 结合的共刺激信号，可用于模拟抗原 -诱导激活。然而，为了研究特定抗原特异性 T 细胞的存在、激活和/或增殖，应考虑其他方案，例如在刺激培养基中添加特定肽或使用其 CD4 + T 细胞的转基因小鼠显示针对给定抗原的 TCR。

关键步骤/故障排除

在整个协议中，可能会遇到问题，我们编制了一份需要考虑的关键步骤列表，以避免故障排除。

A.试剂储存

1.抗体偶联物和试剂对光和温度敏感，必须始终避光并保存在室温下，以保持其稳定性和保质期。
2.°C下保存长达一年。等分试样中未使用的内容物应丢弃。

B.协议调整

1.我们已经测试过在 PFA 后将样品保存在冰箱中过夜（1%，而不是 4%，固定 15分钟），以防流式细胞仪无法立即采集样品。细胞可以在 1% PFA 避光条件下于4 °C保存过夜，并在第二天进行透化和细胞内染色，而不会改变结果。
2.由于交叉激光激发，一些染料溢出到其他通道中，从而引起溢出扩散误差。或者，根据所需的组，可以将抗体缀合的荧光染料替换为另一种染料。有关传播的更多信息，请使用 BD Biosciences Spectrum Viewer。
根据生物学问题，颗粒酶 A 和 B 的细胞内染色可以直接进行，无需与蛋白质转运抑制剂进行任何预孵育。

C.注意事项

1.肺样本应尽可能保存在冰上，直至在 37 °C下进行刺激，以保持活力。消化后，唯一必须在室温下进行的步骤是 RBC 裂解 5分钟。使用冰冷的溶液。
2.皂苷透化是一个可逆步骤，细胞内染色必须在透化缓冲液存在下进行。
3.在染色和透化过程中正确遵守洗涤步骤。

致谢

该协议改编自之前发表的论文：Maquet 等人。（2022）。这项工作部分得到了 FRS/FNRS（CM 研究员；BM 研究员支持；FRS/FNRS“BM 科学研究激励补助金，40003542”）的部分支持，部分由 ERC 启动补助金（给 BM）的支持（ERC-StG-2019 VIROME，ID：853608），部分由 Leon Fredericq基金会（授予 CM）以及 FRS/FNRS-FWO 的 EOS 联合计划（EOS ID：30981113）（授予 LG）提供。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

该协议开发的所有工作均得到列日动物实验伦理委员会的批准（许可证号 2015 和 2215）。

参考

Maquet, C.、 Baiwir , J.、Loos, P.、Rodriguez-Rodriguez, L.、Javaux, J.、 Sandor , R.、Perin, F.、Fallon, PG、Mack, M.、Cataldo, D. ，等人。（2022）。 Ly6C hi单核细胞平衡调节性和细胞毒性 CD4 T 细胞反应，以控制病毒诱导的免疫病理学。科学。免疫学。 7(73)：eabn3240。