材料与试剂

试剂

1.戊二醛，50% 生物级（Electron Microscopy Sciences，目录号：16520）
2.蔗糖，≥ 99.5%（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）
3.二甲胂酸钠三水合物，≥ 98%（Sigma-Aldrich，目录号：C0250）
4.磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 粉末，10 × ，pH 7.4（Fisher BioReagents，目录号：BP665-1）
5.脱水酒精，100%（Epredia，目录号：6215）
6.Milli-Q水，18.2 M Ω · cm，通过Barnstead TM Smart2Pure TM Pro净水系统获得

解决方案

1.扫描电子显微镜固定剂（SEM 固定剂）（参见配方）
2.扫描电子显微镜缓冲液（SEM 缓冲液）（参见配方）
3.磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4 (PBS)（参见食谱）

食谱

1.扫描电镜固定液
试剂最终浓度数量
蔗糖0.1M8.5575克
二甲胂酸钠三水合物0.1M5.3508克
戊二醛，50%3%15毫升
Milli-Q 水不适用235毫升

2.扫描电镜缓冲液
试剂最终浓度数量
蔗糖0.1M8.5575克
二甲胂酸钠三水合物0.1M5.3508克
Milli-Q 水不适用250毫升

3.PBS（基于供应商说明）
试剂最终浓度数量
PBS 粉末，10 ×1 ×98.9克
Milli-Q 水不适用10升

实验室用品

1.有槽组织盒（Epredia，目录号：B851729WH）
2.多用途容器，PP，带独立卡扣盖，120 mL（Globe Scientific，目录号：271004）
3.铜导电胶带，单粘合面（Ted Pella，目录号：16072-1）
4.碳导电胶带，双面（Ted Pella，目录号：16073-5）
5.T10 梅花螺丝刀（Tekton，型号：DST31100）
6.消毒包装（Halyard，目录号：34162）
7.优质蓝色指示硅胶干燥剂珠 3–5 毫米（Dry & Dry，目录号：X000TS1IZP）
8.直型连接器，母鲁尔锁端口（Qosina，目录号：73317）
9.无针注射部位，可更换，公鲁尔锁（Qosina，目录号：80147）
10.50 mL 注射器，鲁尔锁尖端（BD，目录号：309653）
11.剪刀
12.手术级不锈钢镊子，非锁定拇指手柄，直精致，锯齿状尖端，4 3/4英寸。（McKesson，目录号：43-1-772）
13.病理学直尺
14.称重纸或称重船
15.抹刀
16.圆柱
17.干燥器，6 "
18.SEM 固定液/缓冲液废液瓶
19.脱水/乙醇废液瓶
20.带有研究 ID、方案编号和日期的标签
21.个人防护装备（手套、护目镜、听力保护装置和磨砂/实验室外套）

设备

1.配有金刚石锯片的斜切锯（斜切锯 DeWALT，型号：DWS779；刀片 RIDGID，型号：12 英寸两用）
2.带镜头的数码相机（尼康，相机型号：D3300，镜头型号：AF-P DX NIKKOR 18-55 f/3.5-5.6G VR）
3.Barnstead TM Smart2Pure TM Pro 水净化系统（Thermo Fisher Scientific，目录号：50157873）
4.金溅射镀膜机（Denton Vacuum，型号：Desk II）
5.InTouchScope TM扫描电子显微镜（JEOL，型号：JSM-IT100）
6.冲击式吸引装置（Envi health Solutions，型号：326/326M）

软件和数据集

1.ImageJ（版本：1.53k，发布日期：2021年7月6日，免费）
2.分析软件和解决方案 (SAS)（版本 9.4，发布日期：07/2013，需要许可证）

程序

A.膜式氧合器使用后保存

1.将膜式氧合器与 ECLS 系统泵断开。
2.× PBS从入口端口冲洗膜氧合器，并从出口端口排出血液/PBS 冲洗液，直到流出出口的冲洗液清澈为止（将冲洗流速标准化为 ECLS 设备运行的流速）。
3.将入口管和出口管（10 – 15 厘米长）连接成 3/8 "的闭环 × 3/8 "连接器（图1 ）。
4.将无针注射口连接至 3/8 " × 3/8 "直接头。
5.使用 50 mL 注射器通过启动端口将 SEM 固定剂注入氧合器，同时通过单独的端口从氧合器中抽出空气。持续该过程直至膜被固定剂饱和。
6.将膜式氧合器存放在冰箱 (4 ° C ) 中，直至准备好 B 部分。

图 1. 使用 SEM 固定剂保存膜氧合器

B.膜式氧合器拆解（一般说明1）

1.将 SEM 固定剂缓慢排入 SEM 固定剂/缓冲液废液瓶中。
2.× PBS冲洗膜氧合器。
3.使用 T10 Torx 螺丝刀拧松并拆卸膜氧合器泵。
4.拍摄灭菌包装（用作蓝色背景）上膜氧合器泵、膜氧合器入口面和出口面的数字图像，并带有标签和病理学公制尺。示例如图 2所示。

图 2. (a) 膜氧合器泵、(b) 膜氧合器的入口/顶部/膜前/静脉面和 (c) 膜氧合器的出口/底部/膜后/动脉面的示例图像

5.切断水连接以获得平坦的边缘，然后切断出口侧的膜后样品端口，以便膜可以平放在斜切锯台上（图 3）。

图 3. 膜式氧合器的水连接和膜后采样口示例

6.使用与真空系统相结合的斜切锯切割膜盒的四个侧面，使入口面朝上，以去除碎片（示意图如图 4 所示）。

图 4. 膜式氧合器解剖示意图

7.使用镊子轻轻取下入口面塑料盖。
8.第一个气体传输纤维片应暴露并准备成像。

C.膜充氧器气体传输纤维片数字成像（故障排除1）

1.按从入口面到出口面的顺序轻轻地逐个取下气体传输纤维片。
2.每四片气体纤维片水平并排放置，共三排。
3.如图 5所示。

图 5. 用于数字成像的膜气体传输纤维片的布局示例

4.使用研究 ID、日期和病理学度量标尺拍摄顶部入口膜气体纤维片、中间膜气体纤维片和底部出口膜气体纤维片的单独图像，如图 6 所示。

图 6. 用于数字成像的单膜气体纤维片示例

5.将顶部入口、中部和底部出口膜气体传输纤维片各切成九个正方形（总共27个正方形）。顶部入口膜气体纤维片的编号为1至9，中间膜气体纤维片的编号为10至18，底部出口膜气体纤维片的编号为19至27，如图7所示。

图7.单片膜气体纤维片切割及编号示意图。编号 1 – 9 分配给入口/顶部膜气体纤维片（左），编号 10 – 18 分配给中间膜气体纤维片（中），编号 19 – 27 分配给出口/底部膜气体纤维片（正确的）。

6.将随机选择的方块放入标记的盒中，其中最靠近膜入口的表面面向盒的盖子朝上。
7.将装有样品的盒放入 120 mL 容器中，添加 SEM 固定剂，并储存在冰箱(4 °C )中，直至准备好进行D部分。

D.SEM样品脱水（一般说明2）

1.将每个容器中的 SEM 固定剂排入 SEM 固定剂/缓冲液废液瓶中。
2.将SEM缓冲液加入每个容器中并孵育10分钟；将 SEM 缓冲液排入 SEM 固定剂/缓冲液废液瓶中。
3.每个容器中加入30%脱水剂，孵育10分钟；将 30% 脱水剂排入脱水剂/乙醇废液瓶中。
4.每个容器中加入50%脱水剂，孵育10分钟；将 50% 脱水剂排入脱水剂/乙醇废液瓶中。
5.每个容器中加入70%脱水剂，孵育10分钟；将 70% 脱水剂排入脱水剂/乙醇废液瓶中。
6.每个容器中加入100%脱水剂，孵育10分钟；将 100% 脱水剂排入脱水剂/乙醇废液瓶中。
7.每个容器中加入100%脱水剂，孵育10分钟；将 100% 脱水剂排入脱水剂/乙醇废液瓶中。
8.将装有样品的容器放入真空干燥器中过夜。
9.硅胶干燥剂珠填充容器的 1/5 ，并盖紧盖子。
10.将装有样品的容器保持在室温下，直到准备好进行 SEM 成像。

E.扫描电镜成像

1.SEM 样品制备（图 8）
a.使用双面导电碳带将样品连接到 SEM 样品架上。
b.使用 Denton Vacuum Desk II Gold 溅射镀膜机溅射 20 nm 金纳米粒子。
c.用垂直于样品纤维的导电铜带粘贴样品的相对边缘。

图 8. SEM 样品制备过程示意图

2.SEM 成像用于凝块沉积百分比定量分析
a.TM扫描电子显微镜设置 14 kV 加速电压和 14 mm 工作距离。
b.以 25倍放大倍数从样品左上角到右下角水平拍摄图像，以覆盖每个样品的整个表面。

F.使用 ImageJ 对数字图像进行定量分析

1.打开 ImageJ 软件并打开图像进行分析。单击“文件”并选择“打开”以打开图像。
2.设置图像的比例（图 9）。
a.单击分析并选择设置比例...
b.已知距离旁边输入0 。
c.长度单位旁边输入像素。

图9.设置比例窗口的屏幕截图

3.选择感兴趣的总区域（图 10）。
a.单击图像、调整，然后单击颜色阈值...
b.阈值方法设置为默认。
c.颜色空间设置为HSB以启动，并根据需要更改为RGB 。
d.选中深色背景框。
e.设置阈值以覆盖膜气体纤维的整个表面并排除蓝色背景。

图10. 选择总感兴趣区域后的屏幕截图

f.单击“选择”以突出显示感兴趣的总区域（图 11）。

图11. 选择后突出显示的总感兴趣区域的屏幕截图

g.单击分析并选择测量以在结果窗口中显示结果（图 12）。

图12.结果窗口的屏幕截图

h.将面积值输入 Excel 电子表格作为总面积。
4.选择感兴趣的凝块沉积区域（图 13）。
a.单击“阈值颜色”窗口上的“原始”以恢复为原始图像。
b.调整阈值以仅覆盖凝块沉积区域。

图13. 选择感兴趣的凝块沉积区域后的屏幕截图

c.单击“选择”以突出显示凝块沉积区域。
d.单击分析并选择测量以在结果窗口中显示结果。
e.将面积值输入电子表格作为凝块沉积面积。
5.使用电子表格上的凝块沉积面积和总面积计算覆盖百分比（示例如下所示，图 14）。

图14. 计算电子表格示例的屏幕截图

G.使用 ImageJ 对 SEM 图像进行定量分析（一般说明 3）

1.打开 ImageJ 软件并打开图像进行分析。单击“文件”并选择“打开”以打开图像。
2.设置图像的比例。
a.单击直线图标并在比例尺上画一条线（图 15）。

图15. 设置 SEM 图像比例的屏幕截图

b.单击“分析”并选择“设置比例...”将单位从像素更改为微米（图 16）。
c.已知距离旁边输入比例尺值（图 16）。
d.在长度单位旁边输入比例尺单位（图 16）。
e.单击“确定”。

图16. SEM 图像的“设置比例”窗口的屏幕截图

3.单击“分析” ，然后单击“设置测量” 。复选框“区域”和“显示标签” 。单击“确定”。
4.单击“分析” 、 “工具” ，然后单击“ROI 管理器...”复选框“显示全部”和“标签” 。
a.使用多边形选择或手绘选择来绘制感兴趣的区域（图 17）。

图17.多边形和徒手选择的屏幕截图

b.绘制感兴趣区域后，单击添加 [t]将其添加到列表中（所有其他感兴趣区域相同）（图 18）。

图18. 绘制 SEM 图像感兴趣区域示例的屏幕截图

c.单击感兴趣的区域之一。单击“重命名” ，然后在“重命名为”旁边输入感兴趣区域的数量。单击“确定”（对于所有其他感兴趣的区域也是如此）。
d.选择所有感兴趣的区域，然后单击“测量” 。
5.将结果保存为 .csv 格式。单击“文件” ，然后单击“另存为”...
6.打开保存的文件。
7.使用面积列下的值除以总面积（图 19），该值显示在 ImageJ 中每个图像的上方，以获得覆盖百分比。

图19. 总面积位置截图

8.截屏并保存感兴趣区域的图像，就像录音机线一样。
数据分析

对每组样本的总凝块覆盖率的数字和 SEM 图像百分比进行统计比较（通过 SAS 9.4 进行双面检验，α = 0.05 显着性）。进行定量分析的互信度，以评估审稿人之间的一致性（一般说明 4）。

协议验证

目前，没有确定医疗器械表面总凝块沉积的金标准方法，因此限制了将我们测试的方法与既定方法进行比较的能力。该协议已通过盲审过程得到验证，其中不熟悉该方法的个人需要遵循该协议并在没有帮助的情况下执行分析。在此过程结束时，我们收集了反馈并改进了协议。到目前为止，来自三个机构的至少六名个人已经尝试过该方案，并且没有任何突出的担忧或问题。此外，该方案还在第 37 届全国儿童年度研讨会：ECMO 和呼吸衰竭先进疗法（虚拟）上发表了演讲。
臧等人。（2021）。数字与扫描电子显微镜图像的定量分析作为体外生命支持后凝块形成评估的评估工具。在布拉德利山最佳抽象会议上进行口头演讲。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.这些步骤仅适用于Maquet HLS7.0 膜，其他膜氧合器可能需要修改。
2.建议在 SEM 脱水后的第二天进行 SEM 成像，以避免样品在储存过程中受潮。如果不可行，我们建议定期检查和更换硅胶干燥剂珠。
3.对一个样品的一组 SEM 图像进行成像和处理大约需要 28 小时，而同一样品的一张数字图像大约需要 3 分钟。
4.为了避免偏差，我们建议在进行分析之前选择不熟悉膜氧合器相关研究的个人或去识别化的样本。对于常规的研究后分析，使用研究者间信度评分来查看信度和效度，以确保结果准确且可复制。
5.临床使用后评估材料时可能发生的危险暴露（例如血液、固定剂中的危险化学品等）可能会引起安全和健康问题。
6.SEM 既昂贵又耗时，特别是在没有 SEM 或没有足够训练有素的技术人员来日常执行 SEM 的机构。数字成像可能是了解凝块沉积的另一种方法；然而，数字图像中会丢失一些纳米级凝块。因此，我们建议研究人员和临床医生权衡这些方法的优缺点，根据自己的需求做出明智的决定。
7.该协议开发过程中最具挑战性的部分是B部分。我们强烈建议在对要分析的膜氧合器进行分析之前至少尝试一个测试膜氧合器。

故障排除

1.在样品处理和处理过程中，注意到一些血栓从样品表面剥离，因为血栓没有紧密地粘附在表面上。这可能会导致定量分析与设备在使用过程中的临床状态之间存在差异。在此步骤中请尽可能轻柔。
致谢

这项工作得到了负责卫生事务的助理国防部长的支持，并得到了国防部通过同行评审医学研究计划、技术/治疗开发奖的支持，拨款号为： W81XWH-18-2-0048，PI Andriy Batchinsky 医学博士；联合 PI Teryn Roberts 博士。
作者感谢科罗拉多州立大学中央仪器设施的 Patrick McCurdy 博士和 Roy Geiss 博士在 SEM 方面的帮助。作者还感谢道成肉身大学数学、科学与工程学院的 SEM 设施以及院长 Carlos Garcia 博士对 SEM 的支持。

利益争夺

没有利益上的冲突。

道德考虑

膜氧合器是根据《动物福利法》、《动物福利条例》实施以及《实验动物护理和使用指南》原则进行的动物研究获得的，国家研究委员会自主复活和疏散研究计划(AREVA)（德克萨斯州圣安东尼奥）。德克萨斯大学圣安东尼奥分校动物护理和使用机构 (UTSA IACUC) 批准了所有进行的研究（协议 SU001-03-23）。 AREVA 实验室设施获得实验动物护理评估与认证协会的全面认可。该方案和设施还得到了国防部医学研究与发展司令部动物护理和使用审查办公室的批准。

参考

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