材料与试剂

1.pGEX-6p-2 载体（法玛西亚，27-4598-01）
2.用于构建 GST-GFP 和 GST-GFP-HRLP 的引物：
GST-GFP-F- BamHI ：5′-CGCGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3′
GST-GFP-R- EcoRI ：5′-CCGGAATTCTTTGTATAGTTCATCCATGC-3′
HRLP-F-SalI: 5′-ACGCGTCGACTCATGCCACCGAAGGTTGTGAAG-3′
HRLP-R-NotI：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCAGTAGTATGATCCTGGAC-3′
3.Rosetta（DE3）感受态细胞（ Novagen ，目录号： 70954）
4.氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，CAS 号：7177-48-2）
5.异丙基 β-D-1-硫代半乳糖苷 (IPTG)（Sigma-Aldrich，CAS 号：367-93-1）
6.谷胱甘肽琼脂糖珠（GE Healthcare，目录号： GE17-0756-05）
7.分裂前蛋白酶（GE Healthcare，目录号： 27-0843-01）
8.Bio-Rad 蛋白质测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad ，目录号： 5000006）
9.牛血清白蛋白 (BSA)（Sigma-Aldrich，CAS 号：9048-46-8）
10.Precision Plus 蛋白质标准品全蓝色标记（Bio-Rad，目录号： 1610373）
11.PEG-8000（Sigma-Aldrich，目录号： 25322-68-3）
12.孔显微镜载玻片（ BoliOptics ，目录号： SL39101004）
13.盖玻片（TRUSCO，目录号： 122-9777）
14.胰蛋白胨（ Thermo Fisher Scientific，目录号：211705）
15.氯化钠（Sigma-Aldrich，CAS号： 7647-14-5）
16.酵母提取物（ Thermo Fisher Scientific，目录号：211929）
17.琼脂（用于 LB 板）（BD，目录号：214010）
18.甲醇（Sigma-Aldrich，CAS号： 67-56-1）
19.乙酸（Sigma-Aldrich，CAS号： 64-19-7）
20.考马斯亮蓝 R-250（Bio-Rad，目录号：1610400）
21.Tris（ Vivantis ，目录号：PR0612）
22.EDTA（Sigma-Aldrich，CAS号： 60-00-4）
23.Triton X-100（Bio-Rad，目录号：1610407）
24.DTT（罗氏，CAS号： 3483-12-3）
25.完整的不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物（Roche，目录号：5056489001）
26.甘氨酸（Bio-Rad，目录号：1610718）
27.SDS（ Vivantis ，目录号：151-21-3）
28.丙烯酰胺/双 37.5:1（Bio-Rad，目录号：1610158）
29.过硫酸铵（APS）（Sigma-Aldrich，目录号：7727-54-0）
30.TEMED（Bio-Rad，目录号：1610801）
31.LB 培养基（参见食谱）
32.考马斯蓝染色缓冲液（参见配方）
33.脱色溶液（参见配方）
34.裂解缓冲液（参见配方）
35.裂解缓冲液（参见配方）
36.SDS 电泳缓冲液（参见配方）
37.10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 凝胶（参见配方）

食谱

1.LB培养基
10克/升胰蛋白胨
10克/升氯化钠
5克/升酵母提取物
15 g/L 琼脂（用于 LB 平板）

2.考马斯蓝染色缓冲液
20%甲醇
10%醋酸
0.1%考马斯亮蓝 R-250

3.脱色液
20%甲醇
10%醋酸

4.裂解缓冲液
10 mM Tris-HCl pH 8.0
15 毫米氯化钠
1 毫米乙二胺四乙酸
1%海卫一 X-100
5 毫摩尔 DTT
1 ×完整的不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物

5.裂解缓冲液
50 mM Tris-HCl pH 7.0
150 毫米氯化钠
1 毫米乙二胺四乙酸
1 毫摩尔 DTT
0.01% 海卫一 X-100

6.SDS 电泳缓冲液
3.03克/升三羟甲基氨基甲烷
14.4克/升甘氨酸
1 克/升SDS

7.10% SDS-PAGE 凝胶（用于两块 1.0 mm 凝胶）
分离胶：
4.1 mL H 2 O
3.3 mL 30% 丙烯酰胺/双 37.5:1
2.5 mL 1.5 M Tris-HCl pH 8.8
100 μL 10% SDS
100微升的 APS
10微升 TEMED的
堆积凝胶：
3.05 mL H 2 O
0.65 mL 30% 丙烯酰胺/双 37.5:1
0.625 mL 1 M Tris-HCl pH 6.8
50 μL 10% SDS
50 μL APS
5 μL TEMED

设备

1.培养箱（松下，目录号：24127-88）
2.摇床（INFORS，型号：SKU BLE2000100）
3.超声波发生器（Sonics，型号：VCX-130）
4.微量离心机（ Thermo Fisher Scientific，目录号：75003424）
5.离心机（贝克曼库尔特，型号：Allegra X-22）
6.章动搅拌机（ Labnet ，型号：S0500-230V-EU）
7.蛋白质垂直电泳槽（Bio-Rad，目录号：658004）
8.PowerPac电源（Bio-Rad，目录号：1645070）
9.共焦显微镜（奥林巴斯，型号：FV3000）

软件

1.FV31-SW （奥林巴斯）

程序

A.重组蛋白表达

1.GFP和GFP与HRLP融合的编码序列克隆到pGEX-6p-2载体中，分别生成GST-GFP和GST-GFP-HRLP结构。
2.将 GST-GFP 和 GST-GFP-HRLP 的构建体转化为 DE3 感受态细胞。
3.将转化的感受态细胞铺在含有100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜形成菌落。
4.将一个单菌落接种到 2 mL 补充有氨苄青霉素（终浓度为 100 mg/L）的 LB 液体培养基中，并在 37°C 下以 220 rpm 剧烈振荡孵育过夜。
5.将过夜细胞培养物转移至补充有 100 mg/L 氨苄青霉素的 200 mL LB 液体培养基中，并在 37°C 下以 220 rpm 摇动生长，直至 OD 600 值达到0.6–1.0 。
6.将终浓度为 0.2 mM 的 IPTG 添加到培养细胞中，在 16 °C 过夜诱导感兴趣的蛋白质（注 1）。
7.通过运行蛋白质凝胶，然后通过以下步骤进行考马斯蓝染色来测试 GST-GFP 和 GST-GFP-HRLP 融合蛋白的溶解度：
a.将 2 mL 诱导和非诱导细胞培养物转移至 Eppendorf 管中，然后以最大速度离心 1 分钟以沉淀细胞。同时，将其余细胞培养物保持在 4°C。
b.添加 1 mL 裂解缓冲液（注 2）以重悬细胞，并通过超声处理进一步破碎细胞（输出功率为 6、30 秒开启/30 秒关闭），直至溶液变得澄清。
c.将裂解的细胞在 4°C 下以最大速度离心 10 分钟，并将上清液转移到新的 1.5 mL 管中作为可溶性蛋白。
d.添加 6 × SDS 上样染料，并在 100°C 下使蛋白质变性 10 分钟。
e.运行 SDS-PAGE 凝胶。运行完成后，用考马斯蓝染色缓冲液在室温下将凝胶染色至少 1 小时。
f.通过将凝胶浸泡在脱色溶液中对凝胶进行脱色。 IPTG 诱导后应出现诱导重组蛋白条带（图 1A）。

图 1. 用考马斯蓝进行蛋白质染色。 (A) IPTG 诱导后 GST-GFP 和 GST-GFP-HRLP 表达。红色星号表示 GST-GFP 和 GST-GFP-HRLP 的蛋白条带。 (B) 裂解后的 GFP 和 GFP-HRLP 蛋白。红色星号表示 GFP 和 GFP-HRLP 的蛋白条带。

B.重组蛋白纯化

1.g离心 5 分钟收获含有 GST-GFP 和 GST-GFP-HRLP 的诱导细胞。
2.将细胞重悬于 10 mL 冰冷的裂解缓冲液中，然后进行超声处理（输出功率为 6、打开 30 秒/关闭 30 秒），直至细胞悬浮液变得澄清。
3.将悬浮液在 4°C 下以 10,000× g离心 20 分钟。
4.将含有诱导蛋白的上清液转移到新的 15 mL Falcon 管中。
5.通过用 1 mL 裂解缓冲液清洗珠子来平衡谷胱甘肽琼脂糖珠子。
6.转移 150 μL 将平衡珠加入到每个上清液中，然后在 4 °C下轻轻旋转孵育 2 小时。
7.g离心 4°C 下 1 分钟以沉淀珠子。
8.弃去上清液，用 5 mL 冰冷的裂解缓冲液洗涤珠子 5 分钟。
9.重复洗涤步骤两次。
10.为了测试蛋白质质量和大小，将 2 μL洗涤过的珠子放入 10 μL裂解缓冲液中，辅以 6 × SDS 上样染料，在 100 °C 下煮沸 10 分钟，然后在 SDS-PAGE 凝胶中运行。
11.运行完成后，用考马斯蓝缓冲液在室温下将凝胶染色 1 h。
12.脱色液对凝胶进行脱色； IPTG 诱导后应出现目标蛋白条带。对于其余的珠子，保持在 4°C 直到裂解步骤。

C.重组蛋白的切割

1.将 5 μL PreScission蛋白酶和 200 μL裂解缓冲液添加到洗涤的珠子中。
2.将珠子在4°C下章动混合器上孵育4 小时（注 3）。
3.将珠子在 4°C 下以 600× g离心 1 分钟。
4.将绿色上清液转移到新的 1.5 m L 管中以存储 GFP 和 GFP-HRLP 蛋白（图 2）。蛋白质可以小份在-80°C 的裂解缓冲液中保存几个月（注 4）。

图 2. 裂解后的 GFP（左）和 GFP-HRLP（右）蛋白

5.使用 Bio-Rad 蛋白质测定染料试剂浓缩物测量蛋白质浓度（BSA 蛋白质可用于生成标准曲线）。
6.在蛋白质凝胶上运行 2 μL GFP 和 GFP-HRLP 蛋白质，然后进行考马斯蓝染色以检查蛋白质质量和大小（图 1B）（注 5）。

D.体外相分离

1.用冰上的裂解缓冲液将生成的 GFP 和 GFP-HRLP 蛋白稀释至终浓度 10 μM （注 6）。
2.添加 2 微升将终浓度为 10% 的 PEG-8000（注 7）加入冰上 PCR 管中的18 μL稀释蛋白中。通过上下移液混合样品。
3.将 20 μL混合物转移到孔显微镜载玻片上，以避免蛋白质降解或荧光衰减。
4.用盖玻片小心地盖住载玻片。
5.在 FV3000 Olympus 共焦显微镜下用 40 ×显微镜物镜观察荧光。 GFP 蛋白在显微镜下表现出均匀的信号，而 GFP-HRLP 形成液滴（图 3）（注释 8-10）。

图 3. 添加 PEG-8000 后 GFP 和 GFP-HRLP 蛋白的体外相分离。比例尺，10 μm 。

数据分析

应使用独立表达和纯化的重组蛋白通过上述程序重复体外相分离测定。应始终包含阴性对照蛋白 GFP。如果在多个独立实验中，目标蛋白（而非 GFP 对照）始终形成液滴，则该目标蛋白将在体外进行 LLPS。需要其他方法，包括延时成像和 FRAP 来进一步确认感兴趣蛋白质的 LLPS 特性。

笔记

1.IPTG诱导后，细胞培养物的颜色通常变成绿色，这是成功诱导GFP融合蛋白的指标。
2.裂解缓冲液中 NaCl 的浓度可以根据目标蛋白质的具体性质进行调整，因为某些相分离蛋白质可能需要更高浓度的 NaCl 来增强其溶解度。这种调整的目的是优化维持目标蛋白质处于可溶状态的条件。
3.PreScission蛋白酶的浓度和孵育时间可以根据具体情况进行调整，以避免蛋白质降解。
4.蛋白质等分试样应小体积保存，并应避免重复冻融循环，以保持蛋白质的完整性和活性。
5.建议采用尺寸排阻色谱法来有效消除非特异性蛋白质和污染物。
6.最佳蛋白质浓度应根据具体情况确定。建议评估液滴形成是否与浓度相关。
7.PEG-8000的浓度可以调整。也可以使用其他拥挤试剂，例如葡聚糖和聚蔗糖。
8.有些蛋白质可能需要更长的时间才能形成液滴。
9.蛋白液滴的形成受pH、盐浓度、蛋白浓度、温度、PEG浓度等多种因素影响。修改这些参数可以促进液滴形成。
10.GFP 标签的存在可能会影响某些蛋白质的相分离特性。在这种情况下，建议去除 GFP 标签并在微分干涉差 (DIC) 显微镜下进行 LLPS 观察。 DIC 显微镜可以实现相分离结构的可视化，而不受 GFP 标签的潜在干扰，从而可以更清晰地评估蛋白质固有的相分离行为。

致谢

这项工作得到了国家研究基金会竞争性研究计划(NRF-CRP22-2019-0001) 和淡马锡生命科学实验室的校内研究支持。
该协议源自Zhang等人的原创工作。（2022）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Boeynaems, S.、Alberti, S.、Fawzi, NL、Mittag, T.、Polymenidou, M.、Rousseau, F.、Schymkowitz, J.、Shorter, J.、Wolozin, B.、Van Den Bosch, L. ，等人。（2018）。蛋白质相分离：细胞生物学的新阶段。趋势细胞生物学。 28（6）：420-435。
Dao, TP、Kolaitis, RM、Kim, HJ、O'Donovan, K.、Martyniak, B.、Colicino, E.、Hehnly, H.、Taylor, JP 和 Castañeda, CA (2018)。泛素通过破坏多价相互作用来调节 UBQLN2 的液-液相分离。摩尔。单元格69(6)：965–978.e6。
Dignon, GL、Best, RB 和 Mittal, J. (2020)。生物分子相分离：从分子驱动力到宏观特性。安努。物理博士。化学。 71（1）：53-75。
李静、张明、马文、杨本、陆红、周峰、张丽 (2022)。液-液相分离的翻译后修饰：全面综述。摩尔。生物医学。 3(1)：e1186/s43556-022-00075-2。
Saha, S.、Weber, CA、Nousch, M.、Adame-Arana, O.、Hoege, C.、Hein, MY、Osborne-Nishimura, E.、Mahamid, J.、Jahnel, M.、Jawerth, L .，等人。（2016）。由 mRNA 竞争机制调节的细胞内相分离液体室的极性定位。单元格166(6)：1572–1584.e16。
张 Y.、范 S.、华 C.、Teo, ZWN、Kiang, JX、沉 L. 和 Yu, H. (2022)。 HRLP 的相分离调节拟南芥的开花时间。科学。副词。 8（25）：eabn5488。