材料与试剂

生物材料

1.小鼠肝脏或感兴趣的细胞系

抗体

1.小鼠单克隆抗 PDI (C-2)（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-74551)
2.兔单克隆抗 Tom20 (D8T4N)（Cell Signaling Technology，目录号：42406）
3.小鼠单克隆抗VDAC1（B-6）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：390996）
4.小鼠单克隆抗 Tim23 (H-8)（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-514463）
5.兔单克隆抗 FACL4 (EPR8640) (Abcam, 目录号：ab155282）
6.小鼠单克隆抗Na + /K + ATP酶α3亚基（Sigma-Aldrich，目录号：05-369-25UG）

试剂

与细胞分离
1.HEPES（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：54461）
2.D-蔗糖（ Thermo Fisher Scientific，Fisher 生物试剂，目录号：BP220-1）
3.EGTA（Merck， Calbiochem ，目录号：324626）
4.KCl （霍尼韦尔， Fluka分析，目录号：31248）

从小鼠肝脏中分离
1.D-甘露醇（Merck， Calbiochem ，目录号： 443907)
2.D-蔗糖（ Thermo Fisher Scientific，Fisher 生物试剂，目录号：BP220-1）
3.牛血清白蛋白（BSA）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
4.EGTA（Merck， Calbiochem ，目录号：324626）
5.用于缓冲溶液的 Tris 盐酸盐（Tris-HCl）（ PanReac AppliChem，目录号：A1087）

10 × PBS
1.氯化钠（ Thermo Fisher Scientific，目录号：11916388）
2.Na 2 HPO 4 ·2H 2 O（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15613040）
3.KH 2 PO 4 （Merck，目录号： 104873 ）
4.KCl （霍尼韦尔， Fluka分析，目录号：31248）

解决方案

1.微粒体分离缓冲液细胞 (MIB-C)（参见配方）
2.微粒体分离稳定性缓冲液 (MIB-S)（参见配方）
3.5 × s缓冲液 (SB)（参见配方）
4.肝微粒体分离缓冲液 (MIB-L)（参见食谱）
5.10 × PBS（参见食谱）

食谱

1.微粒体分离缓冲液肝 (MIB-L)
试剂最终浓度数量
D-甘露醇225毫米0.41克
D-蔗糖75毫米0.26克
EGTA（100 mM；pH 8）0.5毫米0.05毫升
Tris-HCl（1 M，pH 6.5）30毫米0.3毫升
牛血清白蛋白0.5%0.05克
MQH2O _ _不适用高达 10 毫升
全部的不适用10毫升

2.微粒体分离缓冲液细胞 (MIB-C)
试剂最终浓度数量
Tris-HCl（1 M，pH 6.5）30毫米450微升
D-甘露醇225毫米0.61克
D-蔗糖75毫米0.38克
MQH2O _ _不适用高达 15 毫升
全部的不适用15毫升

3.微粒体分离稳定缓冲液 (MIB-S)
试剂最终浓度数量
D-蔗糖0.25M1.2克
氯化钾25毫米0.028克
赫佩斯 (1 M)10毫米150微升
EGTA（100 mM；pH 8）1毫米150微升
MQH2O _ _不适用高达 15 毫升
全部的不适用15毫升

4.5×膨胀缓冲液(SB)
试剂最终浓度数量
氯化钾125毫米0.14克
赫佩斯 (1 M)50毫米750微升
EGTA（100 mM；pH 8）5毫米150微升
MQH2O _ _不适用高达 15 毫升
全部的不适用15毫升

5.10×PBS
试剂最终浓度数量
氯化钠1.5M400克
Na 2 HPO 4 · 2H 2 O0.1M80克
KH 2 PO 415毫米10克
氯化钾25毫米10克
MQH2O _ _不适用最多 5 升
全部的不适用5升

设备

1.Corning ®组织培养处理的培养皿（150 mm × 25 mm）（Merck，Corning ® ，目录号：CLS430599）
2.Active Motif dounce均质器（Fisher Scientific， Active Motif 40401，目录号：NC0569256 ）
3.Nunc TM细胞刮刀（ Thermo Scientific TM ，目录号：179707PK）
4.L-90K 超速离心机（贝克曼库尔特，目录号：8043-30-1191）
5.90 Ti 型定角钛转子（Beckman coulter，目录号：355530）
6.离心机 5810R（Eppendorf，目录号：5811000015）
7.15 mL 聚丙烯离心管（ Thermo Scientific TM ，目录号：17627105）
8.8.9 mL超速离心管（ Beckman coulter，目录号： 361660 )
9.Heidolph RZR 2051 控制均质器（Fisher Scientific，目录号： FIS13-880-115)
10.组织研磨机，Potter Elvehjem型，带 PTFE 杵，用于软组织，15 cm 3 （Avantor，VWR ® ，目录号 432-5041 ）
11.蛋白质印迹设备 (Bio-Rad)

程序

A.从 HeLa 细胞中分离 ER（图 1）

使用 HeLa 细胞进行内质网 (ER) 分离过程的图形总结
1.细胞收集、漂洗和刮擦
a.对于此协议，将五个 150 mm 培养皿直接在冰上或冷表面（4°C）的实验室工作台上一次刮擦一个。与此同时，当一个培养皿报废时，其他培养皿必须保留在 37°C 的培养箱中。刮擦之前，吸出介质，然后添加约 8 mL 的 PBS 1 ×体积以冲洗培养皿。轻轻旋转以确保 PBS 覆盖培养皿的整个表面后，吸出 PBS，然后添加 4.5 mL 冰冷的 MIB-S 缓冲液。一旦添加了 MIB-S 缓冲液，培养皿就可以用手动刮刀沿一个方向刮掉。
⚠重要步骤： MIB-S 缓冲液必须保持低温，以确保其正常运行并促进该过程。
笔记：
我。确保所有表面和设备在使用前用 70% 乙醇消毒。
二.应使用具有受控CO 2水平的标准细胞培养箱。如果不可能，请使用 37 °C 培养箱（无 CO 2控制），确保细胞仅保存很短的时间，以防止其不必要的分离。
b.第一次刮擦的结果是，将获得含有 4.5 mL 缓冲液中的细胞悬浮液的培养皿。此时，将按照前面步骤中的说明冲洗下一个培养皿，并且不再添加额外的 4.5 mL 缓冲液，而是重新使用第一个培养皿的细胞悬浮液来刮擦下一个培养皿。
⚠重要步骤： 4.5 mL MIB-S 缓冲液在所有五个培养皿中重复使用。因此，将使用相同体积的缓冲液来积累所有培养皿中的细胞。
注意：对于此步骤，胰蛋白酶也可用于分离和收集细胞。在这种情况下，必须将细胞离心，用 PBS 冲洗，然后用 4.5 mL MIB-S 缓冲液重悬。
c.最后，将细胞悬液转移至 15 mL 聚丙烯离心管中。
注意：由于每五个板的细胞积累，预计获得的最终体积约为 6 – 8 mL。
2.低速离心和孵育
a.将含有细胞悬浮液的聚丙烯管在 4°C 下以 600 × g离心 5 分钟。获得的沉淀将对应于最后一步中收集的细胞。
注意：此离心以及以下所有离心均在 4 °C 下进行，如一般说明和故障排除部分所述。
b.测量获得的细胞沉淀的大致体积（通常为 0.5 mL），并准备三倍于该体积的 SB。
c.吸出上清液并按照上一步冷 SB 计算的体积重新悬浮沉淀。如果有0.5mL，则准备1.5mL的SB。
注意：要重悬，请使用 1 mL 巴斯德移液器以防止破坏细胞。
d.将细胞悬液在 4°C 孵育 35 分钟。
e.孵育完成后，再次以 600 × g离心5 分钟。这次，产生的沉淀将由肿胀的细胞组成。
f.小心吸出上清液并用 8 mL MIB-S 缓冲液重悬，以避免渗透不平衡。
3.同质化
a.为了获得不同的级分，必须首先将细胞均质化以保留细胞器结构。对于此过程，将步骤 A2f 中获得的 8 mL 细胞悬浮液倒入杜恩斯均质器中，并使用紧杵（使用 15 cm 3均质器）均质化 20 次。
⚠至关重要：这是重要的一步，协议的成功取决于其执行的精确度。为了使其正常工作，必须在同一运动中同时扭转（或旋转）杵的同时上下推动。小心地执行此动作非常重要，以避免形成气泡。
注意：使用均质机及其杵之前，请用普通水和超纯水冲洗。均质化必须在冰上进行，以尽量减少蛋白酶的影响。
b.均质化的结果将被称为总均质化。在-20°C 下储存约 150 μL的样品，用作蛋白质印迹分析的对照。
4.低速离心：去除细胞碎片
a.将总匀浆转移至 15 mL 聚丙烯离心管中，并以 600 × g离心5 分钟。离心后获得的沉淀将对应于细胞碎片并被丢弃。
b.将上一步获得的上清液转移至新的 15 mL 聚丙烯离心管中，并再次以 600 × g离心5 分钟。此步骤用于进一步清洁样品。与上一步一样，仅保留上清液。
5.获取主要分数
a.将步骤 A4b 中获得的上清液转移至新的 15 mL 聚丙烯离心管中，并以 1,200 × g离心4 分钟。离心后，所得沉淀将对应于质膜中高度富集的样品。为了保留该分数，将上清液转移到新的 8.9 mL 超速离心管中，并将沉淀重新悬浮在 150 μL MIB-C 缓冲液中。将此样品储存在 -20°C 下以进行进一步的蛋白质印迹分析，并将其标记为血浆膜样品。
注意：此步骤后，每次离心均使用 Beckmann 的 90Ti 定角转子在超速离心机中进行。
b.将上清液以 7,000 × g离心 15 分钟。离心的结果将是与线粒体和线粒体相关膜 (MAM) 富集部分相对应的沉淀。与上一步一样，将上清液转移至新的 8.9 mL 超速离心管中，并将沉淀重悬于 150 μL MIB-C 缓冲液中。将重悬沉淀储存在-20°C，以进行进一步的蛋白质印迹分析，并将其标记为线粒体和 MAM样品。
注意：按照 Wieckowski 等人描述的方案，可以进一步从该部分中分离纯线粒体和纯 MAM。（2009）。
c.将上一步的上清液以 20,000 × g离心 35 分钟。离心的结果将是主要由质膜污染物组成的沉淀。如前所述，就像上一步一样，将上清液转移到新的 8.9 mL 超速离心管中，并将沉淀重新悬浮在 150 μL MIB-C 缓冲液中。将重悬沉淀储存于-20°C，以进行进一步的蛋白质印迹分析，并将其标记为血浆膜污染样本。
d.将上一步的上清液以 100,000 × g离心 65 分钟。最后，离心的结果将是高度富集的内质网沉淀。要储存样品，请吸出上清液，并将内质网沉淀重新悬浮在 -20°C 的 150 μL MIB-C 中。该分馏的结果以及该协议的图形指南可以在图 2 和图 3 中观察到。

图 2. 使用 HeLa 细胞进行亚细胞分级分离方案中关键步骤的图形概述

图 3. 使用 HeLa 细胞的亚细胞分级分离方案的蛋白质印迹结果。为了进行此验证，将 20 μg蛋白质加载到 10% SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶中。每个级分均使用 1:1,000 稀释度的特定蛋白质抗体进行测试。二抗也按照相同比例在 PBS 中稀释的 5% 牛奶中稀释。与测试的蛋白质相关，内质网 (PDI)、线粒体（外膜：TOM20、VDAC/内膜：Tim23）、线粒体相关膜 ( MAM) (FACL4) 和质膜 (Na + /K + ATPase)已测试。这些蛋白质是专门选择的，因为它们是这些方案中典型污染细胞器的标记。 TH：总匀浆； PM：质膜； PMC：质膜污染； MM：线粒体和MAM； ER：内质网。

B.从 HeLa 细胞中分离 ER：添加更多培养皿

当进行需要更大纯 ER 样本量的实验时，可能需要添加更多培养皿。然而，重要的是要记住，随着添加更多的培养皿，在我们的实验中观察到更多的污染（意味着存在纯度较低的部分，而不是微生物）。根据我们的分析，最干净的样品是使用 5 个培养皿获得的，有可能将其增加到 10 个，考虑以下因素：
1.每组五个培养皿使用4.5 mL MIB-S 缓冲液 1 × 。这意味着，在这种情况下，总共 9 mL 的缓冲液仅用于刮擦部分。
2.，没有使用 8 mL MIB-S 缓冲液 1 ×进行重悬，而是使用 16 mL 缓冲液。
3.使用更大的聚丙烯离心管。
4.在第 5 部分中，将总体积分成两个超速离心管，并使用与上一节中所述相同的转子进行离心。使用 100 μL MIB-C重悬每个沉淀，最后将两种重悬液添加到一起（我们将其称为“池化”）。
尽管我们观察到使用 10 个培养皿时该协议仍然相当稳定，但我们认为应该进一步改进。在这种情况下，我们建议同时对五个培养皿进行多次分级，并形成网状池。平均而言，每五个培养皿我们获得大约 250 – 300 μg的内质网；因此，如果所需数量为 1 毫克，更有效、更清洁的方法是使用 20 个培养皿并同时执行该方案四次。

C.使用不同细胞系进行内质网分离

虽然分级分离方案最初是针对 HeLa 细胞进行优化的，但我们观察到它可以适用于其他细胞类型。主要修改涉及调整均质化参数，包括均质器类型和冲程次数，以考虑膜硬度的差异。例如，我们使用自动匀浆器以 4,000 rpm 的转速连续 20 次冲程，成功地从小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 中分离出网状组织（图 4）。这些发现证明了该方案的灵活性及其针对其他细胞类型进行定制的潜力。

图 4. 使用小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 细胞进行亚细胞分级分离方案的蛋白质印迹结果。为了进行此验证，将 20 μg蛋白质加载到 10% SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶中。每个级分均使用 1:1,000 稀释度的特定蛋白质抗体进行测试。二抗也按照相同比例在 PBS 中稀释的 5% 牛奶中稀释。与测试的蛋白质相关，测试了内质网 (PDI)、线粒体 (Tim23)、线粒体相关膜 ( MAM) (FACL4) 和质膜 (Na + /K + ATPase)。选择这些蛋白质是因为它们是这些方案中典型污染细胞器的标记。 TH：总匀浆； PM：质膜； PMC：质膜污染； MM：线粒体和MAM； ER：内质网。

D.从小鼠肝脏中分离 ER （图 5）

图 5.使用小鼠肝脏进行 ER 分离过程的图形总结
1.肝脏均质化
a.通过颈椎脱位对动物进行安乐死，取出一块肝脏，并取出胆囊。立即用冰冷的 PBS 清洗肝脏两次以除去血液。
b.转移肝脏并用冰冷的 PBS 再次清洗。然后，用剪刀将肝脏切成小块（约0.2厘米）。
c.将肝脏碎片转移到 15 mL 玻璃/Teflon Potter Elvehjem均质器中。每克肝脏添加 4 mL MIB-L。
注意：通常，正常肝脏重 1.5 g，因此通常需要 6 mL MIB-L。我们在进食和禁食的动物中使用了该方案，并且它在两种条件下都有效。这是在正常饮食喂养的小鼠中进行的。当小鼠接受不同的饮食，特别是那些导致肝脏脂质成分改变的饮食时，该协议的结果可能会有所不同。通常，获得15 μg / μL ER 时的 500 μL 。
2.低速离心
a.将匀浆转移至 15 mL 聚丙烯离心管中，并在4 °C下以 600 × g离心5 分钟。在此步骤中，细胞核、未破碎的细胞和细胞碎片沉积在管底部。
笔记：
我。此离心以及以下所有离心均在 4 °C 下进行，如一般注意事项和故障排除中所述。
二.为了进行正确的内质网分离，在将脂质转移到新的离心管之前吸出脂质非常重要。可以观察到漂浮在上清液顶部的白色薄层。
b.丢弃生成的颗粒并将上清液转移至新的 15 mL 聚丙烯离心管中。然后将该管以 600 × g离心5 分钟，以去除剩余的细胞碎片。
注意：与上一步一样，必须丢弃漂浮在管顶部的脂质层。
c.弃去沉淀，将上清液转移至新的 8.9 mL 聚丙烯离心管中，并使用 Beckmann 90-Ti 固定角转子以9,000 × g离心 10 分钟。这将 ER（上清液）与粗线粒体和 MAM 分离，最终以沉淀形式观察到。该分数可以作为线粒体和 MAM保存用于分析目的。
注意：通过使用 Wieckowski 等人描述的方案，可以进一步从该部分中分离纯线粒体和纯 MAM。（2009）。
3.高速离心
a.使用与上一步相同的转子将上清液以 20,000 × g离心 30 分钟。在这种情况下，颗粒将主要包含质膜和具有相似密度特性的其他膜。
注意：如果形成脂质层，请按照前面的步骤将其丢弃。
b.将上清液转移至新的 8.9 mL 聚丙烯离心管中，并使用同一转子以100,000 × g离心 1 小时。
c.最后，吸出上清液并用 500 μL MIB-L 重悬沉淀。这个颗粒对应于高度富集的 ER 级分，将储存在 -20 °C 以供进一步分析。该分馏的结果以及该协议的图形指南可以在图 6 和图 7 中观察到。

图 6. 使用小鼠肝脏进行亚细胞分级分离方案中关键步骤的图形概述

图 7. 使用小鼠肝脏进行亚细胞分级分离方案的蛋白质印迹结果。将20 μg蛋白质上样到 10% SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶中。每个级分均使用 1:1,000 稀释度的特定蛋白质抗体进行测试。二抗也按照相同比例在 PBS 中稀释的 5% 牛奶中稀释。与测试的蛋白质相关，内质网 (PDI)、线粒体（外膜：TOM20、VDAC/内膜：Tim23）、线粒体相关膜 ( MAM) (FACL4) 和质膜 (Na + /K + ATPase)进行了测试。这些蛋白质是专门选择的，因为它们是这些方案中典型污染细胞器的标记。 TH：总匀浆； ER：内质网。

数据分析

根据现有文献，该技术的验证是定性的而不是定量的。因此，该技术的有效性取决于观察相应泳道中 ER 特异的标记，并确保同一样本中不存在其他细胞器标记。因此，由于不需要定量方法，因此蛋白质印迹被用作监测富集的主要方法。
在我们的亚细胞分级分离方法中，我们使用内质网 (PDI)、线粒体（TOM20 表示外膜，Tim23 表示线粒体内膜）、MAM (FACL4) 和质膜 (Na + /K + ATPase )标记。 MAM 由线粒体和内质网组成。因此，ER 级分中存在少量 MAM 是可以预料的。然而，ER 部分中的大量 MAM 表明存在受污染的非纯网织部分。

协议验证

为了实现可重复性，我们通过生成三个结果副本来微调协议。此外，在不同日期进行了三次独立隔离，以确保方案的稳健性。本协议之前提供的蛋白质印迹分析图像对应于所实现的最佳结果。这些可以在下面的 HeLa 细胞（图 8）和小鼠肝脏（图 9）提取物中观察到：

图 8. 使用 HeLa 细胞验证方案。将20 μg蛋白质上样到 10% SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶中。每个级分均使用 1:1,000 稀释度的特定蛋白质抗体进行测试。二抗也按照相同比例在 PBS 中稀释的 5% 牛奶中稀释。与测试的蛋白质相关，测试了内质网（PDI）、线粒体（外膜：TOM20）、线粒体相关膜（ MAM）（FACL4）和质膜（Na + /K + ATP酶）。每个蛋白质印迹对应于一个独立的分离。 TH：总匀浆； ER：内质网。

图 9. 使用小鼠肝脏验证方案。将20 μg蛋白质上样到 10% SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶中。每个级分均使用 1:1,000 稀释度的特定蛋白质抗体进行测试。二抗也按照相同比例在 PBS 中稀释的 5% 牛奶中稀释。与测试的蛋白质相关，测试了内质网（PDI）、线粒体（外膜：TOM20）、线粒体相关膜（ MAM）（FACL4）和质膜（Na + /K + ATP酶）。每个蛋白质印迹对应于一个独立的分离。 TH：总匀浆； ER：内质网。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.在用细胞进行亚细胞分级分离的情况下，获得的网状细胞的量约为2.5μg / μL ，约为300μL 。该量足以进行某些分析，例如检查该细胞器中某些其他蛋白质的存在，但可能不足以进行更复杂的分析。
2.所有缓冲液必须含有蛋白酶抑制剂混合物，并且每个样品必须保存在 4°C（或冰上）以避免降解。因此，每次离心也必须在 4 °C 下进行。
3.在正常饮食喂养的小鼠中进行肝脏实验。当小鼠接受不同的饮食，特别是那些导致肝脏脂质成分改变的饮食时，该协议的结果可能会有所不同。通常，获得15 μg / μL ER 时的 500 μL 。
4.该协议使用固定角度转子。我们建议将这些类型的转子用于这些目的，尽管也可以使用其他型号。请注意，不同的转子可能会改变纯化的质量。

故障排除

1.细胞汇合非常重要，必须约为80% – 90%；否则，获得的样品量可能会受到严重影响。为了解决这个问题，可以在其他盘子不太汇合的情况下再添加一个盘子，以获得与五个盘子相似的量。
2.结果可能会根据细胞的状态而变化。具有高传代或正在经历衰老的细胞可能会导致与本协议中显示的结果不同的结果。建议的 HeLa 细胞传代次数应约为 1 – 80。
3.如果观察到级分中存在异常污染，则问题可能在于均质化步骤。此过程中均质化和气泡形成的速度、强度、温度和均匀性是导致此问题的常见原因。另请注意，这些特性以及冲程数量可以适应任何特定的实验室条件。
4.如果在两次低速离心（HeLa 细胞部分的步骤 4，或小鼠肝脏部分的 2a 和 2b）后观察到较大的沉淀，则可以再次离心上清液以进一步清洁样品。
5.如果 HeLa 细胞分级分离中出现异常质膜污染，可以在步骤 A5a 之后按照这些相同的参数进行额外的离心。
6.如果使用非常细的吸头吸取上清液，也可能会发生异常污染。为了避免不必要的破损，最好使用直径约为 0.5 mm 的吸头处理上清液。将重新用于进一步纯化步骤的颗粒也应使用这些类型的吸头进行处理。
7.在大多数情况下，最终结果显示的污染程度主要是由于均质化不良造成的。确保在此步骤中没有形成气泡，并且一切都在冰上进行以避免降解。为了改进此步骤，可以通过匀浆细胞并使用台盼蓝染色检查破损程度并在显微镜下观察来微调笔画次数。当观察到的细胞大约 90% 破裂时，即可认为破裂程度良好。
8.匀浆后，当细胞或组织匀浆离心时，如果观察到大颗粒，这可能意味着有大量细胞尚未适当匀浆。在这种情况下，可以使用与均质化之前相同的缓冲液重新悬浮沉淀，并且可以进行第二次均质化。第二次均质化的结果可以添加到第一次均质化中，也可以与第一次均质化并行执行该方案并加入最终的颗粒。尽管尚未进行详尽的分析来确定地证明其有效性，但已观察到第二种方法更为成功。
9.有些颗粒可能有点松散；因此，蛋白质印迹分析中缺乏条带可能是由于意外吸入一些沉淀而造成的。
10.如果观察到产量低，这可能是由于起始材料的数量少或质量差（应激细胞、经历降解的组织、凋亡细胞……）。
11.作为一种故障排除技术，可以在显微镜下或通过蛋白质印迹分析细胞碎片，以确定均质化是否正确进行。

致谢

我们感谢玛雅·赛杜·莫莫特对本文的评论和批判性阅读。
资助：这项研究得到了 MICINN (PID2019-105466RA-I00 AEI/10.13039/501100011033 和 RYC2018-024345-I MCIN/AEI/10.13039/501100011033) 和“la Caixa”基金会健康研究补助金 2021 的研究资助（LCF/ PR/HR21/52410007)。

利益争夺

作者不受任何利益冲突的影响。

道德考虑

所有动物工作均根据既定指南获得批准并进行。该项目得到了巴塞罗那科学公园机构动物护理和使用委员会 (IACUC-PCB) 的好评， IACUC认为上述项目符合标准道德法规，并满足当前适用立法 (RD 53) 的要求。 /2013 理事会指令；2010/63/UE；命令 214/1997/GC）。

参考

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