材料与试剂

生物材料

1.老鼠。我们描述的实验是用通过培育报告菌株Gt(ROSA)26Sor tm4(ACTB- tdTomato ,-EGFP)Luo /J（以下称为ROSA mT / mG ，杰克逊实验室，菌株号 007676）（ Muzumdar 等，2007 ）与 B6.Cg-Tg (Tyrcre / ERT2)13Bos/J（以下称为 Tyr::CreER T2 ，杰克逊实验室，菌株号 012328）（ Bosenberg ）等人，2006 ）。我们的方案使用从定时妊娠母鼠中分离出的成黑细胞，这些母鼠是ROSA mT / mG纯合子 Tyr::CreER T2的等位基因和纯合子。这些报告小鼠可以进一步培育到其他背景中，其中感兴趣的基因侧翼是loxP位点，因此可以用于生成 GFP 标记的黑素细胞，其中感兴趣的基因在施用他莫昔芬后也被灭活（ Crawford ）等人，2020 ）。非靶细胞可以通过mTomato荧光蛋白的表达来识别。这些实验需要怀孕的小鼠，首先在性交后 11.5 天（ dpc ；阴道塞的中午被认为是 0.5 dpc ）用他莫昔芬治疗，如下程序中所述。
2.ST2 细胞。骨髓基质来源的细胞系（理研生物资源研究中心，目录号：RCB0224）。 ST2 细胞表达胶原蛋白和成纤维细胞生长因子，并支持培养中的黑素细胞（ Abdallah 等人，2019 ）。

试剂

1.他莫昔芬（Millipore Sigma，目录号：T-5648）
2.无水乙醇（Millipore Sigma，目录号：493511）
3.70% 乙醇（Millipore Sigma，目录号：63350-M）
4.牛血清白蛋白组分 V（Wisent，目录号：800-095-EG）
5.Cremophore / Kolliphor EL（Millipore Sigma，目录号：C5135）
6.MGM-4 基础培养基（Lonza，目录号：CC-3250）
7.MGM-4 SingleQuot套件，含补充剂和生长因子（Lonza，目录号：CC-4435）
8.内皮素3，冻干（ET3）（Lonza，目录号：CC-4510）
9.2.5% 胰蛋白酶（Invitrogen，目录号：15090046）
10.胰蛋白酶中和溶液（Life Technologies， Thermo Fisher Scientific，目录号：R-002-100）
11.胎牛血清（FBS）（ Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：26140079）
12.0.25% 胰蛋白酶/EDTA（Invitrogen， Thermo Fisher Scientific，目录号：25200072）
13.7-氨基放线菌素D（7-AAD）（Millipore Sigma，目录号：A9400）
14.多聚甲醛（PFA）（Millipore Sigma，目录号：158127）
15.无菌RPMI培养基（Millipore Sigma，目录号：R8758）
16.氯化钠（Millipore Sigma，目录号：S5150）
17.KCl （Millipore Sigma，目录号：P5405）
18.Na 2 HPO 4 （密理博西格玛，目录号：S7907）
19.KH 2 PO 4 （密理博西格玛，目录号：P5655）
20.NaOH （Millipore Sigma，目录号：S8045）
21.Triton X-100（Millipore Sigma，目录号：X100-100ML）
22.小鼠抗 TRP1 抗体（Abcam，目录号：3312）
23.山羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor ® 594 缀合物（ Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11032）
24.具有 DAPI 的安装介质（同上，目录号：50011）

解决方案

1.他莫昔芬储备液 (50 mg/mL)（参见食谱）
2.黑素细胞培养基（参见食谱）
3.ST2 培养基（参见食谱）
4.无菌 Ca 2+ - 和 Mg 2+ - 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.4（参见配方）
5.FACS 缓冲液：不含 Ca 2+和 Mg 2+的无菌 PBS，含有 2% FBS（参见配方）
6.7-氨基放线菌素 D (7-AAD) 库存溶液（参见配方）
7.7-氨基放线菌素 D (7-AAD) 工作染色液（参见配方）
8.1 N NaOH 溶液（参见配方）
9.4% 多聚甲醛 (PFA)（参见配方）

食谱

1.°C保存）
试剂最终浓度数量
他莫昔芬50毫克/毫升25毫克
无水乙醇50%250微升
Cremophore / Kolliphor50%250微升
全部的不适用500微升

2.黑色素细胞培养基（4°C保存）
试剂最终浓度数量
MGM-4基础培养基不适用500毫升
MGM-4 SingleQuot套件不适用1 套（9 毫升）
ET3255纳克/毫升130微克
全部的不适用509 毫升

3.ST2细胞培养基（4℃保存）
试剂最终浓度数量
RPMI培养基90%450毫升
胎牛血清10%50毫升
全部的不适用500毫升

4.Ca 2+和 Mg 2+的磷酸盐缓冲盐水（PBS，储存于 4 °C）
试剂最终浓度数量
氯化钠137毫米8克
氯化钾2.7毫米0.2克
Na 2 HPO 410毫米1.44克
KH 2 PO 41.8毫米0.24克
全部的不适用至 1,000 毫升
高压灭菌器进行灭菌。

5.FACS 缓冲液（4°C 保存）
试剂最终浓度数量
无菌不含Ca 2+和 Mg 2+的 PBS98%98毫升
胎牛血清2%2毫升
全部的不适用100毫升
保持无菌。

6.7-氨基放线菌素 D (7-AAD) 库存溶液（-20°C 避光保存）
试剂最终浓度数量
7-AAD1毫克/毫升1毫克
甲醇5%50微升
无菌不含Ca 2+和 Mg 2+的 PBS950微升
全部的不适用1毫升

7.7-氨基放线菌素D（7-AAD）工作染色液（新鲜配制）
试剂最终浓度数量
7-AAD 库存溶液1%100微升
流式细胞仪缓冲液99%至 10 毫升
全部的不适用10毫升

8.1 N NaOH 溶液
试剂最终浓度数量
氢氧化钠1N40克
水分子_不适用至 1,000 毫升
全部的不适用1,000 毫升

9.4% 多聚甲醛 (PFA) 溶液
试剂最终浓度数量
粉煤灰4%0.4克
Ca 2+和 Mg 2+的 PBS不适用至 10 毫升
全部的不适用10毫升
使用前准备。

实验室用品

1.细菌级 100 mm 培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875713A）
2.手术剪刀（Fine Science Tools，目录号：14002-12）
3.两套镊子（Fine Science Tools，目录号：11000-12）
4.手术刀（精细科学工具，目录号：10003-12）
5.手术刀刀片（精细科学工具，目录号：10011-00）
6.无菌 15 mL 锥形管（Sarstedt，目录号：62.554.502）
7.无菌 50 mL 锥形管（Sarstedt，目录号：62.547.205）
8.2 mL 微量离心管（VWR，目录号：20170-098）
9.无菌 10 mL 一次性塑料注射器（BD Biosciences，目录号：302995）
10.用于注射器的无菌 21 G 针头（BD Biosciences，目录号：305165）
11.无菌 5 mL 圆底卡口管（BD Falcon，目录号：52054 ）
12.无菌 40 μm尼龙细胞滤网（Fisher Scientific，目录号：08-771-1）
13.Neubauer 血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：15170-173）
14.BioLite T25 烧瓶，经过细胞培养处理（ ThermoFisher Scientific，目录号：130189）
15.带有 4 孔插入件的 35 mm μ 培养皿（ ibidi ，目录号：80466）
16.移液器辅助装置（ Thermo Fisher Scientific，S1 移液器填充器，目录号：9521）
17.微量移液器（Eppendorf Research plus、P20、P200、P2000）
18.12 mm 玻璃盖玻片（Mandel Scientific，目录号：NEU-GG-12）

设备

1.体视显微镜（徕卡体视变焦 GZ6E）
2.2 37 °C 室的相差和荧光倒置显微镜，用于延时视频显微镜（Leica DMIRBE 或同等产品）
3.Becton Dickinson FACSAria III 细胞分选仪（BD Biosciences）
4.Becton Dickinson FACSCanto流式细胞仪（BD Biosciences）
5.离心机（Eppendorf 5810R）
6.生物安全柜（ Microzone BK-2-4）
7.CO 2细胞培养箱（VWR，目录号：10710-944）
8.水浴（ PolyScience ，目录号：WBE05A11B）
9.摇摆平台（Bio-Rad，目录号：166709 或同等产品）

软件

1.FACSDiva软件（v. 8.0.1）或同等软件
2.Volocity软件 (PerkinElmer) 或同等软件

程序

A.他莫昔芬储备液的制备

1.称取 25 毫克他莫昔芬，将其放入微量离心管中。注意：使用防护手套并在通风橱中处理他莫昔芬，以避免吸入。
2.添加 250 μL无水乙醇。
3.涡旋并在 55 ℃ 下孵育该悬浮液 °C剧烈摇动 5 – 10 分钟，确保完全溶解。
4.注意：使用防护手套，使用 1 mL 无菌血清移液器添加 250 μL Cremophor，因为 Cremophor 非常粘稠。
5.涡旋混合。
6.μL的一次性等分试样储存在 -20 °C下。

B.T2重组酶的体内激活

1.使用前，将 100 μL等份他莫昔芬储备液 (50 mg/mL) 在 37 °C 下孵育 1 – 2 分钟快速解冻。注意：处理他莫昔芬溶液时请使用防护手套。
2.按照机构生物安全规定，将 400 μL无菌 Ca 2+ - 和 Mg 2+ - PBS 添加到 100 μL他莫昔芬储备溶液 (50 mg/mL)，以产生 10 mg/mL 他莫昔芬的最终浓度（即， 1 毫克/100微升）。涡旋混匀，避光，及时使用，以免溶液中他莫昔芬沉淀。
注意：给予每只小鼠的稀释他莫昔芬的最终体积取决于其体重，约为 100 μL （步骤 B3 和 B4）。
3.用他莫昔芬治疗的怀孕 11.5 dpc小鼠的重量。
4.用一只手短暂地抑制有意识的小鼠（ Machholz 等人，2012 ），以 1 mg/25 g 体重的剂量腹膜内（IP）施用 PBS 稀释的他莫昔芬溶液。
注意：在含有 Cremophor EL 的溶液中施用他莫昔芬可降低药代动力学参数的变异性，包括血浆浓度和半衰期（ Chevalier 等人，201 3 ）。需要单次 IP 注入。
5.将小鼠放回笼子，允许正常的饲养条件四天。

C.ST2 基质细胞的培养

ST2细胞维持在ST2培养基中。下面描述了处理来自 T25 组织培养瓶的细胞培养物的程序。所有步骤均在层流生物安全柜中无菌进行。
1.一旦 ST2 培养物达到 80% 汇合，通过抽吸除去生长培养基。
2.轻轻添加 5 mL 温热（37 °C）无菌 Ca 2+ - 和 Mg 2+ - PBS，冲洗细胞单层并通过抽吸去除。
3.胰蛋白酶消化细胞，添加 1 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液，并将细胞放入细胞培养箱中。
4.每 2-4 分钟通过相差显微镜检查细胞脱离的程度。
5.一旦约 90% 的细胞分离，添加 7 mL 温热（37°C）生长培养基以使胰蛋白酶失活，并轻轻混合细胞悬浮液以生成单细胞悬浮液。
6.将 1 mL 的细胞悬浮液转移到含有 5 mL 温（37°C）生长培养基的新 T25 细胞培养瓶中。轻轻混合并将细胞放入培养箱中。
7.为了保持指数细胞增殖，每三天吸出生长培养基并更换为 5 mL 新鲜生长培养基。不要让培养物达到 80% 以上的汇合度。

D.黑素细胞培养的ST2 饲养细胞单层的制备

1.–C 5中所述，对 T25 烧瓶中培养的 ST2 细胞进行胰蛋白酶消化。
2.将细胞悬浮液转移至 15 mL 锥形管中。
3.将细胞在 22°C 下以 200 × g离心 5 分钟。吸出上清液，轻轻地将细胞沉淀重新悬浮在 1 mL 温热（37°C）RPMI 生长培养基中。
4.使用血细胞计数器确定细胞密度，并通过添加适当体积的温热 RPMI 生长培养基调整至 70,000 个细胞/mL。
5.将 100 μL细胞悬浮液添加到置于35 mm μ 培养皿中的 4 孔插入物的每个孔中（7,000 个 ST2 细胞/孔）并培养过夜。
注意：使用带有光学级塑料的 μ 皿可实现高质量成像和最佳细胞附着和扩散。
6.电镀后第二天，在分离和纯化目标黑素细胞之前（见下文），通过抽吸除去 ST2 生长培养基。
7.将 100 μL温热（37° C）新鲜培养基添加到每个孔中，该培养基由黑素细胞生长培养基和 ST2 RPMI 生长培养基的 1:1 混合物组成。
8.将 ST2 饲养细胞放回培养箱中。

E.目标胚胎黑素细胞的分离

1.按照适当的机构批准的动物护理伦理程序，通过 CO 2吸入或异氟烷过量，在 15.5 dpc处安乐死怀孕的母鼠。
2.将动物仰卧在吸水垫上，用 70% 乙醇浸泡胸部和腹部。
3.使用一把镊子，轻轻向外捏住腹部中心下方的腹部皮肤，并使用手术剪刀，在中线切开一个小切口，确保不会切穿腹腔。
4.沿腹中线切开皮肤，轻轻将皮肤拉向两侧，使其与下面的腹腔分离，从而暴露子宫（图1）。
5.使用镊子轻轻地将含有胚胎串的子宫从体腔中取出。将子宫转移到含有无菌 PBS 的培养皿中，保持在室温（22°C）。通过沿着子宫角在植入部位之间仔细切割来分离胚胎（图1）。
6.胚胎分离在立体显微镜下进行。为此，将单个胚胎和相关子宫组织转移到另一个含有 PBS 的培养皿中。将胚胎维持在 PBS 中，使用一对镊子从胚胎上剥离肌肉子宫层，然后去除蜕膜和外胎盘锥。
7.用一把镊子轻轻撕开卵黄囊，并通过轻轻撕扯脐带将其与胚胎完全分离。
8.将胚胎转移到含有 PBS 的无菌组织培养皿中并置于冰上。在此阶段，如有必要，可以去除胚胎尾部的一小部分并进行处理，以进行基因组 DNA 提取和基因分型（图 1）。

图 1. 分离单个 E15.5 小鼠胚胎的程序示意图

9.将胚胎转移到放置在立体显微镜舞台上的含有无菌 PBS 的培养皿中。
10.用镊子将胚胎保持在俯卧位置，用手术刀沿着中线轻轻地在头部下方进行浅表纵向背侧切口并穿过整个尸体，避免深切口，从而导致器官暴露。
11.使用一把镊子，从最靠近颈部的切口点开始，轻轻地逐渐将皮肤与尸体分离。
注意：胚胎皮肤非常脆弱。使用一组镊子通过头部固定胚胎，另一组轻轻地将皮肤与尸体分开。
12.将每个收获的皮肤漂浮在含有冰冷无菌 PBS 的无菌培养皿中。继续收获所有剩余胚胎的皮肤。
13.用镊子小心地将胚胎皮肤转移到每块皮肤含有 500 μL无菌 2.5% 胰蛋白酶的无菌锥形管中。
注意：如果需要对单个胚胎进行分析，则可以在含有 500 μL 2.5% 胰蛋白酶的单独 2 mL 微量离心管中消化每个皮肤，然后切碎。
14.使用小剪刀将皮肤切碎成约 2 mm × 2 mm 的碎片，并在 37°C 下轻轻摇动孵育 10 分钟。
15.添加 1 m L 胰蛋白酶中和溶液，并轻轻混合。
16.将细胞悬浮液通过无菌 40 μm孔径细胞滤网过滤到 15 mL 无菌锥形管中，以去除组织碎片。
17.为了获得单细胞悬浮液，将过滤后的细胞混合物轻轻地通过装有 21 G 针头的 5 或 10 mL 注射器 10 次。
18.以 140 × g离心5 分钟。
19.小心地吸出上清液，避免扰乱细胞沉淀。
20.将胚胎细胞重悬于 300 – 500 μL冰冷的 FACS 分选缓冲液中。
注意：将细胞悬液重悬于较大体积的 FACS 分选缓冲液中将导致流速降低和分选时间增加，从而导致细胞活力下降。
21.将细胞悬浮液转移至 5 mL BD Falcon 玻璃管中并置于冰上。
22.立即对成黑细胞进行细胞染色和 FACS 纯化。

F.靶向 GFP 阳性黑素细胞的 FACS 纯化和培养

1.在对黑色素细胞进行荧光激活分选之前约 15 分钟，将 7-AAD 原液添加到黑色素细胞悬浮液中（每 450 μL细胞悬浮液加入 5 μL 7-AAD 原液），以获得 10 μg /mL的终浓度，并轻轻混合。
注意：7-AAD 会对凋亡细胞和坏死细胞进行染色，从而将其与待培养的存活黑素细胞分离。
2.黑素细胞的 FACS 纯化，在 4°C 下设置分选，在低压 (20 psi) 下使用 100 μm喷嘴，最大事件率为 2,000 个事件/秒。
注意：增加事件发生率会降低 GFP 阳性细胞的回收率。
3.配置蓝色激光三角以检测来自检测器 B（530/30 带通和 502 长通滤波器）的 GFP。黄绿色激光八边形配置为从检测器 C（610/20 带通和 600 长通滤波器）检测mTomato 。 7-AAD 由检测器 B（670/14 带通和 630 长通滤光片）检测到。
4.使用侧向散射 (SSC) 高度与 SSC 宽度图和前向散射 (FSC) 高度与 FSC 宽度图上的连续门排除细胞双峰（图 2A 和 2B）。
5.FSC 和 SSC 检测器设置为线性刻度，而荧光通道设置为对数刻度。在每个检测器上使用适当的电压来生成分布广泛的细胞群，但确保所有事件在 GFP 荧光通道的 FSC 与 SSC 图中保持可见，如图 2 所示。

从胚胎皮肤细胞的单细胞悬浮液中纯化目标黑素细胞的FACS 门控策略。 (A, B) 使用侧向散射 (SSC) 高度与 SSC 宽度图和前向散射 (FSC) 高度与 FSC 宽度图上的连续门排除细胞双峰。 (C) 选择 7-AAD 染色低的细胞以排除非存活细胞。 (D) 选择 GFP 表达门控的细胞作为后续培养的目标黑素细胞。

6.根据 7-AAD 的排除选择活细胞（图 2C）。
7.运行 GFP 阴性对照样品并为 GFP 阳性和阴性区域设置门。
8.mTomato与 GFP的图上，如图 2D 所示。这些是已被靶向的活的 GFP 阳性黑素细胞。
9.将细胞分选到含有冰冷的黑素细胞培养基的无菌管中。
10.在分选机中运行一小部分分选的细胞悬浮液，以验证 > 95% 的纯化细胞为 GFP 阳性。
11.盖子密封含有剩余的分类黑素细胞的管，并将其运输到层流罩中以进行后续播种。
12.将分选的 GFP 阳性黑色素细胞播种到 35 mm μ 培养皿的插入孔中，该培养皿含有先前制备的 ST2 饲养细胞汇合单层（ D部分）并在 37°C 下培养。
注意：每个胚胎获得的GFP 阳性黑色素细胞的平均数量约为 500 个（范围从 50 到 1,400 个）。从 4-8 个胚胎中获得的成黑细胞可以汇集到一个孔中。
13.分选十六小时后，用移液器轻轻吸出生长培养基，以避免干扰细胞单层，并更换为新鲜的生长培养基。
注意：播种后 16 小时，大约 70% 的黑素细胞将完全扩散并开始表现出树突状（图 3）。

图 3. 表达 GFP 的黑素细胞。从他莫昔芬处理的报告小鼠（15.5 dpc ）中分离出靶向的表达 GFP 的黑素细胞，并将 FACS 分选的细胞接种在 ST2 细胞饲养层上并培养 16 小时。 GFP 荧光和 GFP/相差叠加显微照片显示 GFP 阳性黑素细胞。注意表达 GFP 的黑素细胞周围和下方的 ST2 细胞汇合单层，在相差显微照片中可见。比例尺，25 μm 。

14.每 72 小时更换一次生长介质。
注意：使用移液器轻轻去除生长培养基，以避免干扰细胞单层。分离后大约一周内，黑素细胞将成熟为产生黑色素的细胞并变成高度树突状细胞。

G.黑素细胞谱系特性的基本特征

T2重组酶在Tyr启动子调控下的黑素细胞谱系细胞限制性表达及其他莫昔芬依赖性激活诱导荧光报告蛋白（例如 GFP、 tdTomato ）的黑素细胞特异性表达已在多个独立研究中得到记录。报告（博森伯格等人，2006 年；克劳福德等，2017 2020年；太阳等人，2023 ）。此外，培养的成黑细胞可以通过其发育高度动态树突延伸的特征能力进行形态学鉴定（图3）。尽管E15.5成黑细胞是无黑素细胞，但它们表达特异性转录因子MITF-M （ Thomas和Erickson，2008 ），可以通过免疫荧光显微镜检测到。此外，分离后4-5天，培养的黑素细胞将成熟为具有树突状突起的黑素细胞，其中含有分布在整个细胞体内的黑色素颗粒（图4）。在此阶段，细胞还表达参与黑色素生物合成的酶，例如酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白 1 (TRP1；图 4)。下面描述了通过间接免疫荧光显微镜处理这些培养物以进行 TRP1 检测的方案。

图 4. 纯化的成黑细胞中 GFP 和酪氨酸酶相关蛋白 1 (TRP1) 的表达。从他莫昔芬处理的报告小鼠（15.5 dpc ）中分离出靶向的、表达 GFP 的黑素细胞，进行分离、FACS 分选，并接种在 ST2 细胞饲养层上。将细胞培养 7 天并进行免疫荧光显微镜检查。显示了两种不同的成黑细胞。明场显微图板（标记为“黑色素”）说明了树突状细胞形态和分布在整个细胞中的深色黑色素颗粒的存在。比例尺，25 μm 。

1.培养 3-7天的黑素细胞的培养皿置于冰上，并用镊子取出插入物，注意避免干扰细胞单层。
2.通过抽吸除去培养基。
3.如果使用，请将插入物从培养皿中取出。
4.轻轻添加 1 mL 冰冷的 PBS 冲洗细胞并通过抽吸去除。
5.通过添加 1 mL 新鲜制备的 4% PFA 的 PBS 溶液来固定细胞，并在室温 (22 °C) 下轻轻摇动孵育 20 分钟。
6.通过抽吸去除 PFA 溶液。
7.添加 1 mL PBS 冲洗一次，如步骤G4 所示。
注意：固定细胞可以立即处理或在 4 °C 的 PBS 中保存长达一周。
8.通过在 PBS 中添加 1 mL 0.1% Triton X-100 来透化细胞，并在室温下轻轻摇动孵育 10 分钟。
9.如步骤 G4 所示，用 PBS 冲洗三次。
10.将 40 μL山羊血清与 756 μL PBS 混合，并添加 4 μL初级抗 TRP1 抗体。搅拌均匀。
注意：一抗也可以用含有 3% 牛血清白蛋白代替山羊血清的 PBS 稀释。
11.将步骤 G10 中的抗 TRP1 抗体溶液添加到细胞中，并在 4°C 下孵育过夜。
12.通过抽吸去除抗 TRP1 抗体溶液。
13.在室温 (22°C) 下与 2 mL PBS 一起孵育 10 分钟，轻轻摇动，清洗细胞。通过抽吸去除 PBS。
14.另外重复步骤 G13 两次。
15.将 40 μL山羊血清与 756 μL PBS 混合，并添加 1 – 2 μL二级抗小鼠 IgG Alexa Fluor ® 第594章共轭。从这一步开始，保护样品避光。
16.将二抗溶液添加到细胞中，并在室温（22°C）下孵育 1 小时，轻轻摇动并避光。
注意：二抗也可以用含有 3% 牛血清白蛋白代替山羊血清的 PBS 稀释。
17.用 2 mL PBS 在室温下孵育 10 分钟，轻轻摇动，清洗细胞。通过抽吸去除 PBS。
18.另外重复步骤 G17 两次。
19.从最后一次洗涤中吸出 PBS 后，立即轻轻地将 50 μL封固剂添加到培养皿的中心。
20.轻轻地将 12 mm 玻璃盖玻片放在安装介质上，确保没有气泡。
21.将样品平放并在室温 (22 °C) 下避光保存过夜。
22.样品已准备好进行荧光成像。
23.处理后的样品随后应避光保存在 4°C 下。

协议验证

该协议已在以下方面得到验证： J. 投资。德玛托。（2020）， DOI：10.1016/j.jid.2019.07.681

致谢

我们感谢 K. Chadwick 在 FACS 实验方面提供的专家帮助。作者感谢自然科学与工程研究委员会和加拿大健康研究所对 LD 的这项工作的财政支持。关于按照该方案分离和培养的成黑细胞的研究已发表在《克劳福德》上等人。（ 2020 ）。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益或利益冲突。

道德考虑

所有动物实验均根据加拿大动物护理委员会的规定和指南，经西安大略大学动物护理委员会批准（协议号2018-169）

参考

Abdallah, BM、Alzahrani, AM、Abdel-Moneim, AM、Ditzel, N. 和 Kassem, M. (2019)。一种简单可靠的长期培养小鼠骨髓基质（间充质）干细胞的方案，可在长期培养中保留其体外和体内干细胞性。生物。进行。在线21(1)：e1186/s12575-019-0091-3。
Adameyko, I.、Lallemend, F.、Aquino, JB、Pereira, JA、Topilko, P.、Müller, T.、Fritz, N.、Beljajeva, A.、Mochii, M.、Liste, I. 等。（2009）。来自神经支配的雪旺细胞前体是皮肤黑素细胞的细胞起源。单元格139(2)：366-379。
Bosenberg, M.、Muthusamy, V.、Curley, DP、Wang, Z.、Hobbs, C.、Nelson, B.、Nogueira, C.、Horner, JW、DePinho, R.、Chin, L. 等。（2006）。黑素细胞特异性诱导型 Cre 重组酶转基因小鼠的表征。创世记44(5)：262–267。
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