材料与试剂

1.15 mL 锥形管（CELLTREAT，目录号：667016B）
2.洁净室擦拭布（Fisher Scientific，Contec，目录号： 19-130-5932）
3.塑料勺子和透明塑料杯（推荐亚马逊或任何主要零售商）
4.羽毛手术刀刀片＃11（电子显微镜科学，目录号：72044-11）
5.Sylgard 184 有机硅弹性体套件（Krayden，目录号：DC4019862）
6.145 毫米玻璃培养皿（VWR，目录号：25354-127）
7.145 毫米塑料培养皿（VWR，目录号：82050-600）
8.0.2 μm PES 瓶顶过滤器（VWR，目录号： 10040-436）
9.可高温高压灭菌袋（VWR，Cardinal Health，目录号：11213-033）
10.氢氧化钠 (0.1 M NaOH)
11.氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
12.3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）（Fisher Scientific，ACROS Organics，目录号：AC430941000）； 4 ℃保存，避免与空气接触
13.25% 戊二醛 (GA)（VWR，电子显微镜科学，目录号：100504-788）；储存于 4 °C。我们发现这个GA可以保存长达三年而不改变最终结果
14.40%丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：A4058）； 4 ℃保存
15.2%双丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：M1533）； 4 ℃保存
16.过硫酸铵粉末（APS）（VWR，目录号：97064-594），在干燥器中室温保存，强氧化剂
17.四甲基乙二胺（TEMED）（VWR，目录号：97064-684）；易燃的
18.125 毫米透明亚克力圆盘（127 毫米/5 英寸亚克力圆盘可在亚马逊上找到，或者可从 McMaster-Carr 购买亚克力板并激光切割成任何尺寸或形状）
19.Sulfo-SANPAH（Covachem，目录号：13414-100）； 4 ℃保存
20.HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375-500G）
21.感兴趣的蛋白质（例如，胶原蛋白，Corning，目录号：354236）； 4 ℃保存
22.汉克缓冲盐溶液（HBSS）（ScienCell，目录号：0313）
23.Milli-Q水（或同等等级）
24.异丙醇（70%溶液）
25.乙醇（70%溶液）
26.二甲亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：276855）
27.过硫酸铵，10% w/v 溶液（参见配方）
28.Sulfo-SANPAH，100 mg/mL 溶液（参见配方）
29.HEPES 缓冲盐水 (HBS)（参见食谱）

设备

1.真空干燥器
2.天平/体重秤
3.玻璃烧杯（VWR，目录号：13912-284）
4.过滤钳（VWR，目录号：89259-954）
5.手术刀手柄#3（精细科学工具，目录号：10003-12）
6.移液辅助器和血清移液器（10、25、50 mL）
7.微量移液器和吸头套件（P10、P200、P1000）
8.烤箱，设定65°C
9.化学罩
10.带真空吸引器的生物安全柜
11.高压灭菌器
12.紫外线灯（例如 100 瓦 365 nm UVP 灯）
13.CO 2加湿培养箱，设置为 37 °C
14.-20℃冷冻室
15.4℃冰箱

程序

A.创建聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 环形模具

1.使用天平，以 9:1 的比例将 Sylgard 184 弹性体基料和 Sylgard 184 固化剂称入塑料杯中（例如，27 克弹性体基料和 3 克固化剂）。
注意：未固化的 Sylgard 184 弹性体基质高度粘稠。
2.用塑料勺彻底混合 PDMS 预聚物，倒入塑料 145 mm 培养皿中，确保表面均匀涂覆。 PDMS 预聚物的量可以增加或减少，但建议培养皿内的最终厚度为 1–1.5 mm。
3.在真空室中对培养皿进行脱气，以去除预聚物混合物中的气泡。
4.将 PDMS 预聚物在 65 °C 的烤箱中固化过夜。
注意：确保烘箱表面平整，以获得均匀的 PDMS 厚度。小至 1° 的坡度都会对下游过程产生不利影响。
5.戴上手套，从培养皿中取出固化的 PDMS 圆盘并切成环。用手术刀切出一个外径145mm、内径120mm的圆环作为垫片。
建议：使用笔或不耐溶剂的记号笔在 PDMS 圆盘上画出直径为 120 mm 的圆圈。丙烯酸盖必须与 PDMS 重叠，以在聚合过程中获得良好的密封。
6.先用 70% 异丙醇清洁 PDMS 环，然后用 70% 乙醇清洁。完全干燥。
7.将 PDMS 环密封在可高压灭菌袋内，并使用 30 分钟的灭菌周期，最低温度为 120 °C（有关可重复使用性，请参阅 F 部分）。

B.玻璃皿表面活化

注意：由于使用危险化学品，本节应在化学通风柜中进行。
1.添加足够的 0.1 M NaOH 以覆盖 145 mm 玻璃培养皿的底部，并静置 30 分钟。
2.除去多余的 NaOH，让盘子完全干燥。
3.在玻璃烧杯中，将 APTES 混入异丙醇中，制成 2% 的溶液。
4.将 APTES 溶液倒入培养皿中，直至表面完全覆盖（20 – 30 mL/培养皿），并静置 10 分钟。
注意：APTES 对氧气有反应。所列制造商的容器具有再生橡胶密封件，其中的内容物旨在通过注射器针头取出并用惰性气体（例如，N 2 ）按体积替换。当暴露于分子氧时，APTES 会失去其反应性，因此随着时间的推移，其有效性会降低。此步骤可延长 APTES 的保质期。
注意：APTES 具有腐蚀性；应使用耐化学手套、实验服和护目镜。
5.反应后，除去 APTES 溶液，并向每个培养皿中添加约 30 mL Milli-Q 水；旋转培养皿以混合，静置 5 分钟，然后除去水。
a.再重复此步骤三次，总共交换四次。
b.每次交换时，应将其处置到适当的危险废物流中。
6.将 20 – 30 mL 用 Milli-Q 水稀释的 0.5% 戊二醛添加到每个玻璃皿中，静置 30 分钟。
7.将戊二醛溶液丢弃在适当的危险废物流中，并让盘子风干。激活后 24 小时内继续聚合步骤（C 部分），以获得最佳凝胶附着效果。

C.聚丙烯酰胺凝胶聚合

注意：建议在生物安全柜 (BSC) 和/或层流罩中执行本节的部分内容，以尽量减少污染。将所有材料放入 BSC 之前，用 70% 乙醇擦拭。
1.制备丙烯酰胺的预聚物溶液。
a.许多聚丙烯酰胺凝胶配方，报告了双丙烯酰胺和丙烯酰胺的比例，以产生所需的弹性模量（ Aratyn-Schaus 等人，2010 年；Tse 和 Engler，2010 年； Syed 等人，2015 年；Charrier 等人）等，2020 ）。
b.mL 锥形管中按所需比例添加 40% 丙烯酰胺、2% 双丙烯酰胺和 Milli-Q 水，使每个 145 mm 玻璃皿的溶液总体积为 15 mL。可选：预聚物溶液可以大批量配制，用封口膜包裹，并在 4°C 下保存 3-4 天。应尽可能使用新鲜溶液，因为随着时间的推移，即使溶液的轻微蒸发也会导致聚合时储能模量发生明显变化。
c.在真空室中将溶液脱气至少 30 分钟以去除溶解的氧气。
2.在 BSC 中，使用镊子从高压灭菌袋中取出无菌 PDMS 环，并将其放入活化的玻璃培养皿内。用镊子用力按下 PDMS 环，以确保与玻璃良好接触。
3.用乙醇喷洒丙烯酸圆盘，并用洁净室抹布或压缩空气干燥，然后放置在 BSC 内。
4.将脱气的预聚物溶液放入 BSC 内。添加过硫酸铵（1:100 稀释）和 TEMED（1:1,000 稀释）来引发反应。
5.轻轻翻转管 2-3 次，并将约 15 mL 倒入玻璃培养皿中。
6.将丙烯酸盖放在 PDMS 环顶部以形成密封。
a.就像将盖玻片安装到载玻片上一样，用镊子抓住丙烯酸盖的一侧，并以一定角度设置到 PDMS 环上。
b.放下丙烯酸盖——观察它与溶液接触的情况，并检查过程中是否有气泡。
c.从环周围吸取多余的溶液，将溶液放回锥形管中，并盖上管子。使用锥形管中的额外溶液来测量聚丙烯酰胺何时胶凝，因为它将指示培养皿何时准备好。
7.聚丙烯酰胺完全聚合后（室温下约 15 分钟），取下丙烯酸盖。
吸出 PDMS-丙烯酸界面处的未聚合溶液。
注意：预期为未聚合溶液。 PDMS 环和丙烯酸盖之间的重叠旨在防止边缘不均匀的凝胶化并便于去除丙烯酸盖。
a.使用 P1000 微量移液器，将 100% 异丙醇添加到 PDMS-丙烯酸界面中，未聚合的溶液会在其中渗透，直至渗透聚丙烯酰胺-丙烯酸界面。移液时轻轻提起丙烯酸盖，以帮助异丙醇进入凝胶盖界面。
b.一旦异丙醇完全渗透到聚丙烯酰胺-丙烯酸界面，丙烯酸盖就会很容易脱落。
8.用HBS洗涤聚丙烯酰胺凝胶3次。
注意：请勿将真空吸气器放在凝胶上或直接位于凝胶上方，因为凝胶可能会陷入真空中。相反，将吸气器放在 PDMS 环上并倾斜培养皿，使液体落入真空吸气器中。
9.聚丙烯酰胺凝胶培养皿可在 4°C 下储存在 HBS 中，用封口膜或保鲜膜密封。

D.基质蛋白-聚丙烯酰胺缀合

注意：建议尽可能在 BSC 中采用无菌技术执行此部分，以尽量减少污染。所选择的细胞外基质 (ECM) 蛋白（纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白等）取决于所使用的细胞系，并且需要测试其适用性。
1.通过在 HBS 中稀释来制备感兴趣的 ECM 蛋白（例如，100 μg/mL 的胶原蛋白）的工作溶液。
2.从聚丙烯酰胺培养皿中取出存储缓冲液。
3.在 Milli-Q 水中将 sulfo-SANPAH 库存溶液稀释至 0.5 mg/mL，并直接将移液器移至聚丙烯酰胺凝胶 (~5 mL) 的表面。 Sulfo-SANPAH 在水中迅速水解，因此该步骤需要迅速完成。
4.将培养皿置于紫外线下长达 10 分钟以激活表面。
注意：在将培养皿置于紫外线下之前，请先取下培养皿的盖子。
a.当 Sulfo-SANPAH 与聚丙烯酰胺反应后，它会变成酒红色（深橙色）。
b.激活时间可能会根据紫外线灯波长、功率以及碟子与光源的距离而变化。对于上面列出的灯，距离光源三英寸的距离足以持续 10 分钟。
5.用 HBS 清洗聚丙烯酰胺皿 3 次，以去除多余的磺基 SANPAH。
6.将 ECM 蛋白质溶液直接添加到聚丙烯酰胺顶部，并将培养皿放入细胞培养箱中 37°C 过夜。
a.大约 10 mL 的溶液足以均匀结合。
b.我们发现过夜孵育效果很好，但较短的时间（1-2 小时）可能就足够了。
7.与蛋白质溶液孵育后，用 HBS 洗涤一次并更换为新鲜的 HBS。
8.将凝胶在 37 °C 下浸泡在 HBS 中过夜（或 2-3 小时）。
a.如有必要，重复此步骤，再更换一次新鲜 HBS，以去除多余的未结合的磺基-SANPAH 和/或 ECM 蛋白。
b.凝胶应变成非常浅的透明橙色。
c.倍物镜的光学显微镜下观察胶原蛋白，该显微镜可用于检查任何不均匀性。
9.培养皿可以在 4°C 的 HBS 中保存，并用封口膜或保鲜膜密封数周。

E.细胞培养

注意：此部分应尽可能在采用无菌技术的 BSC 中进行，以尽量减少污染。
1.在接种细胞之前，取出 HBS 并用新鲜细胞培养基在 37°C 下孵育培养皿 1 小时。
2.通过将细胞悬浮液滴在整个表面上来平板细胞，并使其粘附约 1 小时。
3.细胞粘附到表面后，添加 25–30 mL 的培养基。
4.当细胞准备好传代时，除去细胞培养基，向培养皿中添加温热的 HBSS 或无血清培养基，然后在细胞培养箱中静置 15-30 分钟。
注意：这将清洗细胞，为胰蛋白酶消化做准备。
a.如果细胞培养基含有高浓度血清（例如，10% 胎牛血清）或聚丙烯酰胺凝胶较软（< 10 kPa），则可能需要进行多次交换以去除凝胶内多余的蛋白质。
b.必须充分去除血清蛋白以防止胰蛋白酶的抑制。
c.如果细胞培养基中存在苯酚，则聚丙烯酰胺凝胶应从粉红色变为几乎透明，表明细胞已准备好进行胰蛋白酶消化。
5.去除 HBSS 或无血清培养基并继续常规传代。

F.玻璃皿的清洁和重复使用

1.戴上手套，取下 PDMS 环，用温肥皂水清洁，然后在高压灭菌器中消毒。在灭菌之前，可以将 PDMS 环放入装有异丙醇和/或清洁剂溶液的烧杯中，以除去吸收的物质。
2.从培养皿中取出聚丙烯酰胺。可以用戴手套的手或用镊子去除聚丙烯酰胺。
3.将玻璃皿漂白至少 15 分钟，用大量水冲洗，然后用温肥皂水清洁。
4.在高压灭菌器中对餐具进行消毒。培养皿已准备好重复使用（从 B 部分开始：玻璃培养皿表面活化）。

数据分析

使用 Agilent NovoCyte 流式细胞仪对细胞活力和细胞碎片进行三次技术和实验测量。对细胞活力数据进行普通单向方差分析，对细胞碎片数据进行 Brown-Forsythe 和 Welch 方差分析。

食谱

1.过硫酸铵，10% w/v 溶液
以 10% w/v 的浓度溶解在去离子水中。过硫酸铵溶解在水中时会发出裂纹。
等分并在-20°C 下保存最多六个月。

2.磺基-SANPAH，100 mg/mL 溶液
将磺基-SANPAH 以 100 mg/mL 溶解在 DMSO 中。
在微量离心管中分装成 25 μL，并在 -80 °C 下冷冻长达一年。

3.HEPES 缓冲盐水 (HBS)
溶解在 Milli-Q 水中。
将pH 调至 8.0。
使用 0.2 μm PES 瓶顶过滤器的无菌过滤溶液。

致谢

这项工作由美国国立卫生研究院 (R01GM26643、R01HL133163、R01HL145147、U19AI158930) 资助。该协议改编自 Millar-Haskell等人。（2022）。作者要感谢 John Sperduto 和 Bryan Ferrick 在获取材料方面提供的帮助。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

这项工作没有使用动物或人类受试者。

参考

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