材料与试剂

1.15 mL 离心管（Greiner，目录号： 188271）
2.1.5 mL微量离心管（Greiner Bio-One，目录号： 616201）
3.巴斯德移液器（转移）（Labtek，目录号： 650.050.523）
4.直接检测免分析卡（Merck，目录号： DDAC00010-GR）
5.一次性硅化搅拌棒，适用于 P/N 312 比色皿（DKSH，部件号 311）
6.比色皿，450 µL（DKSH，部件号 312）
7.100 kDa Amicon Ultra-15 离心过滤装置（Merck，目录号： UFC910024）
8.Econo-Column ®色谱柱，1.5 cm × 10 cm（Bio-Rad，目录号： 7374151）
9.新鲜或冷冻血浆（储存在-80 ° C）收集在ACD（BD，目录号：366645），柠檬酸三钠（BD，目录号：363095）或EDTA（BD，目录号：367839）中，或收集在来自患者的凝块激活剂/凝胶真空采血管（BD，目录号：367954），用于 IgG 纯化
10.收集在柠檬酸三钠中的新鲜或冷冻血浆（储存在-80 ° C）或收集在凝块激活剂/凝胶真空采血管中的患者血清，用于直接测试血小板聚集
11.来自健康捐献者的全血，收集在柠檬酸三钠真空采血管中（BD，目录号：363095）
12.蛋白 G 琼脂糖珠（SeraCare ，目录号： 5720-0002）
13.杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号： D8537）
14.对照激动剂，例如胶原蛋白 (1 μg/mL)、凝血酶 (1 U/mL)、HIT 阳性患者的血浆样本
15.磷酸钠（Merck，目录号：S8282）
16.甘氨酸（Astral Scientific，目录号：BIOGB0235）
17.Tris（Amresco，目录号：0497）
18.HCl （默克，目录号：320331）
19.NaOH（Sigma，目录号：S-0899）
20.氯化钠（默克，目录号：S9625）
21.EDTA（Invitrogen，目录号：15576028）
22.起始缓冲液，pH 7.0（参见配方）
23.洗脱缓冲液，pH 2.7（参见配方）
24.中和缓冲液，pH 9.0（参见配方）
25.洗涤缓冲液，pH 7.0（参见配方）

设备

1.台式离心机（Spintron，型号： GT-10 SV3）
2.台式微量离心机（Beckman Coulter，Microfuge 20 离心机，型号： B31603）
3.离心机（Eppendorf，型号： 5810 R）
4.聚合计（Chrono-Log，型号：700）
5.色谱系统（GE Healthcare，型号：AKTA Pure。目录号：29-0182-24）
6.直接检测红外光谱仪（Millipore，型号：DDHW00010）
7.旋转管混合器（Ratek，型号：RSM7DC）
8.磁力搅拌器（Bacto Laboratories，型号：MS7-H550-Pro）
9.校准移液器
10.-80 ℃冷冻室
11.4 ℃冰箱

软件

1.Aggro/Link8 软件（Chronolog，美国）
2.GraphPad Prism 9（GraphPad 软件，美国）
3.Microsoft Excel（微软，美国）

程序

A.富血小板血浆（PRP）的制备

1.将人全血吸入装有柠檬酸三钠的真空管中。
注：PRP 约为全血容量的30% – 40%。所需全血的最小体积取决于要进行的测定数量[每次测定需要300 μL PRP ，加上500 μL 来制备贫血小板血浆 (PPP)作为背景]。
2.在室温下以 200 × g无制动离心管10 分钟。
3.使用 3 mL 巴斯德移液器将 PRP 层转移到 15 mL 离心管中。
4.将加盖的 PRP 样品保存在室温下直至准备使用，保存时间不超过 3 小时。
℃保存血小板会被激活，影响后续血小板功能测定。

B.贫血小板血浆的制备

1.转移至 1.5 mL 微量离心管中。
2.室温下以 1,000 × g离心管 10 分钟。
3.上清液转移至另一个 1.5 mL 微量离心管中，并在管上贴上 PPP 标签。

C.从血清或血浆中制备患者抗体

1.将患者血清或血浆在 4 °C 下以 10,000 × g离心 10 分钟，以去除任何细胞或碎片。可以使用在 ACD、EDTA 或柠檬酸钠中收集的新鲜或冷冻患者血清或血浆。
2.将至少 0.5 mL 上清液转移至干净的微量离心管中。
3.将 Protein G 琼脂糖珠以 1:1 的比例添加到患者血清或血浆中；然后，将混合物转移至干净的1.5 cm × 10 cm Econo-Column ®色谱柱中。
4.将柱在旋转管混合器上于 4°C 孵育 2 小时。
5.将色谱柱放入 AKTA 净化器色谱系统中。
6.使用至少 10倍样品体积的清洗缓冲液清洗柱。检查色谱图是否保持在基线，以确认色谱柱已被充分清洗。
7.将 100 μL 中和缓冲液添加到 1.5 mL 微量离心收集管中，并将其置于冰上。
8.将 1 ×样品体积的洗脱缓冲液添加到柱中以洗脱结合的免疫球蛋白。将含有 900 μL 等份的蛋白质峰的级分收集到含有 100 μL 中和缓冲液的 1.5 mL 微量离心管中。翻转管子以混合。
9.合并洗脱的抗体并转移至 100 kDa Amicon Ultra-15 离心过滤装置。
10.将 Amicon Ultra-15 装置以 4,000 × g离心 15 – 20 分钟。添加 14 mL PBS 并重复离心步骤两次，以显着降低原始缓冲液的浓度。一旦缓冲液更换为 PBS 完成，将混合物和等分试样转移到 2 mL Eppendorf 管中。
11.将 2 μL 样品移至样品膜中，将 2 μL 缓冲液移至直接检测免测定卡上的另一张膜上。
12.将卡放入直接检测红外光谱仪中干燥并测量样品浓度，以缓冲液作为空白。预期样品浓度约为 7 – 10 mg/mL。
注意：其他方法（例如 Bradford 测定）可用于确定抗体浓度。可以使用酶联免疫吸附测定 (ELISA) 等测定法来测试纯化 IgG 的质量，以确认纯化 IgG 与抗原的结合。纯度可以通过 SDS PAGE 凝胶来确认。多聚体 IgG 的存在可以使用尺寸排阻色谱法进行分析。
13.将抗体保存在 -80 ° C 冰箱中长期保存直至需要，或在 4 ° C 下保存以供第二天使用。

D.通过血小板聚集测量抗体活性

1.将 300 μL PPP 转移到比色皿中。将比色皿放入聚合计的参考槽中（100% 透光率，用作空白）（图 2）。

图 2. 聚合计设置。 A. 带搅拌棒的比色皿图像。 B. 贫血小板血浆 (PPP) 参考槽、富血小板血浆 (PRP) 加热槽和测量槽的位置。 C. 用于同时运行四个样品的聚合计设置。

2.将温度设置为 37 °C，搅拌速度设置为 1,200 转/分钟 (rpm)，并在聚合计上选择光学模式。
3.对于要测试的每种激动剂，将 300 μL PRP 转移到每个含有搅拌棒的比色皿中。
4.将 PRP 比色皿放入加热槽中 2 分钟，升温至 37°C；然后，将比色皿放入测量槽中，并确保搅拌棒搅拌均匀。
5.在聚合计上设置基线。
6.将待评估试剂移入含有 300 μL PRP 的比色皿中。试剂包括患者血清 (5 – 50 µL)、纯化的患者 IgG (0.1 – 2 mg/mL)、阴性对照（来自健康供体或缓冲液的等量血清或纯化 IgG）或阳性对照 (0.5 – 1 U / mL 凝血酶、1 μg/mL 胶原蛋白或 50 μL 弱阳性 HIT 患者血清（含 0.1 U/mL 肝素），以检测弱致病性抗体。
注意：激动剂或对照体积不应超过 150 μL。
7.选择Aggregometer 、运行新患者，或单击Aggro/Link 软件上的运行新图标。
8.采集数据 15 – 30 分钟（或直到血小板聚集完成）。

E.导出和分析数据

1.从 Aggro/Link 软件以del文件格式导出图像和原始数据。
2.在 Excel 中打开原始数据文件。
3.将数据点重新绘制到 GraphPad Prism 中。
4.从 Aggro/Link 软件获取 AUC、最大聚合百分比、速度和延迟时间。

数据分析

可以从血小板聚集度数据推断出各种参数。最重要的参数是血小板聚集曲线的幅度（指示最大聚集的百分比）和潜伏时间（指示聚集开始的时间）。还可以通过计算每单位时间的聚合百分比来分析聚合速度（图 3）。曲线下面积 (AUC) 和最大聚集 (%) 直接由 Aggro-Link 软件计算。这些也可以在导出原始数据并使用其他程序（例如 Excel 或 Prism）重新绘制后重新计算。可以通过选择特定的聚合百分比来在样本之间进行比较来推断速度和延迟时间。不建议比较不同日期和捐赠者的数据。该测定是半定量的。

图3 .血小板聚集数据分析。聚集计迹线指示用纯化的肝素诱导的血小板减少症(HIT) 患者抗体治疗后的聚集速度和最大聚集百分比（以绿色显示）。用阴性对照处理后未观察到聚集（缓冲液以蓝色显示；正常 IgG 以黑色和红色显示）。

为了确保健康捐赠者的血小板功能正常，至少需要一种阳性对照。对于HIT和VITT等疾病中血小板激活抗体的检测，需要弱阳性患者血清或IgG作为阳性对照。使用弱对照 HIT/VITT 抗体时应获得阳性结果，以确保供体血小板的反应性足以检测弱抗体。如果供体血小板对已知的弱对照 HIT/VITT 抗体显示阴性结果，则所使用的供体血小板不太可能检测到弱抗体，从而导致假阴性结果。另一方面，如果弱阳性对照给出阳性结果，则供体血小板甚至适合检测较弱的致病性抗体。
由于只有一部分健康个体对 HIT 抗体有反应，因此定期进行 HIT 抗体检测的实验室应该有几名具有 HIT 抗体反应性血小板的捐赠者来呼吁捐赠。这些反应性捐献者是通过事先测试从更大的捐献者群体中筛选出来的。或者，可以在测定中一起使用两到四个未知血小板反应性的随机供体，因为至少一个供体将具有反应性血小板。
与其他血小板功能测定一样，血小板捐献者不得服用药物（例如阿司匹林）或食物（例如大蒜），因为这些药物/食物可能会抑制血小板反应性。为了检测这一点，使用生理激动剂（通常为 1 μg /mL 胶原蛋白）作为额外的阳性对照（更多详细信息，请参阅下面的注释）。应谨慎解释异常形状的曲线并重复测定，以确保样品（合适的供体，在采血后 3 小时内进行测定）和/或试剂（正确的 pH 值和浓度）已准备好并正常运行。

笔记

健康的血小板捐献者在实验前 10 天内不应服用任何已知会影响血小板功能的药物。这些药物可能包括环氧合酶 (COX)-1 和 COX-2 抑制剂、非甾体抗炎药 (NSAID)、布洛芬、血小板受体抑制剂 [阿昔单抗 (αIIbβ3)、氯吡格雷 (P2Y12)、普拉格雷 (P2Y12)] 和抗凝剂。聚集时间和聚集程度可能因供体血小板浓度而异；因此，阳性对照至关重要。血小板聚集测定应在采血后3小时内进行。所需的患者血清或 IgG 的量因患者而异，具体取决于抗体滴度、亲和力、采集时间等。为了研究各种血小板膜受体和/或信号通路对血小板聚集的贡献，使用了一系列生理激动剂，例如花生四烯酸（血栓烷 A2）、二磷酸腺苷 (ADP)（P2Y1 和 P2Y12）、胶原蛋白（GPVI 和 α 2 β ） 1)、可以使用肾上腺素( α2A )或凝血酶受体激活肽(TRAP)-6[蛋白酶激活受体(PAR)-1]。
本方案中描述的血小板聚集测定用于检测 HIT 和 VITT 抗体以及评估一般血小板功能，例如怀疑患有血小板功能障碍的患者。当该测定用于前一目的时，需要特定的对照和血小板供体要求，如方案中所述。建议血小板计数为 250,000/ L。血小板计数低于 50,000/ L 可能会导致结果不一致，并导致基线设置出现问题。
使某些供体血小板对 HIT/VITT 抗体更具反应性的因素尚不清楚。与具有 H131 多态性的异构体相比，关于反应性是否与 Fc γ IIa R131 同工型相关的数据存在矛盾。 Fc 受体数量和血小板反应之间没有发现显着相关性。其他激动剂（ADP、胶原蛋白）诱导的血小板聚集受到年龄、体重指数、甘油三酯水平以及某些食物和药物等因素的影响。这些与未知因素一起也可能影响 HIT/VITT 抗体的反应性。

食谱

1.起始缓冲液，pH 7.0
20 mM 磷酸钠
a.在合适的容器中准备 800 mL 蒸馏水。
b.添加3.28克磷酸钠并搅拌。
c.使用 HCl 或 NaOH 将溶液调节至最终所需的 pH 值。
d.添加蒸馏水直至体积为 1 L。
室温保存。稳定一年以上。

2.洗脱缓冲液，pH 2.7
100 mM 甘氨酸
a.在合适的容器中准备 800 mL 蒸馏水。
b.将 7.5 克甘氨酸添加到溶液中并搅拌。
c.用 HCl 将 pH 调节至 2.7。
d.添加蒸馏水直至体积为 1 L。
4 ℃保存。稳定一年。

3.中和缓冲液，pH 9.0
1 M Tris ·HCl
a.在合适的容器中准备 800 mL 蒸馏水。
b.将 121.14 g Tris 碱添加到溶液中。
c.使用 HCl 将溶液调节至所需的 pH 值。
d.添加蒸馏水直至体积为 1 L。
室温或 4 C 下保存。可稳定保存六个月。

4.洗涤缓冲液，pH 7.0
20 mM 磷酸钠
150 毫米氯化钠
2 毫米乙二胺四乙酸
a.在合适的容器中准备 800 mL 蒸馏水。
b.添加3.28克磷酸钠和8.76克氯化钠并搅拌。
c.添加 4 μL 0.5M EDTA。
d.使用 HCl 或 NaOH 将溶液调节至最终所需的 pH 值。
e.添加蒸馏水直至体积为 1 L。
室温保存。稳定一年以上。

将盐溶解在ddH 2 O中并用磁力搅拌器搅拌。添加 HCl 或 NaOH 将溶液调节至所需 pH。所有给出的配方均适用于 1 L 溶液。可根据需要制备不同的体积。

致谢

这项工作得到了澳大利亚国家健康和医学研究理事会、计划拨款 APP1052616 和新南威尔士州能力计划高级研究员拨款 RG201677 向 BHC 的资助的支持。该协议改编自我们小组之前的出版物（Leung 等人，2022））。

利益争夺

本手稿的作者声明不存在利益冲突或利益竞争。

伦理

该协议得到了悉尼东南部人类研究伦理委员会的批准（17/211 LNR/17/POWH/501）。所有研究参与者均获得知情同意。

参考

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