材料与试剂

1.叶表皮
2.双刃刀片（吉列）
3.RNaseZap ®解决方案（ Ambion ，目录号： AM9786 ）
4.福尔马林（Sigma，目录号：F8775-25ML）
5.乙酸（Sigma，目录号：695092-500ML）
6.无水乙醇（Sangon Biotech，目录号：A500737-0500）
7.DEPC（Sigma，目录号：D5758-25ML）
8.无核酸酶 10× PBS（Solarbio，目录号：P1022）
9.RNaseOUT TM重组核糖核酸酶抑制剂（Invitrogen，目录号：10777-019）
10.10× TURBO DNase TM缓冲液（Invitrogen，TURBO DNAfree TM试剂盒，目录号：AM1907）
11.DNase I，不含 RNase（Invitrogen，目录号：EN0521）
12.0.5 M EDTA，pH 8.0，不含 RNase（Ambion，目录号：AM9260G）
13.EasyScript 一步 gDNA 去除和 cDNA 合成SuperMix （ Transgen ，目录号：AE311-02）
14.DIG-11-dUTP（罗氏，目录号：11093088910）
15.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A6003-100G）
16.BM Purple AP 底物（R oche ，目录号：11442074001）
17.Tris（ Biotopped ，目录号：T6061）
18.氯化钠（Solarbio，目录号：S8210）
19.甘油（Sigma，目录号：56-81-5）
20.用 1% BSA 封闭液稀释 Anti-DIG-AP（参见配方）
21.无 DNase/RNase 水（参见食谱）
22.FAA 固定剂（参见配方）
23.洗涤缓冲液 I（参见配方）
24.1× PBS（参见配方）
25.1% BSA 封闭液（参见配方）
26.40% 甘油溶液（参见配方）

设备

1.尖头镊子（AsOne，目录号：CC-9820-01）
2.Super霜加载玻片，76毫米×25毫米（Fisher Scientific，目录号：12-550-15）
3.盖玻片（CITOGLAS，目录号：BZ1164）
4.Frame- Seal TM孵育室（Bio-Rad，目录号：SLF-0601）
5.15 mL 离心管（Corning，目录号：433052）
6.2 mL离心管（Axygen，目录号：MCT-060-A）
7.0.2 mL离心管（Axygen，目录号：PCR-02-C）
8.金属恒温培养箱（Coyotebio，目录号：H2O3-100C）
9.水浴热循环仪，一种自动化高通量水浴热循环仪，具有灵活的模块化设计，可实现快速温度变化和精确控制。关键技术参数：三个罐，温度控制在 40 – 97 °C（HC Scientific，目录号：ID 156 B03）
10.光学显微镜（Zeiss，目录号：3150012307）

软件

1.ImageJ（ https://imagej.net/software/imagej/ ）
2.Microsoft Excel（微软公司，美国新墨西哥州阿尔伯克基）

程序

A.组织固定

1.首先配制 20 mL FAA 固定液（参见配方）：2% 福尔马林、5% 乙酸和 60% 乙醇充分混合；放入 4°C 的冰箱中。
2.将 Frame- Seal TM孵育室固定在载玻片上，并向每个载玻片添加 150 μL 预冷的 FAA 固定剂。
3.组织固定前用无菌水冲洗刀片，用尖头镊子快速撕下表皮，并立即将其置于装有 FAA 固定剂的冰浴中。
4.将载玻片置于光学显微镜下，检测表皮组织是否粘有叶肉组织。如果是，则再次剥去表皮；如果没有，请继续执行下一步。
5.样品需要固定 3 – 4 次，每次 15 分钟。每次更换固定剂时尝试用移液器将其除去。固定时，用1:5%乙酸和60%乙醇配制洗涤缓冲液，混匀，置于4℃冰箱中。
6.固定后，每张玻片中加入 150 μL 清洗缓冲液 1，在冰上清洗组织样本3次，每次 8 – 10 分钟。为确保充分洗涤，可稍微旋转载玻片。
7.每张玻片中加入 150 μL 1× PBS，冰上继续清洗 3 次，每次 3 分钟，以维持离子浓度；最后，将预混料添加到每张玻片中：102 μL 无 RNase 水 + 3 μL RNaseOUT TM核糖核酸酶(RNase) 抑制剂（见图 1）。

图1.原位RT-PCR流程示意图

B.基因组 DNA 的去除

1.主混合配置：12 μL 10× TURBO DNase TM buffer + 3 μL 1UμL -1 DNase I。混合后，添加到样品中，最终体积为 120 μL，并盖上盖玻片。
2.提前将金属浴温度调节至 37°C，并将载玻片放入金属浴中1 小时。
3.将金属浴温度调节至70 ℃，用镊子小心取下盖玻片，向载玻片中加入4μL 0.5M EDTA pH 8.0，盖上盖玻片灭活15min，4℃冰箱保存约5分钟。
4.使用镊子小心地取下盖玻片。由于在高温孵育过程中表皮可能会粘在盖玻片上，因此可以使用无菌手术刀将其移入溶液中，并使用移液器尽可能多地去除 DNase 溶液。
5.将 200 μL 预冷的 DEPC 水移入载玻片中，在冰上清洗样品。为确保充分洗涤，可稍微旋转载玻片。
6.为了不影响后续实验，清洗后用移液器尽可能弃去无RNase的水（见图1）。

C.逆转录

1.为了获得更高的合成效率，首先配置引物和无RNase水预混液：3μL 10μM基因特异性反向引物+84.6μL无RNase水。
2.立即将预混物添加到已除去无 RNase 水的载玻片中，并用盖玻片盖住。
3.提前将金属浴温度调至65℃，将载玻片在65℃孵育8min，并在孵育过程中配制RT反应液。
4.孵育结束后，调节金属浴温度至42℃；然后，用尖头镊子小心地取下盖玻片，并在载玻片冰浴 2 分钟后添加 RT 预混料（表 1）。为了避免原位RT-PCR 过程中出现假阳性，我们使用了 RT 反应中未使用逆转录酶的对照。

表 1. RT 反应预混物
成分体积
2× ES 反应混合物30微升
EasyScript ® RT 酶混合物1.2微升
RNaseOUT TM核糖核酸酶（RNase）抑制剂1.2微升

5.添加 RT 预混料后可能会出现气泡；用10μL移液器小心地吸出它们，然后盖上盖玻片。
6.将载玻片放入金属浴中，并在 42°C 下孵育 1.5 小时。然后，将金属浴温度调节至 85°C，孵育 1 分钟以灭活逆转录酶。孵育后，取出载玻片并置于 4°C 冰箱中 5 分钟（见图 1）。

D.原位PCR

1.由于水浴PCR热循环仪温度较低，因此在实验开始时需要打开热循环仪进行预热。 PCR 反应是预混合的（表 2）。当载玻片置于 4°C 时，配置原位 PCR 混合物。

表 2. 引物设计
底漆引物序列
文胸001929F5′-GAA CAA GTC GTG CTT GGC TG-3′
文胸001929R5′-CAC GTG TTT ATA CCT ACT TGC CT-3′

2.涡旋并短暂离心配置的原位 PCR 混合物，并将其放入 4°C 的冰箱中。
3.用镊子小心地取下盖玻片并除去 RT 反应溶液。
4.取 200 μL 预冷的无 RNase 水在冰上清洗组织 3 次。为确保充分洗涤，可稍微旋转载玻片。
5.为了不影响后续PCR，清洗后用移液器尽可能吸去无RNase的水。
6.将 90 μL 预冷的原位 PCR 混合物（表 3 中）添加到每个样品中。若有气泡，用10μL移液器小心吸出。最后，小心地粘上聚酯盖，并将它们牢牢地沿着框架边缘压紧。避免挤出 PCR 混合物。
Bra001929的引物是根据以下准则设计的：引物长度为18-24 bp，GC含量为40%-60%，3'端的最后五个碱基GC含量较低，这导致了配对Bra001929的引物。
建议的 PCR 循环设置见表 4。然而，退火温度和延伸时间根据引物和产物大小进行调整（参见图 1）。

表 3. PCR 反应
成分体积
水分子_64.94μL
5 × Phusion 高频缓冲器*18微升
10 mM dNTP1.8微升
正向引物4.5微升
反向底漆4.5微升
Phsion DNA 聚合酶0.9微升
地高辛11-dUTP0.36微升

表 4. PCR 循环说明
循环步骤3步协议周期
温度时间
初始变性98℃30秒1
变性98℃10秒35
变性55℃25秒
扩大72℃5秒
最终延期72℃7分钟1

E.免疫分析

1.框架和聚酯盖粘合得非常紧密。如果直接撕下来，框架也会从载玻片上撕下来。因此，将载玻片在冰上孵育，并使用无菌手术刀沿框架切掉聚酯盖。
2.剪掉聚酯盖后，小心地取出 PCR 混合物。
3.移取 200 μL 预冷的 1× PBS，在冰上清洗组织 3 次，每次 3 分钟。为确保充分洗涤，可稍微旋转载玻片。
4.每次洗涤后尽可能多地去除 1× PBS。
5.提前将金属浴温度调节至37℃；向组织样本中加入100 μL 1% BSA封闭液，轻轻旋转玻片混匀，室温孵育30 min。
6.在新鲜的 1% BSA 封闭溶液中以 1:500 稀释碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体。每个样品需要配置 80 μL：0.16 μL 抗地高辛-AP + 79.84 μL 1% BSA 封闭液。储存在 4°C 的冰箱中。
7.室温封闭后，小心除去 1% BSA 封闭液，将 100 μL 碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体结合液移至组织样本中，室温孵育 1 h。
8.抗原和抗体孵育后，小心除去抗体结合溶液。
9.加入 150 μL 洗脱缓冲液 II，仔细冲洗组织样本 3 次，每次 10 分钟。
10.洗脱后，避光向组织样本中加入 70 μL 碱性磷酸酶底物 BM Purple（使用前将碱性磷酸酶底物倒置混匀），室温放置 30 分钟（不加盖玻片）。然后，每 15 分钟在光学显微镜下观察一次（放大 10 倍）。
11.一旦检测到紫蓝色放大信号，找到最佳位置拍照并存档。然后，除去碱性磷酸酶底物，将150μL洗脱缓冲液II移入载玻片中，在冰上洗涤样品3次，每次2分钟，然后用冰上无菌水洗涤1次。最后，添加 40 μL 40% 甘油进行封片，并盖上盖玻片（见图 1）。

数据分析

使用基于三个重复的优化方案，阳性保卫细胞表现出显着的杂交信号（图 2）。在这里，我们使用光密度值来评估杂交信号强度。首先，使用ImageJ（1.53c；Wayne Rasband软件；National Institutes of Health；USA）进行图像分析，获得感兴趣区域（ROI）和Area（选定范围的区域）和IntDen（IOD）的光密度结果中的阳性保卫细胞、阳性表皮细胞、阴性保卫细胞和阴性表皮细胞的选定范围）。 IntDen与Area的比值是单个细胞的平均光密度值。使用 Microsoft Excel（Microsoft Corp.，Albuquerque，NM，USA）分析数据。结果表示为平均值±SEM（平均值的标准误差，见图3）。

白菜保卫细胞中原位RT-PCR的三个重复。 A. _首先复制并可视化保卫细胞中目标基因的转录本。 B. 第二份副本。 C. 第三份副本。红色字母代表保卫细胞，蓝色字母代表表皮细胞。没有 RT 的对照显示保卫细胞中没有转录物的可视化。 8位灰度图像由ImageJ软件转换。比例尺代表 100 μm。

图 3.原位RT-PCR 中不同细胞的三个重复的平均光密度值。 A. 阳性保卫细胞的平均光密度值对应于用红色字母标记的阳性细胞的灰度图像（图 2b、2f、2j ）。 B. 阳性幻灯片中对照表皮细胞的平均光密度值对应于用蓝色字母标记的阳性细胞的灰度图像（图2b、2f、2j ）。 C. 对照保卫细胞的平均光密度值对应于用红色字母标记的对照细胞的灰度图像（图2d 、2h、2l ）。 D.对照表皮细胞的平均光密度值对应于用蓝色字母标记的对照细胞的灰度图像（图2d、2h、2l ）。误差是根据细胞平均值的标准偏差计算的，条形顶部的不同字母表示显着差异。

食谱

1.无 DNase/RNase 水
将 1 mL DEPC 添加到 1,000 mL 去离子水中，制备 0.1% DEPC 水。将其放入1000mL蓝盖瓶中，摇匀混匀，静置24h，然后高压40min去除DEPC。

3.美国联邦航空局固定剂
2% 福尔马林、5% 乙酸、60% 乙醇

4.洗涤缓冲液 I
5%乙酸、60%乙醇

5.无 DNase/RNase 水
将 1 mL DEPC 添加到 1,000 mL 去离子水中，制备 0.1% DEPC 水。将其放入1,000 mL蓝盖瓶中，摇匀混匀，静置24 h，然后高压40 min，去除DEPC。

6.1×PBS
1 mL 10× PBS + 9 mL H 2 O

7.1% BSA 封闭液
在 1% BSA 封闭液中稀释抗地高辛-AP：0.16 μL 抗地高辛-AP + 79.84 μL 1% BSA 封闭液。

8.洗涤缓冲液 I
100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L 氯化钠

9.40%甘油溶液
4 mL 甘油溶液 + 6 mL H 2 O

致谢

该工作得到了国家自然科学基金（批准号：31630068）、农业部园艺作物生物学与遗传改良重点实验室的支持。该协议是根据 Athman 等人之前的工作进行修改的。（2014）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

Athman , A.、Tanz, SK、Conn, VM、Jordans, C.、Mayo, GM、Ng, WW、Burton, RA、Conn, SJ 和 Gilliham, M. (2014)。方案：一种快速、简单的原位 PCR 方法，用于定位植物组织中的基因表达。植物方法10：29。
PJ 贝茨、G. 桑德森、ST 霍尔盖特和 SL 约翰斯顿 (1997)。 RT-PCR、原位杂交和原位 RT-PCR 检测石蜡切片中鼻病毒感染的比较。 J.维罗尔。方法67(2)：153-160。
Ferdous, J.、Sanchez-Ferrero, JC、Langridge, P.、Milne, L.、Chowdhury, J.、Brien, C. 和 Tricker, PJ (2017)。大麦干旱胁迫下 microRNA 的差异表达和潜在靶标。植物细胞环境。 40（1）：11-24。
Hoyland, JA、Mee, AP、Baird, P.、Braidman, IP、Mawer, EB 和 Freemont, AJ (1997)。使用原位逆转录酶聚合酶链反应演示骨中雌激素受体 mRNA。骨头20(2)：87-92。
Hocking, B.、Conn, SJ、Manohar, M.、Xu, B.、Athman, A.、Stancombe, MA、Webb, AR、Hirschi, KD 和 Gilliham, M. (2017)。拟南芥钙/质子交换器的异二聚化有助于调节保卫细胞动力学和植物防御反应。 J.Exp。机器人。 68（15）：4171-4183。
Kher, R. 和 Bacallao, R. (2001)。直接原位逆转录酶-聚合酶链反应。是。 J.生理学。细胞生理学。 281(2)：C726–732。
迪肯，R. 和卡尔登霍夫，R. (1997)。光抑制受体蛋白激酶：来自拟南芥的新型光调节基因。普兰塔202(4): 479–486。
Cubas-Nuñez, L.、Duran-Moreno, M.、Castillo-Villalba, J.、Fuentes-Maestre, J.、Casanova, B.、Garcia-Verdugo, JM 和 Gil-Perotin, S. (2017)。针对电子显微镜优化的原位 RT-PCR 可以描述大脑中目标 mRNA 表达细胞的亚细胞形态。正面。细胞神经科学。 11：141。
Martinez, A.、Miller, MJ、Quinn, K.、Unsworth, EJ、Ebina, M. 和 Cuttitta, F. (1995)。通过石蜡包埋切片中的直接原位 PCR 和原位 RT-PCR 对核酸进行非放射性定位。 J.组织化学。细胞化学。 43（8）：739-747。
Portillo, M.、Cabrera, J.、Lindsey, K.、Topping, J.、Andres, MF、Emiliozzi, M.、Oliveros, JC、Garcia-Casado, G.、Solano, R.、Koltai, H.,等人。（2013）。与拟南芥相比，线虫诱导的番茄巨细胞发育过程中独特且保守的转录组变化：基因抑制的功能作用。新植醇。 197（4）：1276-1290。
诺沃，GJ (2001)。使用原位 PCR 进行联合标记：综述。 J.组织化学。细胞化学。 49（11）：1329-1339。
奥尔森，S. 和克劳斯，K. (2019)。用于基因表达分析的激光显微切割介导的植物组织收获的快速制备程序。植物方法15：88。
Urbańczyk-Wochniak , E.、Filipecki, M. 和 Przybecki, Z. (2002)。用于植物组织原位 RT-PCR 的有用方案。细胞分子。生物。莱特。 7（1）：7-18。