材料与试剂

生物材料

Magnaporthe oryzae入门菌株，例如本方案中使用的 Guy11（Guy11 菌株可以从真菌遗传学库存中心获得）。

试剂

1.不含氨基酸的酵母氮基（BD Difco ，目录号：233520）
2.硝酸铵 98%，ACS 试剂（ Thermo Fisher，目录号：423350250 ）
3.L-天冬酰胺，99%（Thermo Fisher，目录号：B21473.36）
4.葡萄糖/D-(+)-无水葡萄糖 ACS 试剂级（MP Biomedicals，目录号：152527）
5.蔗糖（Thermo Fisher，目录号：J65148.36）
6.琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296-100G）
7.蛋白胨（ Thermo Fisher，目录号：211677 ）
8.酵母提取物（Thermo Fisher，目录号：212750）
9.酪蛋白氨基酸（Thermo Fisher，目录号：228820）
10.NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S5881-500G）
11.Na 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：S9763-100G）
12.100% 乙醇（Thermo Fisher，目录号：T038181000）
13.100%异丙醇（Thermo Fisher，目录号：T036181000）
14.RNase（Sigma-Aldrich，目录号：10109142001）
15.硝酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：221341-500G）
16.氯化钾（Thermo Fisher，目录号：A11662.0B）
17.七水硫酸镁（Thermo Fisher，目录号：A14491.0B）
18.磷酸氢二钾（Sigma - Aldrich，目录号：P3786-100G）
19.七水硫酸锌（Sigma - Aldrich，目录号：Z0635-100G）
20.硼酸（VWR，目录号： BDH9222-500G ）
21.氯化锰（Thermo Fisher，目录号：271410250）
22.七水硫酸铁，ACS，99+%（Alta Aesar，目录号： 14498-30 ）
23.六水氯化钴（Thermo Fisher，目录号：011344.30）
24.五水硫酸铜（Thermo Fisher，目录号：197722500）
25.钼酸钠（Thermo Fisher，目录号：206371000）
26.Na 4 EDTA（Thermo Fisher，目录号：J15700.A1）
27.生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B4501-100MG）
28.吡哆醇（Sigma-Aldrich，目录号： P5669-25G）
29.硫胺素（Thermo Fisher，目录号：148991000）
30.核黄素（Sigma-Aldrich，目录号：47861）
31.PABA（Sigma-Aldrich，目录号：A9878-5G）
32.烟酸（Sigma-Aldrich，目录号： N0761-100G ）
33.1 M Tris-HCl，pH 8.0（Thermo Fisher，目录号：15568025）
34.0.5 M EDTA，pH 8.0（Sigma-Aldrich，目录号：324506-100ML）
35.山梨醇（Thermo Fisher，目录号：036404.A3）
36.木霉的裂解酶（Sigma-Aldrich，目录号：L1412）
37.1 M Tris-HCl，pH 7.5 （Thermo Fisher，目录号：15567027）
38.1 M CaCl 2 （Thermo Fisher，目录号：J63122.AD）
39.PEG 4000（Polysciences，目录号：16861-250）
40.氯嘧磺隆（磺酰脲）（Thermo Fisher，目录号：J66605.03）
41.潮霉素 B （Thermo Fisher，目录号：10687010）
42.青霉素/链霉素/新霉素（PSN）抗生素100 ×溶液（Thermo Fisher，目录号：15640055）
43.Q5 DNA 聚合酶（NEB，目录号：M0491S）
44.PowerPol 2 × PCR 聚合酶混合物（Abclonal，目录号：RK20718）

解决方案

1.20 × (+) NO 3盐（参见食谱）
2.BDCM 底部介质（参见食谱）
3.BDCM 顶级媒体（参见食谱）
4.液体 CM（参见食谱）
5.CM 底部介质（参见配方）
6.CM 顶级媒体（参见食谱）
7.微量元素（参见食谱）
8.维生素溶液（参见食谱）
9.DNA 提取缓冲液（参见配方）
10.70% 乙醇（参见配方）
11.渗透 (OM) 缓冲液（参见配方）
12.ST 缓冲液（参见配方）
13.STC 缓冲液（参见配方）
14.PTC 缓冲液（参见配方）
15.1 M NaPO 4 (pH 5.8)（参见配方）

食谱

1.20 × (+) NO 3盐 (1 L)
试剂数量
硝酸钠120.0克
氯化钾10.4克
硫酸镁10.4克
磷酸钾30.4克
水分子_最多 1 升
121℃高压灭菌25分钟，冷却至室温，然后4 ℃保存。

2.BDCM 底部 (1 L)
试剂数量
不含氨基酸的酵母氮基1.7克
硝酸铵2.0克
L-天冬酰胺1.0克
葡萄糖10.0克
蔗糖273.83克
水分子_最多 1 升
琼脂1.5克/100毫升
用 1 M Na 2 HPO 4将 pH 调节至 6.0 ，并在 121 °C 下高压灭菌 25 分钟。

3.BDCM 顶部 (1 L)
试剂数量
不含氨基酸的酵母氮基1.7克
硝酸铵2.0克
L-天冬酰胺1.0克
葡萄糖10.0克
水分子_最多 1 升
琼脂1.0克/100毫升
用 1 M Na 2 HPO 4将 pH 调节至 6.0 ，并在 121 °C 下高压灭菌 25 分钟。

4.液体CM（1升）
试剂数量
20 × (+) NO 3盐50.0毫升
微量元素1.0毫升
维生素溶液1.0毫升
蛋白胨2.0克
酵母抽提物1.0克
酪蛋白氨基酸1.0克
葡萄糖10.0克
水分子_最多 1 升
用 1 M NaOH 将 pH 调节至 6.5，并在 121 °C 下高压灭菌 25 分钟。

5.CM 底部（1 升）
试剂数量
20 × (+) NO 3盐50.0毫升
微量元素1.0毫升
维生素溶液1.0毫升
蛋白胨2.0克
酵母抽提物1.0克
酪蛋白氨基酸1.0克
葡萄糖10.0克
蔗糖273.83克
水分子_最多 1 升
琼脂1.5克/100毫升
用 1 M NaOH 将 pH 调节至 6.5，并在 121 °C 下高压灭菌 25 分钟。

6.CM 上衣 (1 L)
试剂数量
20 × (+) NO 3盐50.0毫升
微量元素1.0毫升
维生素溶液1.0毫升
蛋白胨2.0克
酵母抽提物1.0克
酪蛋白氨基酸1.0克
葡萄糖10.0克
水分子_最多 1 升
琼脂1.0克/100毫升
用 1 M NaOH 将 pH 调节至 6.5，并在 121 °C 下高压灭菌 25 分钟。

7.微量元素（100 mL）
试剂数量
无菌、高压灭菌的 H 2 O80毫升
硫酸锌2.2克
硼酸1.1克
氯化锰0.5克
硫酸铁0.5克
六水氯化钴0.17克
五水硫酸铜0.16克
钼酸钠0.15克
乙二胺四乙酸钠5.0克
按顺序添加所有试剂。使用热板搅拌溶液直至沸腾。冷却至 60°C，并用 1 M KOH 将 pH 调节至 6.5。冷却至室温。用 ddH 2 O 将体积调整至 100 mL。放入高压灭菌瓶中。储存于 4°C。使用前溶液应呈深紫色。

8.维生素溶液 (100 mL)
试剂数量
生物素0.01克
吡哆醇0.01克
硫胺素0.01克
核黄素0.01克
PABA（对氨基苯甲酸）0.01克
烟酸0.01克
无菌、高压灭菌的 H 2 O高达 100 毫升
放入高压灭菌瓶中。 4°C 避光保存。

9.DNA 提取缓冲液（100 mL）
试剂数量
氯化钾7.45克
1 M Tris-HCl (pH 8.0)10毫升
0.5 M EDTA (pH 8.0)2毫升
水分子_高达 100 毫升
过滤灭菌可长期保存。

10.70% 乙醇 (1 升)
试剂最终浓度数量
乙醇（绝对）70%700毫升
水蒸气_ _不适用300毫升
全部的不适用1000毫升

11.渗透 (OM) 缓冲液 (100 mL)
试剂数量
七水硫酸镁29.0克
1 M NaPO 4 (pH 5.8)1毫升
木霉裂解酶0.75克
水分子_高达 100 毫升
2 HPO 4将 pH 调节至 5.5 。使用 0.45 μm 注射器过滤器过滤灭菌至 50 mL 离心管中。两个 50 mL 管应含有 40 mL OM 缓冲液，而第三个 50 mL 管应含有剩余的 20 mL。 OM 应在使用前一天制备并在 4 °C 下放置过夜。

12.ST 缓冲液（500 mL）
试剂数量
山梨醇54.66克
1 M Tris-HCl (pH 7.0)50毫升
水分子_高达 500 毫升
°C保存。

13.STC 缓冲液（500 mL）
试剂数量
山梨醇109.32克
1 M Tris-HCl (pH 7.5)5.0毫升
1 M CaCl 25.0毫升
水分子_高达 500 毫升
°C保存。

14.PTC 缓冲液（20 mL）
试剂数量
聚乙二醇40008.0克
山梨醇3.64克
1 M Tris-HCl (pH 7.5)200微升
1 M CaCl 2200微升
水分子_高达 20 毫升
在 121 °C 下高压灭菌 25 分钟，并在室温下保存。

15.1 M NaPO 4 (pH 5.8)
试剂数量
1 M NaH 2 PO 492.1毫升
水分子_高达 100 毫升
2 HPO 4将 pH 调节至 5.8 。将体积达到 100 mL，并在 121 °C 下高压灭菌 25 分钟。

实验室用品

1.移液器 1 ,000（Sartorius，目录号：14532053）、10（Sartorius，目录号：11014473）和 200 μL（Sartorius，目录号：10195873）
2.血清移液器（Scilogex SCI-Pet，亚马逊）
3.25 mL血清移液器（Genesee Scientific，目录号：12-106）
4.血细胞计数器（Fisher Scientific，目录号：02-671-5）
5.培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
6.手术刀（羽毛，目录号：02058370）
7.Miracloth（Calbiochem，目录号：B36658）
8.Oakridge 管（Thermo Fisher，目录号：3119-0050）
9.50 mL 锥形管（Corning，目录号：430291）
10.500 mL 烧瓶（Pyrex，目录号：4980）
11.无菌纸巾（斯科特多折纸巾，亚马逊）
12.无菌漏斗（Thermo Fisher，目录号：4252-0065PK）
13.100 mL 瓶（Kimax，目录号：14397）
14.深色托盘（Mr. Pen 植物托盘，亚马逊）
15.铝箔（Reynolds Wrap，亚马逊）
16.培养箱（精密，目录号：31483）
17.1.5 mL 微量离心管（Fisher Scientific，目录号：05-408-130）
18.0.45 μm 注射器过滤器（Fisher Scientific，目录号：09-720-514）
19.Monarch PCR 纯化试剂盒（NEB，目录号：T1030S）

设备

1.培养箱（Percival，型号：I36VL）
2.离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5810 R，带 S-4-104 转子）
3.水浴锅（Thermo Fisher，型号：180水浴系列）
4.两速 Waring 实验室搅拌机（Fisher Scientific，目录号：7010S）
5.用于 Waring 搅拌机的 Eberbach 容器（Fisher Scientific，目录号：14-509-25）
6.Incu-摇床（基准，型号：10LR）
7.热循环仪（Bio-Rad，型号：C1000 Touch）
8.Vacufuge plus（Eppendorf，型号：022820109）
9.Eppendorf 管离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5418）
10.均质器（亚马逊，SP Bel-Art ProCulture F65100-0000）
11.热板和搅拌器（Thermo Fisher，目录号：SP88854100）

程序

A.引物设计和PCR反应

1.在感兴趣基因的开放阅读框和可选择标记片段之外生成上游和下游区域。
a.设计可扩增基因开放阅读框上游 1 kb 的引物（L1、L2；图 1）。

图 1. 分裂标记引物设计

b.（L3、L4）末端后扩增 1 kb 下游。
c.请参阅表 1 查看扩增 ILV1 基因的两个片段的引物，该基因赋予磺酰脲类抗性（参见注释 1）。

表 1. ILV1 转化中使用的寡核苷酸列表（参见注释 2）
ID5′----3′序列
ILV1基因
ILV1 M13FCGCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC GTCGACGTGCCAACGCCACAG
IL 分裂 RAAGCATGTGCAGGTGCCTTC
LV1-M13RAGCGGATAACAATTTCACACAGGA TAGGTCGACGTGAGAGCATGC
LV1分体FGAGGCCGACGTCATAGGCATC
用于选择标记的 M13 序列
M13FCGCCAGGGGTTTTCCCAGTCACGAC
M13RAGCGGATAACAATTTCACACAGGA
M13 代表感兴趣的基因
M13FTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT
M13RGTCGTGACTGGGAAAAACCCTGGCG

2.使用 PCR 扩增侧翼。
a.米霉基因组 DNA 作为模板，扩增您感兴趣的基因的上游和下游区域。
b.使用含有 ILV1 的质粒作为模板，扩增两条可选择标记。
c.使用 PCR 纯化试剂盒纯化扩增片段。
d.使用第一轮 PCR 生成的 5' 产物将目的基因的上游区域与选择性标记的 5' 端融合在一起。最终 DNA 浓度应约为 5 μg（参见注释 3）。
e.使用第一轮 PCR 生成的 3' 产物将目的基因的下游区域与选择性标记的 3' 端融合在一起。最终 DNA 浓度应约为 5 μg。
f.使用 PCR 纯化试剂盒纯化所得的融合片段。
g.将含有基因上游区域和选择性标记 5' 末端的融合片段与基因下游区域和选择性标记 3' 末端合并在一根管中。
h.干燥每管直至仅约 10 μL 使用真空浓缩器存在DNA。
i.添加 50 μL STC 缓冲液（参见注释 4）。

B.原生质体世代

1.在液体完全培养基 (CM) 上培养米霉菌丝体（图 2）。

图 2. 产生液体 CM 菌丝体培养物所需的材料

a.将真菌菌株接种在三个 CM 平板上，每个平板包含三个菌落。使用 I36VL Percival 培养箱和 IncuWhite 线性 LED 照明系统，强度为 120 μ mol /m 2 /s，米霉在24 °C、 12 小时光周期下生长（图 3）。

图 3. 含有三个 5 天菌落的 CM 板
b.五天后，使用无菌手术刀从每个菌落中切下菌丝体的生长周长。（视频1）。

视频 1. 切割菌丝体的生长周长。使用刀片，将菌丝体的生长边缘从 CM 平板上切下来并放入液体 CM 中进行混合。

c.在无菌搅拌机中将菌丝体的切边与 250 mL 液体 CM 混合。高搅拌 10 秒，然后低搅拌 10 秒。
d.将混合菌丝体转移至 500 mL 烧瓶中，并向培养物中添加 250 μL 抗生素溶液。 Thermo Fisher 的 PSN 抗生素溶液以 1 ×浓度使用。
e.在 24°C、12 小时光周期下孵育培养物约48小时，并以 150 rpm 摇动（参见注释 5）。
f.24 小时后，向培养物中另外添加 100 mL 液体 CM 以及 100 μL抗生素溶液，并在 200 rpm 的振荡培养箱中放置 48 小时的剩余时间。
2.裂解菌丝体产生原生质体。
a.使用无菌漏斗和无菌 Miracloth 从液体培养物中过滤菌丝体（图 4 和 5）。

图 4. 过滤真菌培养物所需的材料

图 5. 过滤后的菌丝体

b.用无菌蒸馏水冲洗过滤的菌丝体。
c.使用无菌纸巾，通过在纸巾之间挤压菌丝体来干燥过滤后的菌丝体，以除去尽可能多的水分。
d.将干菌丝体分成两个含有 40 mL OM 缓冲液的 50 mL 猎鹰管。
e.将试管在29°C 下在摇床培养箱中以 75 rpm 的转速摇动 3 小时（参见注释 6）。
3.收获原生质体；在冰上执行以下所有操作。
a.将每个 falcon 管分成两个无菌透明聚碳酸酯 Oakridge 管。
b.缓慢滴加冷 ST 缓冲液，直至每个 Oakridge 管充满管颈（参见注释 7）（视频 2）。

视频 2. 向 Oakridge 管中缓慢添加 ST 缓冲液。菌丝体裂解后，将 OM 缓冲液和菌丝体混合物分装到两个 Oakridge 管中。使用血清移液管，缓慢添加冷 ST 缓冲液，直至管充满至颈部。
c.离心机在 4°C 下以 3,200× g离心管25 分钟，禁用制动器，以确保原生质体层的正确生成。
d.使用 1 mL 移液器，慢慢地将每个管中的原生质体吸入新的 Oakridge 管中。来自两个 Oakridge 管的原生质体可以合并成一个新的 Oakridge 管（参见注释 8）（图 6）。

图 6.离心后 Oakridge 管中原生质体的外观

e.将 STC 缓冲液添加到每个含有原生质体的新 Oakridge 管的颈部。
f.× g离心管 4 °C下 10 分钟，中间休息一半。
g.现在应该可以看到原生质体颗粒。
4.洗涤原生质体。
a.从每个 Oakridge 管中倒出所有 STC 缓冲液。
b.用 5 mL 冷的 STC 缓冲液轻轻重悬沉淀。
c.两个重悬的颗粒可以合并到一根 Oakridge 管中。
d.将 STC 缓冲液添加到每个 Oakridge 管的颈部。
e.× g离心管 4°C 下 10 分钟，中间休息一半。
f.重复步骤B4a – B4 e 2 次，总共清洗 3 次原生质体。
5.原生质体转化。
a.在 1 mL STC 缓冲液中重新悬浮最终的原生质体颗粒。
b.使用血细胞计数器计算原生质体浓度。适当的产量应为 2 × 10 8 – 5 × 10 8原生质体。相应地用 STC 浓缩或稀释原生质体（图 7）。

图 7. 收获后的原生质体。可视化放大倍数为 40 倍。

c.对于每次转化，在 1.5 mL 管中，将 100 μL 原生质体添加到已合并并重悬于 50 μL STC 中的 DNA（每个侧翼 5 μg）（参见注释 9）。
d.将管在室温下孵育 20 分钟（参见注释 10）。
e.*请注意，这是一个时间关键的步骤。避免将原生质体留在 PTC 中的时间超过规定的时间。向每个管中添加 500 μL PTC 缓冲液。将 PTC 添加到最后一个管后，启动 15 分钟计时器（参见注释 11）。
f.向每个管重复添加 500 μL PTC 缓冲液，直到所有管总共有 1 mL PTC。
g.在 15 分钟孵育期间定期翻转管子。
h.划分并标记培养皿。每个菌株应使用四个板（图 8）。

图 8. 每个菌株预留四个培养皿

6.原生质体电镀。
a.将原生质体添加到 100 mL 的底部介质中。 *请确保底部介质温度约为 45 °C ，因为较高的温度会破坏原生质体。轻轻旋转混合（参见注释 12 和 13）。
b.培养基倒入四个培养皿之间并分开（参见注释 14）（视频 3）。

视频3.媒体分工。 PTC 孵育后，将原生质体添加到几乎不热的底部培养基中，旋转并铺在四个培养皿之间。

c.凝固后，将板转移到干净的深色托盘上并用铝箔覆盖。
d.将板在 24°C 孵育 16 小时。
e.第二天，将含有相应抗生素的顶层培养基添加到转化板中（参见注释 15）。
f.将板放回暗盘中并孵育至少五天，直至出现菌落（图 9）。

图 9. 真菌转化后的菌落

C.筛选真菌菌落

1.DNA提取。
a.当菌落出现在转化板的顶层时，将菌落重新铺在含有相应抗生素的新培养基上的网格中。
b.3-6天后，使用无菌牙签或移液器尖端将少量菌丝体从每个菌落转移到无菌 1.7 mL 管中，并相应地标记每个菌落。
c.向每个管中添加 500 μL DNA 提取缓冲液。
d.使用电子均质器，粉碎菌丝体约 10 秒（参见注释 16）。
e.× g旋转管室温放置 10 分钟。
f.离心后，将上清液转移至含有 300 μL 100% 异丙醇的新管中。混合管（参见注释 17）。
g.× g离心管室温放置 10 分钟。
h.丢弃尽可能多的上清液。
i.用 300 μL 70% 乙醇清洗管。
j.× g离心管室温放置 10 分钟。
k.丢弃尽可能多的上清液。
l.将管倒置在纸巾上风干约 15 分钟。
m.所有乙醇蒸发后，向每个管中添加 30 μL 无菌水和 1 μL RNase。
n.将管在室温下孵育 20 分钟。
o.在 55°C 下孵育管 15 分钟以灭活 RNase。
p.孵育后，向每个管中添加 150 μL 无菌水。混合。
q.使用 1 μL DNA 提取物进行筛选。
2.PCR验证。
a.使用 L1 和 L4 区域之外的引物，以 DNA 提取作为模板，对每个潜在突变体进行 PCR 反应。使用野生型 Guy11 作为阴性对照（参见注释 18 和 19）。
b.在凝胶上进行 PCR 扩增。
c.验证条带大小以确认正转变（参见注释 20）（图 10）。

图 10. DNA 凝胶示意图，描述了转化后的任意扩增。该任意感兴趣的基因建议为 1 kb（尽管大小会根据所选的感兴趣基因而变化）。野生型条带将包括 1 kb 上游区域、1 kb 基因和 1 kb 下游区域，产生 3 kb 大小。阳性突变体将携带 4.8 kb 的更高条带大小，包括 1 kb 上游区域、2.8 kb ILV1 基因和 1 kb 下游区域。请注意，这些大小将根据感兴趣的基因和选择标记之间的大小差异而变化。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
费尔南德斯等人。（2021）。两种元半胱天冬酶在稻瘟病菌Magnaporthe oryzae发育和致病性中的作用。 mBio（图 S1，图 c）。使用该方案生成米霉后半胱天冬酶的突变株。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.该协议详细介绍了 ILV1 基因的使用，该基因赋予磺酰脲类抗性（基因大小：2.8 kb）。然而，可以使用其他选择标记，例如潮霉素。对于这些 PCR 反应，建议使用高保真 DNA 聚合酶，例如 Q5 和 Phusion。
2.请注意，某些引物需要添加 M13 引物序列。 M13 序列促进第一轮 PCR 期间产生的片段的融合。
3.产生 5 μg PCR 产物需要100 – 200 μL的 PCR 反应体积。
4.对于转化质粒，在真菌转化之前，应使用限制性酶将2 – 5 μg质粒线性化，进行 PCR 纯化，干燥至约 10 μL，并重悬于 50 μL STC 缓冲液中。
5.请注意，48 小时孵化期后的健康生长将产生浅棕色介质颜色。过度生长的培养物会产生深棕色/黑色培养基。
6.在此孵化期间，将装有底部培养基的瓶子放入 55°C 水浴中。另外，确保离心机温度为 4°C。
7.确保将 ST 缓冲液逐滴添加到 Oakridge 管中，以确保适当的原生质体收获。
8.原生质体位于管中部的模糊界面处。确保移取原生质体时，底部的菌丝体不受干扰。
9.应包括一个对照，该对照仅含有 50 μL 不含 DNA 的 STC 缓冲液，并与 100 μL 原生质体结合以检查原生质体完整性。
10.此时，开始从55 °C冷却底部介质瓶。 PTC 缓冲液孵育结束时，介质应足够凉爽，可以用戴手套的手触摸，并且温度应约为 45 °C。
11.首先将 PTC 缓冲液移到试管侧面周围，直至添加完所有 PTC。缓慢吸取 PTC 缓冲液和原生质体混合物两次。混合后，轻轻翻转管子两次。
12.确保介质对应于所使用的特定选择标记。 CM培养基用于潮霉素筛选； BDCM培养基用于磺酰脲类选择； BASTA 介质用于 BASTA 选择。潮霉素的储备浓度为 50 mg/mL，终浓度为 100 μg/μL。磺酰脲的储备浓度为 100 mg/mL，最终浓度为 50 μg/μL。 BASTA 用作 50 mg/mL 储备浓度，终浓度为 100 μg/μL。
13.每次转化前，高压灭菌前，底部培养基应按 100 mL 体积等分。
14.确保每个板的 1/3 充满介质。向每个板添加过多的介质将妨碍第二天正确添加顶部介质。
15.最初应使用底部介质来铺板原生质体。确保第二天使用顶级媒体进行选择。
16.磨碎的菌丝体不应长时间留在提取缓冲液中。此外，如果提取多个样品，可将均质杵浸入无菌水中，然后浸入 100% 乙醇，从而在两次样品之间对均质杵进行消毒。
17.完成此步骤后，样品可在 -20 °C 下放置过夜，第二天即可继续提取 DNA。
18.位于 L1 和 L4 区域之外的确认引物将确保基因替换具有选择性标记的内源掺入。此外，确认引物可以与内部分裂标记引物配对，以产生更小的 PCR 片段，也可以根据片段大小进行验证。
19.对于这种 PCR 筛选，DNA 聚合酶（例如 Thermo Fisher 的 DreamTaq 或 ABclonal 的 PowerPol）可用于更便宜的反应。
20.可以使用测序服务确认潜在阳性转化体的扩增子。此外，阳性转化子可以使用 Southern 印迹分析进一步验证。

致谢

这项工作得到了 UF/IFAS 研究的早期职业补助金和本科生研究实习计划的支持。图形概述以及图 1 和图 10 是使用 BioRender.com 创建的。

竞争兴趣

不存在利益冲突或利益竞争。

参考

Asibi, AE、Chai, Q. 和 Coulter, JA (2019)。稻瘟病：一种对全球粮食安全具有影响的疾病。农学9(8)：451。
Fernandez, J.、Lopez, V.、Kinch, L.、Pfeifer, MA、Gray, H.、Garcia, N.、Grishin, NV、Khang, CH 和 Orth, K. (2021)。两种metacaspases在真菌Magnaporthe oryzae的发育和致病性中的作用。 mBio 12(1)：e03471-20。
Fernandez, J.、Marroquin-Guzman, M.、Nandakumar, R.、Shijo, S.、Cornwell, KM、Li, G. 和 Wilson, RA (2014a)。水稻感染期间，植物防御抑制是由真菌 Sirtuin 介导的稻瘟病菌。摩尔。微生物。 94（1）：70-88。
Fernandez, J.、Marroquin-Guzman, M. 和 Wilson, RA (2014b)。转酮醇酶介导的代谢检查点控制水稻细胞中稻瘟病菌Magnaporthe oryzae生物营养生长的证据。 PLoS Pathog。 10（9）：e1004354。
费尔南德斯，J. 和奥尔思，K. (2018)。谷物杀手的崛起：稻瘟病菌的生物学生物营养生长。趋势微生物。 26（7）：582-597。
Foster, AJ、Martin-Urdiroz, M.、Yan, X.、Wright, HS、Soanes, DM 和 Talbot, NJ (2018)。稻瘟病菌中 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白介导的共编辑和反选择。科学。报告8(1)：e1038/s41598-018-32702-w。
Sweigard, JA、Carroll, AM、Kang, S.、Farrall, L.、Chumley, FG 和 Valent, B. (1995)。 PWL2（稻瘟菌宿主物种特异性基因）的鉴定、克隆和表征。植物细胞7(8)：1221–1233。