材料与试剂

1.人类诱导多能干细胞系 HMGU1 ( hPSCreg : ISFi001-A ) 和 HMGU12 ( hPSCreg : ISFi002-A )，从慕尼黑亥姆霍兹中心 iPSC 核心设施获得。细胞来源是 BJ 成纤维细胞 (ATCC CRL-2522)
2.mTeSRTM _ 1 份培养基（基础培养基和 5 ×补充剂）（ StemCell Technologies，目录号： 05850)
3.DMEM/F-12， GlutaMAX TM补充剂（ Gibco TM ，目录号： 10565018）
4.Neurobasal 培养基 (1 × ) [-] L-谷氨酰胺（ Gibco TM ，目录号： 21103-049）
5.B -27 补充剂与维生素 A (50 × )（ Gibco TM ，目录号： 17504044）
6.GlutaMAX TM补充剂（100 ×）（ Gibco TM ，目录号： 35050061）
7.青霉素-链霉素（ Gibco TM ，目录号： 15140122）
8.N2补充剂（100 × ）（ Gibco TM ，目录号： 17502048）
9.非必需氨基酸（100 × ）（ Gibco TM ，目录号： 11140050）
10.2-巯基乙醇（50 mM）（ Gibco TM ，目录号： 31350010）
11.人胰岛素（10 mg/mL）（Sigma-Aldrich，目录号： I9278-5ML）
12.IV 型胶原酶（1 mg/mL）（ StemCell Technologies，目录号： 07909）
13.干普罗TM Accutase TM （ Gibco TM ，目录号： A1110501）
14.Geltrex Matrix，减少的生长因子（ Gibco TM ，目录号： A1413202）
15.Matrigel®生长因子减少（Corning® ，目录号： 354230）
16.来自 Engelbreth-Holm-Swarm 鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号： L2020-1MG）
17.聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐（Sigma-Aldrich，目录号： P3655-500MG）
18.Dorsomorphin（Sigma-Aldrich，目录号： P5499-5MG）
19.SB431542 水合物（Sigma-Aldrich，目录号： S4317-5MG）
20.重组人 FGF-basic（ Peprotech ，目录号： 100-18B）
21.ROCK抑制剂（Y-27632），5毫克（ StemCell Technologies，目录号： 72304）
22.诺考达唑（Sigma-Aldrich，目录号： M1404）
23.二甲亚砜（DMSO），无菌过滤（Sigma-Aldrich，目录号： D2438）
24.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（10 ×）（ Gibco TM ，目录号： 70011044）
25.无菌水（Braun，目录号： 0082423E）
26.MilliQ水（默克）或蒸馏水（任何品牌）
27.介质过滤器： Filtropur V25，250 mL，0.2 μm （Sarstedt，目录号： 83.3940.001）
28.介质过滤器： Filtropur V50，500 mL，0.2 μm （Sarstedt，目录号： 83.3941.001）
29.Tris-base [NH 2 C(CH 2 OH) 3 ]（Millipore，目录号： 648310）
30.氯化钠（NaCl）（Sigma，目录号： S3014）
31.乙二胺四乙酸四钠盐（EDTA）（Sigma，目录号： E6758）
32.乙二醇-双（2-氨基乙醚）-四乙酸（EGTA）（Sigma，目录号： E4378）
33.Triton X-100（Bio-Rad，目录号： 1610407）
34.十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma，目录号： L3771）
35.2-巯基乙醇，分子生物学级（Sigma-Aldrich，目录号： M3148-25ML）
36.cOmplete ，迷你蛋白酶抑制剂混合物（Roche，目录号： 11836153001）
37.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号： A2153）
38.蛋白质测定试剂A（Bio-Rad，目录号： 5000113）
39.蛋白质测定试剂 B（Bio-Rad，目录号： 5000114）
40.蛋白质测定试剂 S（Bio-Rad，目录号： 5000115）
41.Dynabeads TM蛋白 A（Invitrogen，目录号： 10002D）
42.Dynabeads TM蛋白 G（Invitrogen，目录号： 10004D）
43.微量移液器吸头（任何品牌）
44.6孔细胞培养皿（Falcon® ，目录号： 353046）
45.10 cm 细胞培养皿（Falcon ® ，目录号： 353003）
46.细胞刮刀（TPP TM ，目录号： 99002）（Sarstedt，目录号： 83.3951）
47.50 mL Falcon 管、15 mL Falcon 管（任何品牌）
48.Protein LoBind ®管，1.5 和 2 mL（Eppendorf，目录号： 0030108116 和 0030108132）
49.蛋白质LoBind ®管，50 mL（Eppendorf，目录号： 0030122240）
50.5、10 和 25 mL 血清移液器（任何品牌）
51.兔多克隆抗CDK5RAP2（Sigma-Aldrich，目录号： 06-1398）
52.小鼠多克隆抗 CNTROB（Abcam，目录号： ab70448）
53.兔多克隆抗 CP110（Abcam，目录号： ab99338）
54.小鼠单克隆抗CEP170（ Invitrogen TM ，目录号： 72-413-1/41-3200）
55.兔多克隆抗 CEP192（Novus Biological，目录号： NBP1-28718）
56.兔多克隆抗 CEP152（Merck Millipore，目录号： ABE1856）
57.兔多克隆抗CEP63（Merck Millipore，目录号： 06-1292）
58.兔多克隆抗 CEP135（Antibodies online，目录号： ABIN2801434）
59.兔多克隆抗 POC5（Novus Biological，目录号： NBP1-78741）
60.兔多克隆抗 ODF2（Abcam，目录号： ab43840）
61.ROCK 抑制剂 (10 mM)（参见配方）
62.Dorsomorphin (5 mM)（参见食谱）
63.SB431542 (10 mM)（参见配方）
64.聚-L-鸟氨酸 (10 mg/mL)（参见食谱）
65.神经维持介质（N3）（参见食谱）
66.神经诱导培养基 (N3+SMADi)（参见食谱）
67.诺考达唑 (3.3 mM)（参见食谱）
68.2 M 氯化钠（参见配方）
69.0.5 M EDTA，pH 7.5（参见配方）
70.0.5 M EGTA，pH 7.6（参见配方）
71.1 M Tris-HCl，pH 7.5（参见配方）
72.0.5 M Tris-HCl，pH 6.8（参见配方）
73.10% Triton X-100 (v/v)（参见配方）
74.10% SDS (w/v)（参见配方）
75.IP /洗涤缓冲液 A（参见配方）
76.洗涤缓冲液 B（参见配方）
77.蛋白质标准品 (BSA) (64 mg/mL)（参见配方）
78.1× Laemmli缓冲液（参见配方）

设备

1.倒置显微镜（徕卡，DM IL LED）
2.Neubauer 改进的细胞计数室（ Assistance ，目录号： 40442702）
3.加湿细胞培养箱（任何品牌）
4.品牌 Accu-jet pro 移液器控制器（Pro-lab，目录号： 26330）
5.微升移液器（Gilson ® ，P1000，目录号： 10387322；P200，目录号： 10327282；P20，目录号： 10082012；P2，目录号： 10635313）
6.冰桶（任何品牌）
7.分光光度计或酶标仪（任何品牌，波长为 750 nm）
8.DynaMag-2 磁铁（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 12321D）
9.1.5 mL 立式管旋转器（Stuart，目录号： SB3）
10.带制冷功能的微量离心机（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 75002446）
11.带制冷功能的微量离心机（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 75004510）
12.化学通风柜（任何品牌）
13.加热块（任何具有 95 °C 能力的品牌）
14.QExactive HF 质谱仪（ Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）

软件

1.最大量子：https: //www.maxquant.org/
2.珀尔修斯： https: //www.maxquant.org/perseus/
3.R统计软件： https: //www.r-project.org/
4.Microsoft Excel： https://www.microsoft.com/de-de/microsoft-365/excel

网络资源

1.Ensembl基因组浏览器： http: //www.ensembl.org/index.html
2.蛋白质组学鉴定数据库 (PRIDE)： https://www.ebi.ac.uk/pride/
3.STRING 数据库： https://string-db.org/
4.珀尔修斯文档： http://www.coxdocs.org/doku.php? id=:perseus:start

程序

目录和时间表：
第一部分：细胞培养
A. 诱导多能干细胞培养基和板制备（0.5-1 天）
B. 诱导多能干细胞培养（3 – 5 天）
C. 诱导多能干细胞扩增（4 – 6 天 × n）
D. 神经诱导（40 – 42 天）
E.（可选）诺考达唑处理细胞（4 – 5 小时）

第二部分：蛋白质分离
F. 细胞裂解以分离总蛋白（2 – 4 小时）
G. 测定蛋白质浓度（0.5 – 1 小时）

第三部分：免疫沉淀
H. 免疫沉淀（ 4 – 5 小时）
I. 质谱（可变）

*根据研究人员或资源的可用性，时间表可能与我们在此提供的估计有所不同。

关于细胞培养和免疫沉淀的一般说明
1.细胞汇合是影响 iPSC 正常神经诱导和分化的关键因素。本协议中概述的分裂比可能取决于细胞系。除了提到的比率外，表 1 概述了使用这些分裂比成功分化的不同重复的播种密度范围的回顾性统计数据。我们建议在神经诱导第 10 天后，在初始实例中使用 6 孔板进行小规模试点，使用此处概述的分流比和接种数以及其变化形式，例如 1:2 和 1:3 （图1）。关键：当细胞仍然是祖细胞（即仍然形成玫瑰花结）时，将细胞密度保持在一定水平以上至关重要，以避免它们错误地导向其他谱系。

表 1 .导致成功神经分化的不同实验中使用的细胞接种密度范围示例
*收获量（每cm 2 ）种子（每厘米2 ）
第 0 天-350,000 – 550,000
第 10 天1.2 澪– 1.7 澪630,000 – 730,000
第 15 天690,000 – 1.6 米奥30万
第 21 天820,000 – 1.4 Mio420,000
第 28 天480,000 – 850,000190,000 – 250,000
*自神经诱导第一天起的天数（Mio：百万）

2.建议通过标记蛋白（如 PAX6（用于神经干细胞））的免疫染色来评估不同时间点的培养物； MAP2、CTIP2、SATB2、CUX1（对于神经元）；和 FOXG1（前脑）。

图1 。神经分化不同阶段分裂后几小时的细胞图像。比例尺：200 μm 。

3.尽管需要大量材料来研究 10 种诱饵的完整蛋白质组图谱，但该方法的优点是可以批量创建样品。也就是说，只要所有重复的所有蛋白质组样本都在质谱仪上一起运行，并非所有 10 个诱饵加上阴性对照都需要同时进行免疫沉淀。例如，可以在一批中进行四次不同诱饵加阴性对照的免疫沉淀，并在另一批中对该细胞类型进行其余六次免疫沉淀加阴性对照。高度可重复的神经分化加上四个重复的蛋白质组分析使这成为可能。然而，如果针对特定诱饵（例如神经祖细胞中的 CEP120）询问微管依赖性和微管非依赖性蛋白质组相互作用，则应将来自同一批次分化的细胞分为诺考达唑和 DMSO 处理，并使用相同的方法进行免疫沉淀。抗体。
4.该方案可以很容易地适应其他培养的细胞类型，以及从不同组织或不同物种分离的原代细胞，只要可以获得足够的起始量的用于免疫共沉淀的分离总蛋白，并且步骤的相关优化是完毕。
5.除非另有说明，否则使用室温下的 1 × PBS 清洗细胞。
6.建议在分裂细胞和每天更换培养基时使用预热培养基 (37 °C)。

第一部分：细胞培养

A.诱导多能干细胞培养基和板制备（时间：0.5-1 天）

1.准备介质：
a.需要时，从冰箱中取出mTeSR补充剂 (5 × )，并在使用前在 2 – 8 °C 下解冻过夜。
b.在无菌条件下将 100 mL 的mTeSR补充剂 (5 × ) 添加到 400 mL 冷 (2 – 8 °C) mTeSR基础培养基中。此混合物以下称为mTeSR培养基。
2.给板材涂上涂层：
a.解冻Geltrex ，并在预冷的 DMEM/F-12 培养基（4°C）中按 1:100 稀释，以避免产品胶凝；将 Falcon 管颠倒几次进行混合。向 6 孔板的每个孔中添加 1 mL，旋转板以使溶液均匀分布，并在加湿的细胞培养箱中孵育至少 2小时或过夜。
b.孵育后，在接种细胞之前除去包被溶液（可选：用 1 – 2 mL 无菌 1 × PBS清洗孔一次）。暂停点：如果不立即使用，请在每个包被孔中添加 2 mL 1 × PBS，用封口膜包裹板，并在 2 – 8 °C 下保存长达一周。

B.诱导多能干细胞培养（时间：3-5 天）

注意：解冻细胞前，准备好Geltrex包被板、培养基、ROCK 抑制剂，并将水浴加热至 37°C。

1.准备补充有 10 μM ROCK 抑制剂（10 mM 库存溶液的 1:1,000 稀释）的mTeSR介质，足以解冻和播种 iPSC，如下所述（以下称为mTeSR+ROCKi ）。
2.在 15 mL Falcon 中将3–4 mL mTeSR+ROCKi预热至 37°C。
3.快速解冻一瓶冷冻密度为 2 的活 iPSC × 10 5 –1 × 10 6 （或 6 孔板的一个孔），将冷冻管放入 37 °C 水浴中 1-2 分钟（直到留下微小的冰粒）。
4.mTeSR+ROCKi的预热 15 mL Falcon 管中。提示：打开冷冻管前用 70% 乙醇消毒。
5.室温下300 × g离心 4 分钟，除去上清液。
6.将细胞重悬于 1.5–2 mL 的mTeSR+ROCKi中。从Geltrex涂层板中取出Geltrex /PBS ，并将细胞悬浮液混合物添加到 6 孔板的单个孔中（或最多三个孔，每个孔中至少有 1.5 mL 最终介质）。
7.左右摇动板，使细胞均匀分布在孔中，并在 37 °C、5% CO 2下孵育。
8.第二天，除去培养基，用1 × PBS洗涤细胞一次，每孔加入1.5mL新鲜的不含ROCK抑制剂的mTeSR ，并在37℃、5%CO 2下孵育。
9.每天用 1.5 mL 新鲜mTeSR更换培养基，直至细胞 80% 汇合。可选：当细胞融合超过~70%时，可以使用 2 mL 培养基代替。
10.最好每天在相差显微镜下观察 iPSC 系，以检查 iPSC 样形态、分化细胞的存在和融合（图 2）。

图 2. 不同生长阶段的诱导多能干细胞（iPSC）。 A）分手后几天。电池可能看起来更大，电池与电池之间的接触松散。 B) 半汇合阶段。集落中心有紧密接触的圆形细胞，而生长的边缘则有较松散的细胞。 C) 由于高度融合，大多数 iPSC 变得圆形且紧凑，细胞间接触紧密。比例尺：200 μm 。

C.诱导多能干细胞扩增（时间：4 – 6 天 × n）

笔记：
a.在这里，我们描述了将细胞从 6 孔板的一个孔分裂到六个孔（分裂比 1:6）。板的尺寸、体积和比率可以放大或缩小。
b.在裂解当天准备好涂有Geltrex的 6 孔板。
c.我们在这里描述了使用酶促和机械方法相结合的 iPSC 传代。首先，用胶原酶 IV 处理孔以软化基底膜，然后使用细胞刮刀收集细胞团块并进一步机械解离。
d.× PBS中稀释胶原酶 IV 1/4 ，并将等分试样保存在 Falcons 中 -20 °C。解冻后，工作溶液可在 2–8 °C 下保存几周，并且不应重新冷冻。

1.mTeSR预热至 37°C。可以稍微增加体积以考虑移液损失。
2.从孔中吸出介质并添加 2 mL 无菌 1 × PBS。旋转板几次并除去 PBS。
3.将 1 mL 胶原酶（1/4 in 1 × PBS）添加到孔中，通过旋转均匀分布，并在 37°C 下孵育板 5 分钟（不超过 8 分钟，因为细胞在此阶段不应分离）然而）。
4.吸出胶原酶并添加 1 mL 的 1 × PBS 或mTeSR 。
5.首先用 200 μL移液器吸头在不同方向刮擦孔以破坏细胞集落。然后，使用细胞刮刀将细胞从板上完全分离。
6.使用 1 mL 移液器（或血清移液器，取决于孔的数量）将细胞转移到 15 mL Falcon 中，并在室温下以 300 × g 离心 4分钟。或者，将 Falcon 在室温下放置 5-8 分钟，使细胞团沉淀到 Falcon 管的底部。
7.当细胞旋转时，将 1 mL mTeSR （预热至 37°C）添加到六个Geltrex涂层孔中的每一个中。
8.通过快速上下移液 5-8 次将细胞沉淀重悬于 3 mL 新鲜mTeSR中。关键：确保既没有单个细胞也没有非常大的细胞团。 10-30 个细胞的团块是理想的。如果细胞错误解离过多，请添加 ROCK 抑制剂（最终 10 μM ）一天以帮助其存活。如果团块太大，iPSC 往往会在平板汇合之前在集落中间分化。为了避免形成大团块，在接种之前可以将细胞另外上下吹打几次，以进一步破碎它们。
9.将 0.5 mL 重悬细胞混合物添加到六个孔中的每一个中。将板左右摇动几次，并在 37 °C、5% CO 2下孵育细胞。提示：避免旋转培养板，因为这会导致细胞积聚在孔的中心，并在几天后由于高密度而开始分化。
10.第二天，用 1.5 mL 的新鲜mTeSR更换介质，并每天重复此步骤。可选：当细胞融合超过~70%时，可以使用 2 mL 培养基代替。
11.一旦达到 80% 汇合，再次分裂细胞。
12.继续扩增，直到有足够的细胞用于神经诱导。

D.神经诱导（时间：40-42 天）

注意：在这里，我们描述了在分化第 40 天生成带有神经元的60 – 100 × 10 厘米培养皿的协议（图 3）。这可以解释 DMSO 和诺考达唑治疗各 11 个免疫沉淀 (IP)（总共 22 个 IP，包括阴性对照）（图 4）。板和 IP 的数量可以增加或减少。对于第 0 天的每个 10 厘米培养皿，培养 3 – 5 个 80% 汇合 iPSC 的孔（表 1）。沿着分化，根据所需的最终板数调整每次分裂中进行的板数。对于神经元，计算一些额外的板以考虑细胞潜在的部分分离，特别是在分化的第 35 天之后。

图 3.诱导多能干细胞(iPSC) 向神经元扩展和分化以实现中心体蛋白及其相互作用物的免疫共沉淀的示意图

图 4.不同稀疏 (B) 或正常密度 (C) 批次中获得的第 40 天神经元平板数量与总蛋白（毫克）的统计数据 (A)。比例尺：200 μm 。

1.在 DMEM/F-12 培养基中以 8–12 mg/mL 储备液按 1:300 稀释基质胶，并在两个 10 cm 培养皿中各添加 4–4.5 mL。在 37 °C、5% CO 2下放置至少 4 小时至过夜。
a.重要：不要让培养板任何部分的涂层干燥，因为这会改变细胞的附着和诱导的成功。如果培养板的一部分变干，可能会产生异质细胞群，而以后无法对其进行分类。因此，请仔细调整涂布量。
b.在接种细胞之前，除去包被溶液（可选：用 3 mL 的 1 × PBS清洗）。
c.暂停点：如果不立即使用包被板，请在添加 6 mL 新鲜 1 × PBS 后储存在 4 °C 下长达两周。
2.Accutase和mTeSR介质预热至 37 °C。
3.从含有 iPSC 的 6 孔板中取出介质，并用 1 × PBS 清洗一次。
4.将 0.5–0.7 mL Accutase添加到含有 iPSC 的 7–10 个孔中（根据C1部分留一个孔用于重新分流），并在 37 °C、5% CO 2下孵育5 分钟（不超过 8 分钟）（可选：在孵育过程中将板旋转一次）。孵育结束时，细胞应以单细胞形式悬浮在溶液中。
5.Accutase 的每个孔中添加 1 mL mTeSR或 1 × PBS ，并小心收集并汇集 Falcon 管中的所有细胞。室温下300 × g离心 4 分钟。
6.除去上清液，小心细胞沉淀。在 37°C 下用 6 mL mTeSR重新悬浮细胞，辅以 10 μM ROCK 抑制剂 ( mTeSR+ROCKi )。
7.将 3 mL 细胞添加到预先填充mTeSR+ROCKi的每个 10 cm 培养皿中，以获得 10 mL的最终体积。
a.根据我们的经验，6 孔板的 3-4 个汇合孔足以接种 10 厘米培养皿。
b.2中接种 350,000–550,000 个细胞（表 1），并将最终体积调整至 10 mL。
c.至关重要：在第 1 天获得致密的 iPSC 细胞层对于正确的神经外胚层诱导非常重要（图 5，第 1 天）。密度较低时，细胞可能呈现神经嵴样或其他谱系（Liu et al., 2015；Hindley et al., 2016）。

图5 续。

图 5.成功分化不同阶段的示例图像。细胞在第 10、15、21 和 28 天进行分裂。第 11、16、22 和 29 天代表分裂后的天数。第 15 天和第 40 天是O'Neill 等人用于蛋白质组分析的时间点。（2022 ）。比例尺：200 μm 。

8.接种后，将板从一侧到另一侧双向摇动几次，使细胞均匀分布，然后放入培养箱中（避免旋转），并在 37°C、5% CO 2 下保持过夜。
第二天，如果细胞完全覆盖整个板（图 5，第一天），则开始神经诱导。如果没有，请更换新鲜的mTeSR并再孵育一天。诱导前不要将种子细胞保存超过两天。
9.第二天，除去培养基，用 1 × PBS 清洗细胞一次，并更换为 10 mL 神经诱导培养基（N3+SMADi）。这代表神经诱导的第一天。
10.神经诱导培养基（N3+SMADi）每天更换，直到分化第10天，此时应形成均匀的神经上皮片。
11.在第 10 天/之前，准备好聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的板，如下所示：
a.解冻 10 mg/mL 等份的聚-L-鸟氨酸 (PO)。提示：解冻后将 PO 等份保存在 4 °C 下。
b.用无菌水中按 1:500 稀释的聚-L-鸟氨酸涂上四个 10 厘米培养皿。在 37 °C、5% CO 2下孵育至少 4 小时。为了安全起见，每 10 厘米培养皿至少添加 4.5 mL 涂层溶液，以防止部分干燥。
c.包被后，除去 PO 溶液（可选：用 1 × PBS清洗板一次），并用在 1 × PBS中按 1:200 稀释的层粘连蛋白包被板。在 37 °C、5% CO 2下孵育至少 4 小时（或过夜）。重要：不要让层粘连蛋白涂层在板的任何部分干燥，因为这会影响附着细胞的密度，这对于神经分化至关重要。
d.相同的PO+层粘连蛋白包被程序可应用于 24 孔板中的无菌玻璃盖玻片，以接种细胞进行免疫染色。
e.暂停点：如果 PO+Laminin 包被的板不会立即使用，可在添加 6 mL 1 × PBS 并用封口膜密封后在 2–8 °C 下保存最多 4 周。尽管如此，我们还是建议在每次劈开之前重新涂上涂层。
12.在神经诱导第 10 天，按 1:3 分割细胞。确切的分裂率可能因细胞系而异，但目标应是在第 15 天达到 100% 汇合（表1、图5 ）。
a.去除培养基后用 1 × PBS清洗细胞，每 10 cm 培养皿添加 2 mL Accutase ，并在 37 °C、5% CO 2下孵育5 分钟。
b.在每个板中添加 3 mL 的神经诱导介质 (N3+SMADi) 或 1 × PBS，用橡胶 (TPE) 细胞刮刀机械分离细胞，然后收集在 50 mL Falcon 中。
c.× g旋转4 分钟。
d.小心去除上清液，小心细胞沉淀，并用补充有 ROCK 抑制剂 (10 μM ) (N3+SMADi+ROCKi) 的 18 mL N3+SMADi 重新悬浮细胞（假设细胞是从 2 × 10 cm 培养皿中收集的）。
e.按照 1:3 的比例分配细胞（在这种情况下，每 10 cm 培养皿预装 5 mL N3+SMADi+ROCKi 3 mL 细胞悬浮液），并在 37 °C、5% CO 2 下孵育。可选：根据表 1 中提供的范围对细胞和种子进行计数。
13.第二天（第 11 天），用不含 ROCK 抑制剂的 N3 培养基替换培养基。第 12 天再次更换介质。
如果细胞的生长速度预计在第 15 天不会达到 100% 汇合，请在第 11 天或第 12 天用 4 ng/ml FGF（1:2,500 稀释的 10 µg/ml 库存）补充培养基，并保持此状态中等，仅限一天。避免高剂量或长时间使用 FGF 进行培养，因为它可能会使细胞尾部化。
14.从第 12 天开始，每隔一天用新鲜的 N3 更换培养基（除非添加 FGF；如果添加，则相应调整培养基更换天数）。
15.第 15 天，细胞应 100% 汇合，出现玫瑰花结（图 5）。
a.提示：如果玫瑰花结不易看见，请尝试在用 PBS 清洗细胞时或更换培养基后观察它们。
b.如果细胞也接种在盖玻片上，请用 PFA（对细胞身份标记进行染色，例如 PAX6）或甲醇（对大多数中心体蛋白进行染色）固定它们。
16.在第 15 天/之前，准备好聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的板，并按照第 10 天（从D12部分开始）的描述拆分细胞。
17.从这个阶段开始，每隔一天更换一次介质（每 10 厘米培养皿 8 mL N3）。务必在细胞分裂后的第二天更换培养基，最好是用 1 × PBS 清洗细胞一次后。
18.也在第 21 天和第 27/28 天分割细胞（有关大致细胞计数，请参阅表 1），并继续更换培养基直至第 40 天（图 3）。提示：大约从第 35 天开始，更换培养基时要格外小心，因为细胞往往会局部或整个片从平板上脱落。为避免这种情况，请使用 25 mL 移液器逐滴缓慢添加介质，或仅更换一半介质，但每天一次。
19.观察细胞分化过程中的形态，看看它们是否呈现出每个阶段的典型形态（图 5 和 6）。

图 6.失败的分化图像示例。细胞可能呈现鹅卵石状或刺状/成纤维细胞样形态，具有大和/或较暗的细胞核，或增大的细胞质。应经常监测培养物（例如，在每次更换培养基后）以留意此类异常形态，这可能预示着分化的潜在失败。比例尺：200 μm 。

E.（可选）细胞的诺考达唑处理（时间：4-5 小时）

笔记：
a.诺考达唑是一种阻断微管聚合的药物，可用于评估蛋白质的微管独立中心体相互作用。为此，在收获细胞进行蛋白质分离和免疫沉淀之前 4 小时，将诺考达唑和 DMSO（溶剂，作为对照）添加到各自的培养板中（图 7）。

图 7. 诺考达唑治疗 4 小时后第 40 天的神经元。 A)诺考达唑处理的细胞B) DMSO 处理的对照细胞。比例尺：200 μm 。
b.由于诺考达唑会增加细胞死亡并降低蛋白质产量，因此可以将平板分为诺考达唑和 DMSO 处理，比例约为 60:40，以解决这种损失。
c.对于微管解聚，也可以考虑和测试替代药物，如长春瑞滨、长春新碱、秋水仙碱（Bates 和 Eastman，2017）或冷暴露（Li 和 Moore，2020），看看它们是否会减少细胞死亡。

1.到 N3 培养基中（1:1,000），终浓度为 3.3 μM 。旋转盘使其分布均匀。
2.作为对照，使用与诺考达唑板相同的比例（即 1:1,000）将 DMSO 添加到其各自的板中。
3.将板在37℃、5%CO 2下孵育4小时，在显微镜下确认解聚，并开始收集细胞用于裂解和蛋白质分离。

第二部分。蛋白质分离

F.细胞裂解以分离总蛋白（时间：2–4 小时）

笔记：
a.在免疫沉淀 (IP) 当天，新鲜配制 IP/洗涤缓冲液 A 和洗涤缓冲液 B，并在整个过程期间储存在冰上。
b.冷却离心机，将 50 mL Falcons 旋转至 4 °C。
c.× PBS预冷至 4°C 并保存在冰桶中（在诺考达唑治疗的情况下）。

1.从培养箱中取出板并吸出介质。每板用 3 mL 的 1 × PBS 清洗细胞。吸出 PBS 并添加 3 mL 新鲜的 1 × PBS。
a.提示：如果处理大量板，您可以将它们分成批次，将其余的保留在培养箱中。
b.对于诺考达唑处理的板，用冰冷的 PBS 清洗，刮擦时将板放在桶中的冰上，并且一次仅处理几个板，快速作用以阻止微管的再聚合。提示：为了保持条件尽可能相似，可以以相同的方式处理经过 DMSO 处理的板。
2.使用细胞刮刀将细胞从板上刮下，将板向侧面倾斜并将所有细胞推入 PBS 中。保持板倾斜，并使用 10 mL 移液器将 PBS 中的细胞转移到置于冰上的 50 mL Falcon 中。
3.继续刮擦细胞并转移至 50 mL Falcon 管中，将细胞合并到各自的处理中。
4.刮完所有板（或填充 50 mL Falcon）后，在 4 °C 下以 300 × g旋转5 分钟以沉淀细胞。
a.吸出 PBS（确保沉淀不被去除）。
b.暂停点：如果细胞裂解不在同一天进行，则可以将细胞沉淀在液氮中速冻并保存在-80°C。如果是这种情况，请将 IP/洗涤缓冲液 A 直接添加到冷冻沉淀上，无需在裂解当天解冻。
5.评估沉淀的体积（以毫升为单位）并添加两倍体积的 IP/洗涤缓冲液 A。
6.在冰上孵育 30 分钟。
重要的是不要过度稀释样品，因为这会影响蛋白质浓度和后续下游步骤。例如，1 mL 中含有 5 mg 总裂解液将用于免疫沉淀；因此，浓度不应低于此。
7.× g旋转 1.5 mL 管的微型离心机至 4°C。
8.孵育 30 分钟后，细胞裂解后，将裂解物分配到 1.5 或 2 mL 蛋白质低结合管中，并以 18,000 × g旋转 4°C 10 分钟沉淀细胞碎片。
在此期间，如下所述设置标准曲线的蛋白质标准品。
9.离心 10 分钟并沉淀细胞碎片后，小心地从 1.5 mL 管中取出澄清上清液，并汇集到（可选：蛋白质低结合）15 mL Falcon（关键：不要混合不同的样品）中，充分混合，然后继续下一步。提示：在合并裂解物时计算总体积是很实用的，以便稍后更准确地估计总蛋白质。
暂停点：如果不立即使用细胞裂解物，可将其保存在 -80 °C。

G.测定蛋白质浓度（时间：0.5–1 小时）

笔记：
a.在冰上准备稀释液和蛋白质标准品。
b.将试剂添加到微孔板中以及后续步骤可以在室温下完成。

1.要设置蛋白质标准品，请将 20 μL IP/洗涤缓冲液 A 添加到六个单独的管（标记为 8、4、2、1、0.5、0.25）中。将 20 μL 16 mg/mL BSA 蛋白质标准品（参见配方）添加到第一管 (8 mg/mL) 中，与其余管进行 1:2 稀释系列，直至浓度降至 0.25 mg/mL 。
示例：混合[20 μL Buffer A + 20 μL标准品]，将 20 μL该混合物转移至下一个已含有 20 μL Buffer A 的试管中，充分混匀，然后将 20 μL该混合物转移至下一个试管中，然后很快。
2.在新管中，使用 Bio-Rad 蛋白质检测试剂 A 和试剂 S (A+S) 的 49:1 比例配制预混液：
计算每四个标准品（2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL 和 0.25 mg/mL）两个重复孔，一个用于对照，每个待测量样品两个重复孔，以及两个额外孔（图 8 ）。例子：

A+S 混合 = [11 + (2 × N 个样本)] × （ 24.5 μL试剂 A + 0.5 μL试剂 S）

图 8. 使用 DC 蛋白测定测定蛋白浓度时含有蛋白标准品和稀释样品的微孔板部分布局示例

3.将 25 μL A+S 混合物添加到蛋白质读数板的孔中。
4.将 5 μL每种蛋白质标准品分别添加到两个相应的孔中，并将 5 μL仅 IP/洗涤缓冲液对照添加到各自的孔中（图 8）。
5.5 μL的细胞裂解液添加到各自含有 A+S 混合物的孔中。
如果蛋白质浓度太高，测量结果将低于线性范围。在这种情况下，可以使用样品的两种不同稀释度进行测量，例如1/4和1/10，或者其他，以确保浓度测定的准确。尝试确保至少一种样品稀释度在 2–0.25 mg/ mL 范围内。
6.从蛋白质浓度最低到最高的孔中，将 200 μL试剂 B 等分到每个待测量的孔中，并在室温下孵育 10-15 分钟。
7.测量样品在 750 nm 处的吸光度，并使用蛋白质标准测量值通过线性回归 ( y = m x + n)生成标准曲线，其中 y 是吸光度，x 是蛋白质浓度。然后，使用此公式根据吸光度计算感兴趣样品中的蛋白质含量。
a.提示：建议标准品的浓度不要超过 2 mg/mL，因为高于此值可能会丢失线性范围。计算拟合线的R 2值以检查其线性度。
b.暂停点：如果不立即使用细胞裂解物，可将其保存在 -80 °C。

第三部分：免疫沉淀

H.免疫沉淀（时间：4–5 小时）

注意：建议对每种感兴趣的诱饵至少使用不同的生物重复进行四次重复免疫沉淀。

1.计算可以使用从细胞获得的总裂解物进行多少次免疫沉淀（图 4）。
a.用于质谱分析的每次免疫沉淀需要 4-5 mg 的起始总蛋白，而用于通过蛋白质印迹评估免疫沉淀的样品可以少至 500 μg 。
b.每次免疫沉淀均在 1 mL 体积中进行。
2.在 IP/洗涤缓冲液 A 中将蛋白质裂解物稀释至 5 mg/mL，并将 1 mL 裂解物等分到每个相应的蛋白质低结合管中进行免疫沉淀。将样品放在冰上。
a.对于每组免疫沉淀，应保留一个样品用于无抗体对照。
b.作为无抗体对照的替代方案，鼓励使用与实验中使用的一抗的类别和类型相匹配的同种型特异性对照抗体作为阴性对照。
3.对于每次免疫沉淀，将 2 μg所需抗体以 5 mg/ mL 添加到 1 mL 裂解液中。对于阴性对照，不向管中添加抗体或添加同种型对照。关键：从现在开始，要非常小心样品的交叉污染。清洗过程中切勿对不同样品使用相同的吸头，并避免飞溅到管上，因为质谱法具有非常高的检测灵敏度。
4.在 4°C 冷室中将管在端到端旋转器上孵育 1 小时。孵育结束前15分钟，准备 Protein A 和 Protein G Dynabeads溶液：
a.每次免疫沉淀（包括阴性对照）在 1.5 mL 管中混合 10 μL蛋白 A 和 10 μL蛋白 G。例子：
A+G 混合 = (1 + N IP ) × ( 10 μL Protein A + 10 μL Protein G)
b.将管子放在磁条上，并在不用移液器吸头干扰珠子的情况下去除液体。
c.使用与从管中吸出的相同体积的 IP/洗涤缓冲液 A 重悬珠子，将管放在磁条上，然后除去液体。
d.再重复此洗涤两次，最后使用原始体积用 IP/洗涤缓冲液 A 重新悬浮珠子。
5.将裂解物与抗体孵育 1 小时后，向每个 IP 管以及阴性对照中添加 20 μL蛋白 A+G 混合物。在 4°C 下在旋转器上再孵育 2 小时。
6.孵育期结束后，将所有 IP 管放在磁条上。除去洗涤缓冲液，使珠子与附着在管壁上的抗体和蛋白质偶联。添加 1 mL 的 IP/洗涤缓冲液 A。
重要：每个样品均使用干净的吸头去除上清液。
关键：如果样品太多，请快速或分批工作，以避免珠子干燥。
7.将样品在 4°C 下在旋转器上孵育 15 分钟，然后重复上述步骤两次（每次孵育 15 分钟）。
8.在此过程中，将加热块预热至 95 °C。
9.在化学罩下，混合 1 × Laemmli缓冲液和 2-巯基乙醇的比例为 39:1（例如，975 μL 1 × Laemmli缓冲液 + 25 μL 2-巯基乙醇）。每个 IP 大约需要30–40 µL 。
10.第三次洗涤后，将样品放在磁条上并除去洗涤缓冲液。向每个样品中添加 1 mL 洗涤缓冲液 B，然后在 4 °C 下在旋转器上孵育几分钟。再次重复此步骤。
11.洗涤后，将样品放在磁条上并除去洗涤缓冲液。提示：可在1,000 μL吸头后使用 10/20 μL吸头，以尽可能去除上清液。立即将带有珠子的管子放在冰上并转移到通风橱中。
12.添加 30–40 μL含有 2-巯基乙醇的新鲜Laemmli缓冲液，并确保珠子充分重新悬浮。体积可以根据具体情况确定，但重要的是要在不同样品和批次之间保持一致。
13.将管在 95°C 下孵育 10 分钟。此后，将管子放在通风橱中的磁条上，并将上清液（ Laemmli缓冲液现在也含有感兴趣的免疫沉淀蛋白及其相互作用物）转移到新的蛋白质低结合管中，而不干扰珠子。
14.将样品储存在-80°C，直到所有免疫沉淀完成。关键：在质谱仪上一起运行所有样品，因为即使在不同时间点重新分析相同的样品，运行之间的差异也很常见。

I.质谱

1.QExactive HF 质谱仪上对免疫共沉淀的洗脱液进行LC-MS/MS 分析，如O'Neill 等人所述。（2022 ）。
2.一旦质谱分析的 .RAW 文件可用，请继续进行MaxQuant部分。

数据分析

目录和时间表：
第一部分： MaxQuant分析
A. 处理质谱。使用MaxQuant的 RAW 文件（3 – 10 天）

第二部分：珀尔修斯分析
B. 预处理、注释和质量控制（0.5 – 2 天）
C. 统计分析（ 2-7天）

第三部分：进一步分析
D. 合并并总结数据（0.5天）
E.进一步分析建议（变量）

*根据研究人员或资源的可用性，时间表可能与我们在此提供的估计有所不同。

数据分析的一般说明
数据分析部分包含以下主要部分（图9）：
1.处理质谱 .RAW 文件以生成强度 ( MaxQuant )
2.预处理、注释和质量控制（Perseus & R 统计软件）
a.将MaxQuant输出导入 Perseus
b.注释样本
c.质量过滤
d.[可选：添加通路注释（例如KEGG通路、GO术语）]
e.用于质量控制的聚类分析（Perseus & R 统计软件）
3.统计分析（Perseus 和 Excel）
a.t检验（火山图）
b.对蛋白质进行统计显着性排序
4.合并和汇总数据（R统计软件）
5.网络分析
补充信息中提供了沿此协议生成的中间文件和 R 脚本。

图 9.分析流程概述

第一部分： MaxQuant分析

A.MaxQuant处理质谱 .RAW 文件（时间：3–10 天）

笔记：
a.时间可能会有所不同，具体取决于计算机的处理能力、样本数量和参数。
b.结果使用MaxQuant软件处理来自质谱仪的RAW文件以生成强度（Tyanova 等人，2016）。请注意， MaxQuant目前只能在 Windows 操作系统上运行。
c.通过搜索智人Uniprot （ SwissProt ，已审查）数据库（分类单元标识符：9606，2021 年 6 月 15 日，规范序列和亚型）来鉴定蛋白质，补充信息中提供了该数据库： MaxQuant分析文件。
d.最重要的MaxQuant参数如下：
我。运行之间的匹配已启用，但仅限于重复样本之间。
二.计算iBAQ和 LFQ 强度。
三.脱酰胺 (NQ) 包含在用于蛋白质定量的修饰中。
四.提示：写入mzTab （表格部分），这是将MaxQuant结果完整上传到 PRIDE 服务器所必需的。
MaxQuant分析文件中提供的mqpar.xml文件中更详细地检查其他参数。

1.将所有.RAW文件放入同一文件夹中。
a.来自O'Neill 等人的.RAW文件的子集。 (2022 )，通过蛋白质组学鉴定数据库 (PRIDE) 保藏到ProteomeXchange联盟，登录号为 PXD031936 ( https://doi.org/10.6019/PXD031936 )。
我。转到页面： https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD031936 。
二.使用单个文件的搜索框或使用 FTP 链接，导航到页面底部下载以下.RAW文件：
1) 阴性对照：
a) UZF13667X004__7_CD7_DMSO_ctrl_92-229116.raw
b) UZF13667X003__5_CD9_DMSO_ctrl_92-229115.raw
c) UZF13667X002__1_CD11_DMSO_ctrl_92-229114.raw
d）UZF13667X006__29_CD12_DMSO_ctrl_92-229118.raw
e) UZF13667X007__40_CD13_DMSO_ctrl_92-229119.raw
f) UZF13667X005__18_CD14_DMSO_ctrl_92-229117.raw
2) CEP63 IP
a) UZF13667X010__8_CD7_DMSO_Cep63_92-229122.raw
b) UZF13667X009__2_CD11_DMSO_Cep63_92-229121.raw
c) UZF13667X012__30_CD12_DMSO_Cep63_92-229124.raw
d) UZF13667X011__19_CD14_DMSO_Cep63_92-229123.raw
3) CEP170 IP:
a) UZF13667X025__11_CD7_DMSO_Cep170_92-229137.raw
b) UZF13667X024__6_CD9_DMSO_Cep170_92-229136.raw
c) UZF13667X027__33_CD12_DMSO_Cep170_92-229504.raw
d）UZF13667X028__41_CD13_DMSO_Cep170_92-229505.raw
e) UZF13667X026__22_CD14_DMSO_Cep170_92-229503.raw
b.重要：在开始运行之前，请确保空白磁盘空间的大小至少与要分析的.RAW文件的总大小相同。
2.从https://www.maxquant.org/download_asset/maxquant/latest下载最新版本的MaxQuant软件，与.RAW文件放在同一文件夹中，然后解压缩。补充信息中提供了本出版物使用的MaxQuant版本 1.6.17.0 。
3.双击MaxQuant.exe启动该软件（无需安装）。
4.文件 > 加载参数... >选择mqpar.xml ( MaxQuant Analysis Files )与.RAW文件放置在同一文件夹中。
5.当处理另一个数据集时，删除模板中的当前文件并替换为新的.RAW文件集：
a.通过右键单击数据 > 全选来选择所有现有文件。
b.原始数据>输入数据>删除。
c.原始数据>输入数据>加载。
d.选择当前分析的所有.RAW文件。
6.可以使用上面的菜单项手动分配实验设计参数（图 10）[例如，设置实验、设置分数（参见 BOX1 )] 或使用 Excel，如下所示：

图 10. MaxQuant运行的实验设计示例

BOX1：运行之间的匹配
如果由于信息不足而无法从 MS/MS 谱图中识别某些肽序列，可以通过将运行与另一个序列匹配来补偿缺失值，从而仍然获得已识别的特征 (Tyanova 等人，2016 ) 。匹配只能在相似的样本之间进行， MaxQuant算法只能在相同或相邻的分数之间进行匹配。
提示：与总蛋白质组不同，由于 co-IP 中的不同抗体预计不会有一组非常相似的蛋白质，因此我们的目标是仅匹配重复样本。这是通过将生物复制 IP 分配给相同分数并跳过下一组 IP 的数字来完成的，以最大限度地减少误报，同时促进使用复制 IP 恢复未识别的峰（图 10）。

a.手动设置：
我。分配分数。
Ctrl+左键单击选择复制IP 。
2)原始数据 > 编辑实验设计 > 设置分数（图 11）。

图 11.为样本分配分数（在两个字段中写入相同的数字）

二.指定实验名称：
选择样本 >原始数据 > 编辑实验设计 > 设置实验 >并为每个样本指定唯一的实验名称。
b.或者，使用 Excel 批量分配参数：
我。原始数据>实验设计文件>编写模板。
二. >组合中找到文件： experimentalDesignTemplate.txt 文件夹并用 Excel 打开。
三.为每个样本分配一个唯一的实验名称（例如，文本到列功能可用于从样本名称生成它们）。为复制样品分配相同的分数编号，并为下一组重复跳过至少一个数字（例如，所有对照：1，所有 CEP63 IP：3）（参见“分数”）如图 10所示）。
四.保存文件（作为.txt ）并通过原始数据 > 实验设计文件 > 从文件读取 >找到experimentalDesignTemplate.txt （ MaxQuant分析文件）上传。
7.提供用于肽鉴定的序列数据库。
a.全局参数 > 参数部分 > 序列。
b.Fasta文件：添加 >找到.要使用的fasta文件：
UniProt数据库中检索，如下所示：
我。去 https://www.uniprot.org > 蛋白质。
二.选择人员和状态： “已审核”(Swiss-Prot)。
三.下载（全部）> 格式： FASTA（规范和亚型）。
分类单元标识符：9606（智人），规范序列和异构体（已审查），2021 年 6 月 15 日用于当前协议（ MaxQuant分析文件： 2021_02_Human_canonical_and_isoforms.fasta ）。
c.在软件上选择上传的文件（ Fasta文件路径），然后选择> 标识符规则 > UniProt标识符： >.*\|(.*)\|
8.单击软件底部的开始。
根据实验规模和计算能力，运行可能需要几天到一周以上的时间。
9.结果可以在“综合”中找到与.RAW文件放置在同一文件夹中的文件夹。组合 > txt > ProteinGroups.txt将用于后续的 Perseus 分析。

第二部分：珀尔修斯分析

B.预处理、注释和质量控制（时间：0.5-2 天）

笔记：
a.在 Perseus 软件中处理MaxQuant结果表 ProteinGroups.txt来确定诱饵的蛋白质相互作用子（Tyanova 等，2016）。教程页面和视频可以在http://coxdocs.org/doku.php?id=perseus:start找到。请注意，Perseus 目前只能在 Windows 操作系统上运行。
b.Perseus 软件为每一步生成一个新的矩阵；因此，始终将下一个运算应用于生成的最新矩阵。
c.可以通过右键单击矩阵来重新着色或重新命名矩阵，这对于较长的工作流程尤其有用。
d.可以使用工作流树所在部分顶部的红色十字标记删除矩阵。
e.工作区可以随时保存并可以在以后恢复。

关键： .在 Perseus 的一个版本中生成的sps文件无法使用另一版本进行处理。因此，我们强烈建议始终记录版本号，并将软件的副本与分析文件一起保存。
提示：建议经常保存Perseus文件，以避免因偶尔的软件崩溃而导致数据丢失。
1.下载珀尔修斯软件。
a.最新版本可以在以下位置找到： https: //maxquant.net/download_asset/perseus/latest 。 Perseus 版本 1.6.14.0 （补充信息）被用于 O'Neill 等人描述的原始研究中。 (2022 ) 和当前协议。
b.双击Perseus.exe启动软件（无需安装）[ Perseus Analysis Files : 1_ExampleAnalysis_Part1.sps ]
2.将MaxQuant结果表导入 Perseus：
a.对于该协议，使用了以下示例数据集：
我。阴性对照：
1）UZF13667X004__7_CD7_DMSO_ctrl_92-229116.raw
2）UZF13667X003__5_CD9_DMSO_ctrl_92-229115.raw
3） UZF13667X002__1_CD11_DMSO_ctrl_92-229114.raw
4) UZF13667X006__29_CD12_DMSO_ctrl_92-229118.raw
5) UZF13667X007__40_CD13_DMSO_ctrl_92-229119.raw
6) UZF13667X005__18_CD14_DMSO_ctrl_92-229117.raw
二. CEP63 IP
1) UZF13667X010__8_CD7_DMSO_Cep63_92-229122.raw
2) UZF13667X009__2_CD11_DMSO_Cep63_92-229121.raw
3）UZF13667X012__30_CD12_DMSO_Cep63_92-229124.raw
4) UZF13667X011__19_CD14_DMSO_Cep63_92-229123.raw
三. CEP170 IP：
1) UZF13667X025__11_CD7_DMSO_Cep170_92-229137.raw
2）UZF13667X024__6_CD9_DMSO_Cep170_92-229136.raw
3）UZF13667X027__33_CD12_DMSO_Cep170_92-229504.raw
4) UZF13667X028__41_CD13_DMSO_Cep170_92-229505.raw
5) UZF13667X026__22_CD14_DMSO_Cep170_92-229503.raw
b.单击“矩阵” > “加载” > “通用矩阵上传” （绿色箭头指向左上角）。
c.文件：选择 >找到MaxQuant结果文件夹： combined > txt > ProteinGroups.txt [ Perseus Analysis Files : 2_ ProteinGroups.txt ]
d.通过选择左侧菜单上的项目并使用箭头转移到右侧的相应类别来包含列。提示：按住 Ctrl 按钮和/或左键单击并下拉可以进行多项选择。可以使用右侧的向上和向下箭头更改类别内项目的顺序。我们在初始上传中包含了标记为“可选”的列，然后将其删除，以防在分析过程中必须回顾性检查某些参数，以避免重新开始。 [示例分析_第 1 部分：完整矩阵]
我。主要（实验定量结果）
1) LFQ 强度（对于每个样本）
2) iBAQ （对于每个样品）
3) 强度（对于每个样本）
二.数值
1) 肽
2）剃刀+独特胜肽
3) 独特的肽
4)可选：序列覆盖率[%]
5)可选：唯一+剃刀序列覆盖率[%]
6)可选：独特序列覆盖率 [%]
7) 分子。重量 [ kDa ]
8) Q值
9) 分数
10)可选：强度
11）可选： iBAQ肽
12) MS/MS 计数
13) 蛋白质数量
14)可选：独特的肽（针对每个样品）
15)可选：肽（针对每个样品）
16)可选： Razor + 独特的肽（针对每个样品）
17)可选： MS/MS 计数（针对每个样品）
三.分类的
1) 仅按站点识别
2) 反向
3) 潜在污染物
4)可选：识别类型（针对每个样本）
四.文本
1)蛋白质 ID
2) 大多数蛋白质 ID
3) 蛋白质名称
4) 基因名称
5) Fasta标题
v.多数值
1) 肽计数（全部）
2) 肽计数（ razor+unique ）
3) 肽计数（独特）
e.删除可选列以避免后续分析期间文件过大 [示例分析_第 1 部分：较小的矩阵]。
我。左键单击矩阵，然后选择菜单：矩阵 > 处理 > 重新排列 > 重新排序/删除列。
二.选择右侧菜单上的项目并将相应类别转移回左侧。
3.向样本添加不同的类别，以便能够对它们进行分组以进行统计分析。
a.可以手动添加注释行：
我。矩阵 > 处理 > 注释。行 > 分类注释行。
二.行动：创造。
三.行名称：为类别指定名称。
四.为每个样本添加类别。
b.或者，为大量样本和多个类别一次性添加所有注释，在 Excel 中编辑模板文件：
我。首先，按照上述步骤创建一个模拟注释行（这是导出模板文件所必需的）[示例分析_第 1 部分：占位符类别]。
二.然后，导出到矩阵：
1)矩阵 > 处理 > 注释。 rows > 提取到矩阵[示例分析_第 1 部分：占位符注释]。
2) 选择新矩阵和“矩阵”>“通用矩阵导出” （最右上方，软盘图标）> 单击“选择”按钮选择文件夹，指定文件名，然后单击“确定”。
三.在 Excel 中打开文件并为要添加的每个类别创建一个新列（应指定字母“C”作为列类型，表示“分类”）（提示：可以使用“数据工具”>“文本到列”来截断原始列名称并以不同方式组合生成类别）（表2）。在这里，我们生成了以下类别：
1)实验： DMSO_ctrl_CD7、DMSO_CEP63_CD11、...
2)测量： LFQ、 iBAQ 、强度
3） IP： ctrl、CEP63、CEP170
4）复制： CD7、CD9、CD11、CD12、CD13、CD14
5) IP_代表： ctrl_CD7、ctrl_CD9、CEP63_CD7、...

表 2.注释文件示例
实验测量知识产权IP_代表姓名
#!{类型}CCCC时间
DMSO_ctrl_CD7LFQ控制键ctrl_CD7LFQ 强度 CD7_DMSO_ctrl
DMSO_CEP63_CD7LFQCEP63CEP63_CD7LFQ 强度 CD7_DMSO_Cep63
DMSO_CEP170_CD12LFQCEP170CEP170_CD12LFQ 强度 CD12_DMSO_Cep170
DMSO_ctrl_CD7伊巴克控制键ctrl_CD7iBAQ CD7_DMSO_ctrl
DMSO_CEP63_CD7伊巴克CEP63CEP63_CD7iBAQ CD7_DMSO_Cep63
DMSO_CEP170_CD12伊巴克CEP170CEP170_CD12iBAQ CD12_DMSO_Cep170
DMSO_ctrl_CD7强度控制键ctrl_CD7强度 CD7_DMSO_ctrl
DMSO_CEP63_CD7强度CEP63CEP63_CD7强度 CD7_DMSO_Cep63
DMSO_CEP170_CD12强度CEP170CEP170_CD12强度 CD12_DMSO_Cep170

四.将单元格“列名称”重命名为“名称”（否则 Perseus 会生成错误）并保存为.txt文件 [ Perseus Analysis Files : 3_Categories.txt ]。
v. 返回 Perseus，选择导出注释前的最后一个矩阵（较小的矩阵），然后转到“矩阵”>“处理”>“注释”。行 > 分类注释行 > 操作：从文件读取 > 输入文件：使用“选择”按钮 [ExampleAnalysis_Part1：已添加：类别] 找到保存的注释文件。
4.根据MaxQuant质量参数过滤注释矩阵。
a.矩阵 > 处理 > 筛选行>根据分类列筛选行（图 12）。

图 12.根据分类列过滤行

我。柱：仅通过位点鉴定（这些蛋白质没有经过适当的 FDR，因为它们仅通过具有修饰氨基酸的肽来鉴定）。
1) 值：+（在右侧）。
2)模式：删除匹配的行。
3）过滤模式：减少矩阵。
4) 单击“确定”。
二.列：反向（在反向诱饵数据库中找到的序列，用于计算 FDR，即可接受光谱匹配的统计截止值）。
1) 值：+（在右侧）。
2)模式：删除匹配的行。
3）过滤模式：减少矩阵。
4) 单击“确定”。
三.列：潜在污染物（质谱数据中常见污染物的蛋白质）。
1) 值：+（在右侧）。
2)模式：删除匹配的行。
3）过滤模式：减少矩阵。
4) 单击“确定”。
可选：使用“分割矩阵”检查过滤掉的内容是否看起来很重要。
b.过滤掉免疫球蛋白（这些可以来自用于免疫共沉淀的抗体）：
矩阵 > 处理 > 筛选行 > 根据文本列筛选行 > 列： Fasta标题
我。搜索字符串： “免疫球蛋白”。
二.取消选择匹配整个单词。
三.模式：删除匹配的行。
四.过滤模式：减少矩阵。
v. 单击“确定”。
可选：使用“分割矩阵”检查过滤掉的内容是否看起来很重要。
5.可选：添加通路注释（例如KEGG通路、GO术语）；这也可以稍后完成。
a.下载注释：
我。工具 > 注释下载 > http://annotations.perseus-framework.org > Perseus注释
1) >常用> mainAnnot.homo_sapiens.txt.gz。
2) 也可以在以下位置找到： > OrganismSpecific > h >向下滚动找到智人。
二.下载文件（无需解压）并将其放入文件夹位置： Perseus 1.6.14.0 > bin > conf > comments。
b.添加注释：
矩阵 > 处理 > 注释。列 > 添加注释。
我。来源：选择mainAnnot.homo_sapiens.txt.gz （现在应该自动列出）。
二. UniProt柱：蛋白质 ID。
三.添加您感兴趣的注释，例如：
1) GOBP 名称
2) GOMF 名称
3) GOCC 名称
4）KEGG名称
5）昆仑表
6.在下一步分析之前导出矩阵作为备份： Matrix > Export > Generic Matrix Export > AfterBasicFilters.txt。
a.更正由于在 Excel 中打开文件而可能转换为日期的缺失蛋白质名称或基因符号（例如，SEPTIN、MARC）（图 13）。

图 13.注意蛋白质名称；在 Excel 中处理文件时，这些可能会转换为日期

b.其他可能有问题的蛋白质名称包括：CALM3 (Calmodulin-3、P0DP25)、PBX3、CV015、TMM70、CC201、CRCC2、TPM1、TPM3、MIC60、MACF1、ZN683、HNF4A、ASCC1 和 SREK1（例如，缺少蛋白质名称或基因）名称）。
c.更正后，另存为.txt文件[ Perseus Analysis Files : 4_AfterBasicFilters.txt ]。
7.聚类分析（使用Perseus和R软件）：
a.珀尔修斯
我。上传更正后的AfterBasicFilters.txt文件： Matrix > Load > Generic matrix upload。
二.预处理：
1)变换数据 [ExampleAnalysis_Part1: log2 (x+1) ]: Log2-变换：矩阵 > 处理 > 基本 > 变换
a)变换： log2(x+1)。
b)列：选择所有主要列。
2) 对 LFQ 强度进行子集化：矩阵 > 处理 > 重新排列 > 重新排序/删除列。
3) 将iBAQ和强度列转移回左侧，并仅保留 LFQ 强度作为主列[ExampleAnalysis_Part1: LFQ ]
三.过滤掉总共少于两个样本中检测到的蛋白质：
1)矩阵 > 处理 > 筛选行 > 根据有效值筛选行。
2)最小。有效数> 数量：2。
3）模式：总共。
4)值应 > 大于： 0。
5）过滤方式：约简矩阵。
四. PCA 分析（图 14）：矩阵 > 分析 > 主成分分析（带有红点和蓝点的符号）。

图 14. PCA 分析（LFQ 强度）

1) 可以通过以下方式使标签可见： “点”选项卡>右键单击数据 >全选>显示标签（顶部为灰色标签标志）。可以使用绘图顶部的菜单项更改标签文本。
PCA 的“点”和“类别”选项卡中的菜单对重复进行着色。
3) 符号类型、大小和颜色可以修改。
v. 层次聚类（图 15）：矩阵 > 分析 >层次聚类。
1) 可以使用默认设置。
“热图”选项卡上的菜单项（大小、要显示的标签、颜色等）调整热图的外观（图 16）。

图 15.当前分析中样本的层次聚类（LFQ 强度）

图 16. 可以使用菜单中的菜单项调整热图的外观

b.使用R统计软件进行降维分析：
我。导出为 PCA 分析过滤的矩阵：矩阵 > 导出 > 通用矩阵导出 > 选择：LFQ.txt [ Perseus 分析文件： 5_LFQ.txt ]。
二.请参阅示例 R 脚本6_Cluster_Analysis.R （ Perseus 分析文件）。
三.使用 R运行tSNE和 UMAP 分析（图 17）。

图 17. tSNE和 UMAP 可视化（LFQ 强度）

C.统计分析（时间：2-7天，取决于样本数量）

注意：在这里，我们提供了多种统计分析方法中的一种方法；也可以使用替代测试或方法来评估富集的蛋白质。

1.创建一个单独的.每个诱饵都有一个sps文件，从AfterBasicFilters矩阵开始。在本例中，我们生成了以下两个文件：
a.珀尔修斯分析文件： 8_ExampleAnalysis_Part2_CEP63.sps。
b.珀尔修斯分析文件： 9_ExampleAnalysis_Part2_CEP170.sps。
2.运行t检验（火山图）：
a.导入过滤和校正的数据[ Perseus 分析文件： 4_AfterBasicFilters.txt ]：矩阵 > 加载 > 通用矩阵上传>
b.转换数据 [ExampleAnalysis_Part2_CEP63: log2 (x+1) ]
我。 Log2 变换：矩阵 > 处理 > 基本 > 变换
二.变换： log2(x+1)
c.将 LFQ 强度子集为新矩阵以运行统计测试[ExampleAnalysis_Part2_CEP63: CEP63 LFQ ]。矩阵 > 处理 > 重新排列 > 重新排序/删除列 >仅保留感兴趣诱饵和阴性对照的 LFQ 强度，并将其余主列转移到左侧。例如，新矩阵可能包含以下主要列：
我。 LFQ 强度 CD7_DMSO_ ctrl
二. LFQ 强度 CD9_DMSO_ ctrl
三. LFQ 强度 CD11_DMSO_ ctrl
四. LFQ 强度 CD12_DMSO_ ctrl
v. LFQ 强度 CD13_DMSO_ ctrl
六. LFQ 强度 CD14_DMSO_ ctrl
七. LFQ 强度 CD7_DMSO_ Cep63
八． LFQ 强度 CD11_DMSO_ Cep63
九. LFQ 强度 CD12_DMSO_ Cep63
X。 LFQ 强度 CD14_DMSO_ Cep63
d.可选：如有必要，删除任何异常样本。
我。下图可用于确定异常值：
1）主成分分析图。
2)剖面图（即箱线图）。
3）多散点图。
4) tSNE /UMAP（R 软件）。
二.矩阵 > 处理 > 重新排列 > 重新排序/删除列 >将相应的异常值列转移到左侧（如果有）。
e.过滤掉少于两次重复中检测到的蛋白质[ExampleAnalysis_Part2_CEP63：过滤：2+ 有效]。
矩阵 > 处理 > 筛选行 >根据有效值筛选行。
我。分钟。有效数> 数量：2。
二.模式：至少在一组中。
三.分组： IP（您的注释之一）。
四.值应 > 大于： 0。
v.过滤模式：减少矩阵。
f.应用 t 检验（不配对单尾学生 t 检验）：矩阵 > 分析 > 火山图。
我。分组： IP。
1）第一组（右）： CEP63。
2）第二组（左）： ctrl。
二.测试： t检验。
三.侧面：左侧。
四.随机数： 1,000。
v. FDR ：0.1， S0 ：10（初始设置）。
3.π 值将蛋白质划分为统计显着性类别（Xiao 等人，2014）：
a.将数据传输到 Excel 文件。
在火山图的表格部分中：点> 右键单击数据 >全选> 右键单击数据。
我。 > 复制选定的行 >粘贴到 Excel 文件。
二.或者： > 纯矩阵导出... > .txt然后可以将其作为制表符分隔文件导入到 Excel 中。
b.在 Excel 中，计算π 值s [ Perseus 分析文件： 10_π-values.xlsx ]。
创建一个新列并计算-log(p-value) × 差值。
我。应该是第二列和第三列。 -log(p-value)列可能会转换为# NAME？
二. “差异”对应于倍数变化。
c.根据 π 值对蛋白质进行排序：
我。利用绘图上π 值s的自然分离（图 18），设置阈值。
在本例中，我们使用了大约 100、30、12 和 8：
1)分数 4 ：100 > π 值
2)分数 3 ：100 > π 值> 30
3)分数 2：30 > π 值> 12
4)分数 1 : 12 > π 值> 8
二.无论其π 值如何，请勿接受以下任何内容：
1) 差异（倍数变化）< 5
2) -log(p-值) < 0.9
三.在这种情况下，火山图中与这些截止值相对应的 FDR 和 S0 值为：
1) CEP63： FDR： 0.03， S0： 10
2) CEP170： FDR： 0.06， S0： 10
四.回到珀尔修斯，根据分数给火山图上的蛋白质着色：
1) CRITICAL：这些颜色随后将在 R 脚本中用于分配分数。因此，请确保在分析中使用完全相同的颜色。
2)提示：在火山图中搜索给定分数最高和最低的几种蛋白质，首先对它们进行着色，然后对介于两者之间的蛋白质进行着色，这会很有帮助。

图18.根据π 值排名和着色的蛋白质火山图。从最高到最低排名： 4分；得分3；得分2；得分 1

4.将重要的排名值传输到 Excel：
a.首先，选择所有非彩色（灰色）点；然后，反转选择以保留彩色（重要）的选择，如下所示：
我。在火山图的表格部分：点>。
二.单击“符号颜色”列中的灰色（非彩色）点，然后复制表格下方显示的值[即默认值：Color2（A = 255，R = 169，G = 169，B = 169）] 。
三.右键单击数据：
1) >查找...：颜色2 [A = 255，R = 169，G = 169，B = 169]。
2) > 查看：符号颜色。
3) >查找全部 >右键单击行 >选择全部并关闭此窗口。
四.点> 右键单击数据 >反转选择。现在，应选择所有重要的彩色（非灰色）点。
v. 右键单击数据 >复制所选行。
六.将复制的数据粘贴到 Excel 文件中相应的选项卡[ Perseus Analysis Files : 11_ Selection_from_Volcano.xlsx ]。
1) 为每个分析的诱饵创建一个单独的选项卡。
2) 重命名“-Log(p-Value)” 列（可能会更改为 “＃姓名？”通过 Excel）为“minus_log10_p ”。
3)如果转换为日期，则更正Septins和其他有问题的基因名称（在 B6 节和图 13 中提到）。

第三部分。更深入的分析

D.合并并总结数据（时间：0.5 天）

1.使用 R组合并清理Selection_from_Volcano.xlsx中保存的数据 [珀尔修斯分析文件： 12_Tidy_Data.R ]。该脚本生成两个 Excel 文件：
a.Significant_Final.xlsx。该文件的每个选项卡列出了一种诱饵富集的蛋白质，包括基因名称、蛋白质 ID、蛋白质名称、-log(p 值)、log(倍数变化)（即差异）和显着性分数（4：最高，1：最低）。
b.Significant_Final_Frequencies.xlsx。该表总结了每种蛋白质被拉下的诱饵数量以及得分。

E.进一步分析建议（TIMING：变量）

1.Cytoscape软件使用诱饵-蛋白质成对相互作用来生成网络： https://cytoscape.org/ 。
2.可以使用 STRING 数据库来分析诱饵相互作用物之间的蛋白质-蛋白质相互作用的基因本体 (GO) 术语：https: //string-db.org/ 。
使用“多个蛋白质”搜索选项并使用Significant_Final.xlsx的 Gene.names2 列文件进行搜索，因为它列出了单个蛋白质名称而不是蛋白质组。

食谱

注：对于需要调节pH值的溶液，最初使用~60% ~ 80%体积的水溶解试剂，调节pH值后才补充体积。

1.2M 氯化钠
试剂兆瓦数量
氯化钠58.44克/摩尔23.376克
蒸馏水
最终的200毫升
*可在室温下保存。

2.0.5 M EDTA，pH 7.5
试剂兆瓦数量
乙二胺四乙酸292.24克/摩尔14.612克
蒸馏水
决赛_100毫升
*添加 NaOH 颗粒并加热后溶解，pH 7.5。可以在室温下保存。

3.0.5 M EGTA，pH 7.6
试剂兆瓦数量
EGTA380.35克/摩尔19.018克
蒸馏水
决赛_100毫升
*添加 NaOH 晶体并加热后溶解，pH 7.6。可以在室温下保存。

4.1 M Tris-HCl，pH 7.5
试剂兆瓦数量
Tris碱基121.14克/摩尔24.228克
蒸馏水
决赛_200毫升
*用浓 HCl 将 pH 调节至 7.5。可以在室温下保存。

5.0.5 M Tris-HCl，pH 6.8
试剂兆瓦数量
Tris碱基121.14克/摩尔12.11克
蒸馏水
决赛_200毫升
*用浓HCl将pH调节至6.8。可以在室温下保存。

6.10% Triton X-100 (v/v)
试剂库存最终浓度数量
海卫一 X-100100%10%20毫升
蒸馏水180毫升
决赛_200毫升
*可在室温下保存。

7.10% SDS（重量/体积）
试剂兆瓦数量
SDS（粉末）288.372克/摩尔10克
蒸馏水，最多100毫升
决赛_100毫升
*可在室温下保存。

8.ROCK 抑制剂，10 mM
试剂兆瓦数量
Y-27632（二盐酸盐），粉末320.3克/摩尔5毫克
无菌水1.56毫升
决赛_1.56毫升
*等分并保存在-20°C。解冻后，小瓶可保存在 4 °C 下。

9.多索吗啡，5 mM
试剂兆瓦数量
多索吗啡，粉末399.5克/摩尔5毫克
二甲基亚砜，无菌2.5毫升
决赛_2.5毫升
*仔细观察溶液溶解dorsomorphin 时，寻找漂浮的微小颗粒。如果未完全溶解，请尝试升温至 37 或 50 °C 15 – 20 分钟。等分并保存在-20°C。解冻后，小瓶可保存在 4 °C 下。

10.SB431542，10毫米
试剂兆瓦数量
SB431542 水合物，粉末384.39克/摩尔5毫克
二甲基亚砜，无菌1.3毫升
决赛_1.3毫升
*等分并保存在-20°C。解冻后，小瓶可保存在 4 °C 下。

11.诺考达唑，3.3 mM
试剂兆瓦数量
诺考达唑粉剂301.32克/摩尔2毫克
二甲基亚砜，无菌2.0114毫升
决赛_2.0114毫升
*等分并保存在-20°C。解冻的小瓶可以重新冷冻并使用几次。

12.聚-L-鸟氨酸，10 mg/mL
试剂兆瓦数量
聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐，粉末30 – 70 kDa500毫克
无菌水50毫升
决赛_50毫升
*等分并保存在-20°C。解冻后，小瓶可保存在 4 °C 下。

13.神经维持液（N3）
试剂库存稀释最终浓度体积
DMEM/F-12、 GlutaMAX TM补充剂~1:2～0.5×241毫升
Neurobas 培养基 (1×) [-] L-谷氨酰胺~1:2～0.5×241毫升
B27 与维生素 A50×1:1000.5×5毫升
青霉素-链霉素100×1:1001×5毫升
N2补充100×1:2000.5×2.5毫升
非必需氨基酸100×1:2000.5×2.5毫升
GlutaMAX TM补充剂100×1:2000.5×2.5毫升
2-巯基乙醇50毫米1:1,00050μM _500微升
胰岛素10毫克/毫升1:4,0002.5微克/毫升125微升
最终的500毫升
μm真空过滤器过滤介质。 N3 培养基在 4 °C 下可保存长达三周。

14.神经诱导介质（N3+SMADi）
试剂库存稀释最终浓度体积
神经维持液（N3）---50毫升
SB43154210毫米1:1,00010μM _50微升
多索吗啡5毫米1:5,0001μM _10微升
最终的50毫升
* 添加 SMAD 抑制剂（即 N3+SMADi）后，将培养基保持在 4 °C，并在五天内使用。

15.蛋白质标准品 (BSA) (64 mg/mL)
试剂库存
牛血清白蛋白320毫克
IP/洗涤缓冲液5毫升
决赛_5毫升
*等分并保存在-20°C。解冻的小瓶可以重新冷冻并使用几次。

16.1× Laemmli缓冲液
试剂库存最终浓度体积
Tris-HCl，pH 6.80.5M32.9毫米658微升
安全数据表10%1%1毫升
蒸馏水8.092 毫升
最终的9.75毫升
*室温下可稳定保存六个月。在使用前以小等份形式与 2-巯基乙醇以 39:1 的比例混合（例如，975 μL 1 × Laemmli + 25 μL 2-巯基乙醇）。

17.IP/洗涤缓冲液 A
试剂库存最终浓度体积
蒸馏水38.05毫升
Tris-HCl，pH 7.51M50毫米2.5毫升
氯化钠2M150毫米3.75毫升
乙二胺四乙酸0.5M1毫米100微升
EGTA，pH 7.60.5M1毫米100微升
海卫一 X-10010%1%5毫升
安全数据表10%0.1%500微升
蛋白酶抑制剂 1 片
决赛_ 50毫升
*使用当天新鲜制作。

18.洗涤缓冲液B
试剂库存最终浓度体积
蒸馏水43.55 毫升
Tris-HCl，pH 7.51M50毫米2.5毫升
氯化钠2M150毫米3.75毫升
EDTA，pH 7.50.5M1毫米100微升
EGTA，pH 7.60.5M1毫米100微升
蛋白酶抑制剂 1 片
决赛_ 50毫升
*与 IP/洗涤缓冲液 A 相同，但不含 Triton X-100 和 SDS。使用当天新鲜制作。

致谢

我们感谢 Magdalena Götz 和 Stefanie Hauck 在该项目进展过程中提供的出色技术帮助和指导。 Juliane Merl-Pham 和 Julia Schessner对蛋白质组分析的反馈。 Florian Kammerstetter对 Perseus 管道提供了全面的反馈，并提供了各种细胞分裂比的细胞计数范围。亚当·奥尼尔得到了新西兰神经病学基金会菲利普·赖特森博士后奖学金的支持。这项工作和 Fatma Uzbas的资金由 ERC（神经中心高级拨款，885382）和欧盟（NSC-Reconstruct，874758）提供。该协议是从O'Neill 等人描述的原始研究中衍生和验证的。（2022 ）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Andersen, JS、Wilkinson, CJ、Mayor, T.、Mortensen, P.、Nigg, EA 和 Mann, M. (2003)。通过蛋白质相关性分析对人类中心体进行蛋白质组学表征。自然426（6966）：570-574。
贝茨，D. 和伊士曼，A. (2017)。微管不稳定剂：不仅仅是抗有丝分裂抗癌药物。 Br。 J.克林。药理学。 83（2）：255-268。
博南斯，M.（2002）。中心体组成和微管锚定机制。电流。意见。细胞生物学。 14（1）：25-34。
博恩斯，M.（2021）。中心体的组织和功能。电流。意见。结构。生物。 66：199-206。
Brugues, J.、Nuzzo, V.、Mazur, E. 和 Needleman, DJ (2012)。成核和运输在中期纺锤体中组织微管。单元格149(3)：554–564。
Fu, J.、Hagan, IM 和 Glover, DM (2015)。中心体及其复制周期。冷泉港全景。生物。 7（2）：a015800。
Gheiratmand, L.、Coyaud, E.、Gupta, GD、Laurent, EM、Hasegan, M.、Prosser, SL、Gonçalves, J.、Raught, B. 和 Pelletier, L. (2019)。空间和蛋白质组分析揭示了中心粒卫星的中心体独立特征。 EMBO J. 38(14): e2018101109。
Hindley, CJ、Condurat, AL、Menon, V.、Thomas, R.、Azmitia, LM、Davis, JA 和 Pruszak, J. (2016)。 Hippo 通路成员 YAP 增强人类神经嵴细胞的命运和迁移。科学。报告6(1)：e1038/srep23208。
Li, G. 和 Moore, JK (2020)。低温微管动力学：微管蛋白回收限制组装的证据。摩尔。生物。单元格31(11)：1154–1166。
Lin, M.、Xie, SS 和 Chan, KY (2022)。关于中心体作为细胞周期调节剂的最新观点。细胞部门17(1)：e1186/s13008 - 022 - 00077 - 0。
刘A.、张D.、刘L.、龚J.和刘C. (2015)。 H9 细胞分化为神经外胚层的简单方法。组织细胞47(5)：471–477。
Loukil, A.、Tormanen, K. 和 Sütterlin, C. (2017)。子中心粒通过调节 Neurl-4 在中心体的定位来控制纤毛发生。 J.细胞生物学。 216（5）：1287-1300。
Müller, H.、Schmidt, D.、Steinbrink, S.、Mirgorodskaya, E.、Lehmann, V.、Habermann, K.、Dreher, F.、Gustavsson, N.、Kessler, T.、Lehrach, H.,等人。（2010）。有丝分裂果蝇中心体的蛋白质组学和功能分析。教育杂志29(19): 3344–3357。
O'Neill，AC，Uzbas，F，Antognolli，G，Merino，F，Draganova，K，Jäck，A，Zhang，S，Pedini，G，Schessner，JP，Cramer，K 等人。（2022）。人类神经细胞的空间中心体蛋白质组揭示了与疾病相关的异质性。科学376(6599):eabf9088。
Camargo Ortega, G.、Falk, S.、Johansson, PA、Peyre, E.、Broix, L.、Sahu, SK、Hirst, W.、Schlichthaerle, T.、De Juan Romero, C.、Draganova, K. ，等人。（2019）。中心体蛋白 AKNA 通过微管组织调节神经发生。《自然》 567（7746）：113-117。
Camargo Ortega, G. 和 Götz, M. (2022)。干细胞中心体异质性调节细胞多样性。趋势细胞生物学。 32（8）：707-719。
Paridaen, JT、Wilsch-Bräuninger, M. 和 Huttner, WB (2013)。中心体相关初级纤毛膜的不对称遗传指导细胞分裂后的纤毛发生。单元格155(2)：333-344。
Rattray, DG 和 Foster, LJ (2019)。蛋白质复合物成分的动力学。电流。意见。化学。生物。 48：81-85。
Sauer, G.、Körner, R.、Hanisch, A.、Ries, A.、Nigg, EA 和 Silljé, HH (2005)。人类有丝分裂纺锤体的蛋白质组分析。摩尔。细胞蛋白质组学4(1)：35–43。
RM Sears、DG May 和 KJ Roux (2019)。 BioID 作为活细胞中蛋白质邻近标记的工具。见：Nuijens, T.、Schmidt, M.（编）。酶介导的连接方法（第 299-313 页）。分子生物学方法。哈马纳，纽约。
Shinohara, H.、Sakayori, N.、Takahashi, M. 和 Osumi, N. (2013)。 Ninein 通过将中心体锚定在微管上，对于维持皮质祖细胞特征至关重要。生物。公开2(7)：739–749。
Tanos, BE、Yang, HJ、Soni, R.、Wang, WJ、Macaluso, FP、Asara, JM 和 Tsou, MF (2013)。中心粒远端附属物促进膜对接，导致纤毛起始。基因开发。 27（2）：163-168。
Tyanova, S.、Temu, T. 和 Cox, J. (2016)。 MaxQuant 计算平台，用于基于质谱的鸟枪蛋白质组学。纳特。协议。 11（12）：2301-2319。
Wang, X., Tsai, JW, Imai, JH, Lian, WN, Vallee, RB 和 Shi, SH (2009)。不对称中心体遗传维持新皮质中的神经祖细胞。自然461（7266）：947-955。
Woodruff, JB、Wueseke, O. 和 Hyman, AA (2014)。中心粒周围材料结构和动力学。菲洛斯.跨。 R.苏克。伦敦。 B 生物。科学。 369（1650）：20130459。
肖，Y.，肖，TH，苏雷什，U.，陈，HI，吴，X.，沃尔夫，SE 和陈，Y. (2014)。用于基因选择和排序的新颖的显着性评分。生物信息学30(6)：801–807。
张，X.，陈，MH，吴，X.，小谷，A.，范，J.，Doan，R.，小泽，M.，马，J.，吉田，N.，赖特，JF，等。（2016）。细胞类型特异性选择性剪接控制发育中的大脑皮层中的细胞命运。单元格166(5)：1147–1162.e15。

补充资料

在此处下载以下支持信息：
1.MaxQuant分析文件
2.MaxQuant版本 1.6.17.0
3.珀尔修斯分析文件
4.珀尔修斯版本 1.6.14.0