材料和试剂

1.通用电气 48.48 动态的大批试剂成套工具和控制线液体，10 国际金融公司（Fluidigm，目录号码：85000800) （包含控制线流体，20 × GE 样本加载中试剂）
2.TE 缓冲，酸碱度 8.0 （泰克诺瓦，目录数字： T0224）
3.细胞直接一步实时荧光定量PCR 成套工具（生活技术英杰公司, 热能费舍尔科学、目录数字： 46-7201)
4.塔克曼快速地先进的掌握混合（应用生物系统，热能费舍尔科学、目录数字： 444455）
5.移液器（第 10 页，第20页， p200, p1000) （梅特勒托莱多, Rainin Pipet-Lite XLS+)
6.细胞的兴趣（我们用过的肌细胞为了协议）
7.乙醇 70% (v/v) （ TechniSolve® ，电压波阻化学品）
8.核酸外切酶I和缓冲（新的英国生物实验室， M0658S）
9.聚合酶链式反应条的 8,200 微升，聚合酶链式反应表现经测试，透明的， PP, 平坦的帽（萨斯特，目录编号： 72.991.002)
10.12,765 数字的阵列TM 国际金融公司（标准生物工具，流体学， BMK-M-12,765)
11.TaqMan 探针 Pax3total（Boutet 等人，2012； de Morree 等人，2019）： Pax3total_Forward：5′ GTCAGAGACTGGAACATATGAAGAATGT 3′ Pax3total_Reverse： 5′ GCCTGCGGTGCTATAGGT 3′ 。 Pax3total_中： 5′ CTGCCCACATCTCAGC 3′
12.TaqMan 探针 Pax3long（Boutet 等人，2012；de Morree 等人，2019）： Pax3long_Forward：5′ TGTGTTAGCAGGACTAGACATAGAACT 3′ Pax3long_Reverse：5′ TTGAGGCTGCAACACAAAGATAACTA 3′ Pax3long_中： 5′ CACCCTGCCCAACGTA 3′
13.RNase Zap ™ RNase 净化溶液（ThermoFisher Scientific，目录号：AM9780）

设备

1.生物标记高清聚合酶链式反应机器（流式）
2.融合的射流电路（国际金融公司）控制器 MX （流式）
3.迷你离心机（Fisherbrand，目录号： 12006901）
4.扫描R 高的内容筛选显微镜（明显，型号： OLYMPUS）
5.BD FACSAria TM III 分选机（BD Biosciences，目录号：648282-24）
6.循环大师坡度热的循环仪（Eppendorf，目录号： 5331）
7.涡旋精灵 2 （科学工业、货号： SI-0236）

软件

1.数字的聚合酶链式反应分析软件（生物标志和 EP1 软件 v4.8.1)
2.图形板棱镜（图板软件公司）
3.斐济图像加工包裹（图J2）

程序

A.准备

使用逆转录酶和聚合酶步骤以及核酸外切酶步骤的方案对热循环仪进行编程。
1.设置反转录程序：将盖子加热至 105 °C，将样品在 50 °C 下孵育 15 分钟（将 RNA 反转录为 cDNA 的步骤），然后将样品在 95 °C 下孵育 2 分钟（步骤灭活逆转录酶并激活 Taq 聚合酶），将样品在 95°C 下孵育 15 秒，然后将样品在 60°C 下孵育 4 分钟（特异性靶标扩增，以形成双链 DNA）。最后，将样品在 4°C 下孵育以保存 DNA。
2.放核酸外切酶反应程序：将盖子加热至 105 °C，并在 37 °C 下孵育样品 10 分钟（以消化所有单链 DNA 和非杂交引物）。然后，将样品在 80°C 下孵育 10 分钟（以使核酸外切酶变性和失活）。最后，将样品在 4°C 下孵育以保存 DNA。

B.细胞分选

1.准备 A 单细胞暂停的你的细胞类型的兴趣。这里，我们消化的腓肠肌（小腿肌肉）和咬肌（下颌肌肉）并生成单细胞悬浮液（Frimand 等人，2022）。
2.在我们的实验中，我们对 MuSC 感兴趣，它可以根据细胞表面标记 CD31、CD45、Sca1（所有阴性标记）和 Vcam1（阳性标记）进行分离。因此，我们用抗 CD31、CD45、Sca1 和 Vcam1 的抗体对单细胞悬浮液进行染色，以便将 MuSC 分离为 Vcam1 + / Sca1 - / CD31 - /CD45 -细胞，如前所述 (Frimand et al., 2022) ）。
注意：如果要纯化其他细胞类型，则需要确定替代标记。
3.启动FACS ARIA III 并按照 BD Biosciences 手册执行 CS&T 和 Accudrop 控制。接下来，校准 FACS 的液滴位置。为此，安装板分类适配器并取出板分类臂（见图 2）。

图 2.FACS ARIA III 细胞分选仪设置。 ( A) BD Aria 3 分选臂的设置，带有 96 孔板支架和插入 96 孔板支架的 PCR 条。 (B) 带有 96 孔板支架的分选臂移至起始位置。箭头突出显示板分选适配器 (1)、板分选臂 (2) 和测试分选后的 PCR 条带，显示每个盖子中心的测试液滴（3 和插图）。 (C)盖子打开的 PCR 条插入 96孔板支架中用于分选细胞。 (D) 将 500 个细胞分选到 PCR 条的每个管中。

4.将盖子关闭的 PC CR 条插入 96 孔板支架（图 2A），将板支架安装到板分类臂上，然后将臂置于原始位置（图 2B）。对液滴进行测试排序并检查其在盖子顶部的位置；它应该位于死点（图 2B）。如有必要，调整板的位置并保存新的起始位置。
5.添加 5 μL 每管 PCR 条带2×来自 Cells Direct PCR 试剂盒的反应混合物。准备实验所需数量的管（在我们的例子中为六个），用剪刀从 PCR 条上剪下剩余的管，然后丢弃它们。将 PCR 条带（打开盖子！）放入板分类臂上的支架中（图 2C）。
6.种类 500 将第一个单细胞悬浮液的细胞放入第一个管中，使该样品管中的体积为 6 μL（5 μL 2 ×反应混合物 + 1 μL 分选细胞）（图 2D）。卸载样品，冲洗样品管线，然后加载下一个样品。将 500 个细胞分选到下一个试管中。继续进行，直到所有试管都接收到 500 个细胞。在这里，我们从三只小鼠的腓肠肌和咬肌中分选了 500 个 MuSC。
笔记：
a.CellsDirect Reaction Mix 试剂盒最多可用于 1,000 个细胞。根据细胞的 mRNA 含量，可以使用更多或更少的细胞作为输入，最多 1,000 个细胞。我们建议通过将 500 个细胞分选到 96 孔板的涂层孔中并使用显微镜计数细胞数来确认分选效率。
b.CellsDirect一步法qRT -PCR 试剂盒的组件之一。它由 dNTP、反应缓冲液和硫酸镁组成，支持聚合酶的活性。
7.盖上PCR 条带的盖子，涡旋，并立即在微型离心机中离心。样品可以保存在冰上立即使用，也可以在-20°C 下短期保存（1-2周）或在-80°C 下长期保存（6-8 个月）。
注：温度越低，样品管中收集的 mRNA 稳定性越高（ Jaquet et al., 2022）。
关键步骤：彻底涡旋样品管以混合样品成分，并在储存前将其在微型离心机中旋转。

C.逆转录酶-聚合酶反应

关键步骤：为了防止 RNase 污染，该协议的这一部分是在无菌和无 RNase 条件下进行的。戴上手套并用 70% EtOH 喷洒工作区。此外，所有步骤均在冰上进行，以提高 RNA 稳定性。建议使用化学 RNase Zap清洁工作台以防止 RNase 污染。
关键步骤： CellsDirect Reaction 混合物的内容物在使用前需要在冰上解冻，并且所有步骤都需要在冰中进行。
1.解冻这塔克曼探针和这其余的添加剂（DEPC 处理水、TaqMan 探针、重悬缓冲液、SuperScript TM III RT/Platinum TM Taq Mix 和 ROX 参比染料）细胞直接成套工具。
2.准备 A 掌握混合（细胞直接反应混合）为了你所有的样本管（在我们的实验中，六个管：三个装有从腓肠肌中分选的 MuSC 的样品管和三个装有从腓肠肌中分选的 MuSC 的样品管咬肌）。
对于六个样品管，通过添加 24 微升的重新暂停缓冲区，1.2 微升的 SuperScript ™ III RT/Platinum TM Taq 混合物，1.2 微升将 TaqMan 探针组（分别用于正向和反向引物，使每组的最终体积为 2.4 μL）、2.3 μL DEPC 处理水和 0.1 μL ROX 参考染料加入到无 RNase 的 1.5 mL Eppendorf 管中。在这里，我们使用 TaqMan 探针检测 Pax3total 和 Pax3long（每个探针都针对 Pax3 mRNA 中的单个序列）。
笔记：
a.Pax3长亚型和短亚型中的位点杂交（图 2），每个都生成不同的扩增子Pax3 反映了转录本的不同位点。
b.我们建议始终为 n 个样品 + 1 准备预混液，以确保有足够的体积用于移液。
3.在冰上的CellsDirect 2 ×中取出含有裂解细胞的 PCR 条。如果细胞之前被储存和冷冻，则在冰上解冻。
4.添加 4 μL CellsDirect Reaction mix（预混液），使每个样品管中的最终体积为 10 微升。在微型离心机中涡旋并旋转管子，然后立即将管子转移到冰他们之后被旋转下来。批判的步：涡旋样品管有助于使分子均匀分布在管中。这是确保反应体积中的分子是重要的步骤均匀地分散式。然而，随后必须进行离心步骤以汇集所有反应体积在底部的管子。
5.地方这将样品管放入热循环仪中并关闭机器。
6.跑步这撤销转录酶-聚合酶反应（程序参见步骤 A1）。
7.逆转录酶程序完成后，将含有 cDNA 的管（总体积 10 μL）置于冰上。在小型离心机中短暂旋转样品，然后将 1.2 μL 10× ExoI 缓冲液和 1 μL 核酸外切酶 I 添加到每个管中，每管总体积为 12.2 μL（在我们的例子中，有六个样品管）。在小型离心机中涡旋并旋转管子，旋转后立即将管子转移到冰上。
注意：核酸外切酶缓冲液促进核酸外切酶的活性，其消化单链 DNA，包括所有非杂交的 TaqMan 探针。此步骤确保这些非杂交探针不会干扰下游 TaqMan 检测：mdPCR 期间的 Pax3total 和 Pax3long。
8.地方这样本管后退在这热的循环仪, 关闭这机器，和跑步核酸外切酶程序（程序参见步骤 A2）
9.核酸外切酶程序完成后，立即将含有核酸外切酶的管子放入双链 cDNA 放回冰上。
10.这样品能是用过的立即或已存储在 -20 ℃ 为了短的学期（ 1 – 2 周）或者在 -80 °C 为长期 (6 – 8 个月)储存。

D.灌注 12.765 Digital Array TM集成流体电路 (IFC)

这下列的脚步坚持到这制造商的协议。
关键步骤：协议的这一部分是在无菌条件下进行的。穿戴上手套并避免在微流控芯片上方工作，以防止任何液体滴到芯片顶部，这可能会影响基因表达的准确检测。
批判的步：开关_ 在IFC 控制器 MX 机器上。预热需要 10 分钟。
1.打开微流体芯片的包装。避免接触芯片的中心。任何压力都会损坏微流体通道。未包装的芯片必须在 24 小时内使用。
笔记：该方案可以使用 Fluidigm 的其他数字 PCR 芯片来执行。
2.将控制管线流体注入芯片上的每个蓄能器中。注意不要溅出任何油性控制管线液体。
注：为了使液体易于流动并避免气泡，将控制管路流体以 45 度角注入每个蓄能器中。该液体可防止样品蒸发并有助于密封芯片。
3.插入中这芯片进入这国际金融公司控制器。
4.运行 Prime (115 × ) 脚本，通过分散油来对芯片进行灌注。运行该程序大约需要 20 分钟脚本。批判的步：一次已涂底漆，这芯片必须是已加载之内一个小时到防止这微流控室从崩溃了。

E.为数字 PCR 准备样品预混液

批判的步：这_ 该协议的部分是在无菌和无 RNase 条件下进行的。戴上手套并用 70% EtOH 喷洒工作区。
1.准备每个目标 mRNA 同工型的预混液。在 1.5 mL 中制备 6 个样品的预混液 A，其中包括 18 μL 无 DNA 水、30 μL TaqMan 基因表达预混液、3 μL 20× GE 上样试剂和 1.5 μL Pax3long TaqMan 探针艾彭多夫管。每个 TaqMan 探针均由正向引物、反向引物和中间引物组成。
2.制备6 个样品的预混液 B，其中包括 18 μL 无 DNA 水、30 μL TaqMan 基因表达预混液、3 μL 20× GE 上样试剂和 1.5 μL Pax3total TaqMan 探针管子。
3.准备两个 PCR 管条。将 9 μL 主混合物 A 添加到第一个 PCR 管条的前 6 个样品管中，将 9 μL 主混合物 B 添加到第二个 PCR 管条的前 6 个样品管中。
4.添加将 1 μL 来自步骤 C10 的 cDNA 加入到每个含有预混液 A 和预混液 B 的 PCR 样品管中，使最终体积达到 10 μL。
涡旋 PCR 样品管并在微型离心机中旋转。立即将它们放在冰上。批判的步骤：涡旋样品管有助于使分子均匀分布在管中。这是确保芯片中的样品均匀的重要步骤。

F.将样品加载到芯片上

关键步骤：我们戴上手套并用 70% EtOH 喷洒工作空间以避免污染。
1.灌注程序完成后，从 IFC 控制器 MX 上取下已灌注的芯片。
2.将 8 μL 无 DNA 水添加到每个 H 入口中。将 8 μL 从每个样品管移至各个孔中。关键步骤：将样品直接装入孔中，避免进入芯片上方以防止交叉污染。为防止上样时产生气泡，请仅移液直至出现第一个阻力。吸管。
3.将芯片返回到 IFC 控制器 MX 并选择 Load (115×) 脚本将样本加载到芯片中。将样品加载到芯片上大约需要 45 分钟。
注意：在运行软件之前，请务必确保选择了正确的脚本。
4.打开Fluidigm Biomark HD 实时 PCR 机。
注意：Fluidigm Biomark HD 实时 PCR 机需要在使用前打开，以便 CCD 相机可以冷却到最佳温度 (-5 °C)。

G.实时定量PCR

1.加载样本后，从 IFC 控制器 MX 中取出芯片。
2.将芯片以条形码朝外的方向插入 Fluidigm Biomark HD Real-Time PCR，然后单击Load 。
关键步骤：将芯片放入BioMark HD 抽屉中时，慢慢撕掉芯片下方的保护贴纸。在扩增反应期间，需要去除任何穿过芯片的光。
3.将样品加载到芯片上后，打开连接到 Fluidigm Biomark HD 实时 PCR 的桌面上的数据收集软件图标。
4.单击“开始新运行”选项。
批判的步：在将芯片装入机器之前，请仔细检查软件上的状态栏是否显示摄像头和指示灯均呈绿色。如果准备就绪，图标都将呈绿色。否则，请等待温度校准完成。
5.一次系统读取芯片上的条码，在软件上验证条码和芯片类型。
6.下一个， s选择芯片运行文件来运行程序。输入芯片信息并保存，然后进行下一步。
7.选择特定应用类型（数字 PCR）、参比染料 (ROX) 和检测探针。选择探针类型并单击下一步。
8.点击打开dPCR Standard v1.pcl 实验方案并开始运行。标准运行大约需要 1.5 小时。

H.使用数字 PCR 分析软件进行结果分析

1.选择软件上的数字 PCR 分析软件图标，运行完成后单击它。
2.到打开特定的芯片运行文件，单击“打开芯片运行”选项，然后双击chiprun.bml文件以在软件中将其打开。
3.在芯片浏览器平面中的样品和检测器设置选项下，在下拉菜单的样品类型选项下突出显示并注释您的孔（我们将样品命名为 GA1、GA2 和 GA3 以及 Mass1、Mass2 和 Mass3）在编辑器中。
4.接下来，从同一菜单中选择探测器类型并将其命名为 Pax3total 和 Pax3lo ng。
5.单击“更新”选项以完成所做的更改。要开始数据分析，请单击“分析”选项。
注：软件具有三种基线校正方式。建议测试所有三种方法并评估信号曲线的外观，该曲线应为 S 形。我们建议使用恒定基线校正。
6.点击分析一下。
7.一次这分析是完毕，点击在这控制板概括或者控制板细节到看法这结果床单在里面的形式表格、图像、或一个热图。
8.出口全部这文件和这 .csv 扩展名。

数据分析

我们从三只从当地育种计划中止的野生型 C57/BL6 小鼠的腓肠肌和咬肌中分离出 MuSC。使用胶原酶 II 和分散酶消化肌肉，然后进行染色和准备分选（Frimand 等人，2022）。然后使用 BD ARIA III FACS 将 500 个 MuSC 从染色的单细胞悬浮液中直接分选到含有 2 ×反应混合物的 PCR 管条中的样品管中（总共 6 个管：腓肠肌和咬肌各 3 个）。通过将另外 500 个细胞分选到 96 孔板中胶原蛋白包被的孔中，并在用 Hoechst 染色后通过显微镜计数细胞来确认分选的准确性（图 3A）。使用逆转录酶聚合酶反应提取和单步扩增 cDNA 后，使用 Pax3total 和 Pax3long 的 TaqMan 探针进行 mdPCR（图 3B - 3D）。每个 MuSC 平均 Pax3total 和 Pax3long 转录本的数量可以使用下面的公式 1 计算。腓肠肌和咬肌的 Pax3total 转录本数量平均每 MuSC 分别为 3.87 (± 1.93) 和 17.24 (± 0.57)。腓肠肌和咬肌的 Pax3long 转录本数量平均为 3.6 (± 0.97) 和 2.8 (± 1.81) 个 MuSC（图 3E）。根据方程 2 计算得出，腓肠肌和咬肌的 Pax3short 转录本数量平均每 MuSC 分别为 0.25 (± 0.25) 和 14.5 (± 2.21)。 mdPCR 的结果可以使用单分子 RNA 荧光原位杂交进行验证（Gaspar 和 Ephrussi，2015；de Morrée 等人，2017；de Morree 等人，2019）。

使用微流控数字 PCR (mdPCR) 对肌肉干细胞( MuSC)中的 Pax3 mRNA 同工型进行绝对定量。 (A) 将 Hoechst 染色的细胞（500 个细胞）分选到 96 孔半底板的胶原蛋白包被的孔中，以验证分选效率。显示一个 20 ×字段。 (B) 一份腓肠肌 MuSC cDNA 样本上 Pax3total mRNA 亚型的 PCR 扩增图。 (C) Pax3total 检测腓肠肌 MuSC cDNA 的 mdPCR 结果热图。红色框表示信号被放大的纳米室。 (D) 表代表从腓肠肌和咬肌分离的 MuSC 中 Pax3long 和 Pax3short 亚型的相对丰度 (n = 3)。 (E) 图表描绘了从腓肠肌和咬肌分离的 MuSC 中 Pax3long 亚型的相对量占总 Pax3 mRNA 转录物的百分比（n = 3，* = p < 0.05，不配对的双尾学生 t 检验）。

公式 1：计算每个细胞的平均分子数

( V负载× V cellsdirect )/( V室× N室)/ N细胞= 每个细胞 X 个分子

Vloading是芯片的加载体积（在本协议中，10μL，参见步骤C4）；
V cellsdirect是初始 cDNA 反应的体积（在本实验方案中为 12.2 μL，参见步骤 C7）；
V室是一个纳米室的体积（对于该芯片，为 0.85 nL）；
N室是用于样品的纳米室的总数（对于该芯片，为 765）；
N cells是加入 cDNA 合成反应的细胞数量（在我们的实验中为 500）；
X是正纳米室的数量。

( 10μL _ × 12.2μL )/ ( 0.85nL × 765)/500 = 0.375X

每个室有 A 0.85 nL 体积。每个样本是传播超过第765章室（在这案件 12.765 芯片），总体积为 0.65 μL 。在该体积中，我们检测到 X 数量的包含一个分子的正室。 X 正室数量乘以 (10 μL/0.65 μL = 12.3) 等于每个上样混合物 15.4X 个分子，因此每 1 μL样品有 15.4X 个分子。乘 15.4X x 12.2 μL ，以获得 187.7X 下每个样品的总分子。将 150.1X 除以 500 个细胞，得到每个细胞 0.375 倍的 X 分子。填写 X 的阳性纳米室数量即可得到每个细胞的转录本数量。

公式 2：计算异构体丰度

计算：
X pax3 总计 - X帕克斯3长 = X pax3短分子每细胞

X pax3 总计是每个细胞检测到的 Pax3total 分子数。 X帕克斯3长是每个细胞检测到的 Pax3long 分子的数量。 X pax3短是这数字的计算出的帕克斯3短分子每细胞。

一般注意事项和故障排除

一般的笔记

1.该方案允许对 mRNA 同工型进行绝对定量，正如我们对静止 MuSC 中同工型的测量所证明的那样。所选 TaqMan 探针设计用于特异性退火至感兴趣的位点（ Pax3total靶向短亚型和长亚型，Pax3long 靶向 Pax3long 亚型）。在 mdPCR 芯片中每个聚合酶反应的延伸阶段，酶的 5' 核酸酶活性将从完美杂交的探针上切割 5' 报告染料，从而导致荧光或信号增强（Liu 等人，2013）。该协议允许精确计算每个 MuSC 的 Pax3long 和 Pax3short 转录本的数量。它还可用于检测其他类型的 mRNA 异构体，包括选择性剪接异构体和选择性 5' UTR 异构体。
2.TaqMan 数字PCR 工作于基于 TaqMan 探针的检测化学。有其他方法可以检测基于 EVA Green Dye 化学的扩增 PCR 产物（McDermott 等人，2013）。然而，这种染料可能针对双链 DNA 的非特异性序列（Mao 等，2007）。相比之下，基于 TaqMan 的测定具有高度特异性，因为它需要三种探针和靶标之间的特异性杂交来启动荧光信号（Liu et al., 2018）。
3.该方案所需的试剂量较少，因此该方案具有成本效益（Mao et al., 2019）。然而，mdPCR 芯片价格昂贵且只能一次性使用。 CellsDirect Reaction Mix的细胞限度也受到限制，这意味着当RNA含量超过限度时，并非全部都能转化为cDNA。这可能导致对检测到的分子数量的错误评估。为了防止这种情况，最多使用 500 个细胞作为 CellsDirect 试剂盒的输入。为了确保检测到的分子数量准确，在将样品加载到芯片上之前，彻底涡旋所有样品管以使样品均匀化也很重要。这也可以通过增加用于样品混合的 cDNA 的体积来确保。

致谢

细胞分选在丹麦奥胡斯大学的 FACS 核心设施进行。人物是使用 Biorender.com 创建的。我们感谢奥胡斯大学的 Line Reinert 博士在 BioMark HD 方面提供的帮助。这项工作得到了 NovoNordiskFonden 向 ADM 提供的启动包拨款 (0071116) 和项目拨款 (0080556) 的支持。该协议已在之前的出版物中应用和验证（de Morree 等人，2019）。

竞争兴趣

这作者有不竞争金融的兴趣和不冲突的兴趣。

道德考虑

该方案是根据奥胡斯大学的动物护理指南进行的和当地道德法规。

参考

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