材料与试剂

生物材料

1.p-H3（兔）（Ser10）抗体（Cell Signaling，目录号：9701S），储存于-20°C
2.驴抗兔 IgG (H+L)，Alexa Fluor 555（Life，目录号：A31572）
3.100 ng/mL IGF-2重组蛋白（R&D Systems，目录号：792-MG-050）
4.TNNT2 H2B-GFP/+小鼠（来自蔡晨冷博士，背景菌株：C57BL/6J）

试剂

1.1× PBS pH 7.4（Gibco，目录号：10010-023）
2.1 M HEPES（Gibco，目录号：15630-060），储存于 4 °C
3.0.5 M EDTA pH 8.0（Gibco，UltraPure，目录号：15575），储存于 4 °C
4.1:250胰蛋白酶（Gibco，目录号：27250-018）
5.HBSS 溶液（Gibco，目录号：14175-095）
6.马血清（Gibco，目录号：16050-114），储存于-80°C
7.FBS（Gibco，目录号：10437-028 ），储存于-80°C
8.100 ×抗生素抗真菌剂（Gibco，目录号：15240-062）
9.1× DMEM [-] Ca 2+ （Gibco，目录号：21068-028），储存于 4 °C
10.层粘连蛋白（Corning，目录号：354232），储存于-80 °C
11.1× DPBS（Ca 2+ /Mg 2+ ）（康宁，目录号：21-030-CV）
12.1× Opti-MEM（Gibco，目录号：31985-070），储存于 4 °C
13.IC 固定缓冲液（Invitrogen，目录号：00822249），储存于 4 °C
14.Triton X-100（Fisher Biotech，目录号：BP151-500）
15.驴血清（Fisher Brand，目录号：03-395-464）
16.0.1 μg/mL DAPI（1:1,000 工作浓度）（Sigma，目录号：D9542）
17.1× DMEM [+] Ca 2+ （Gibco，目录号：11965-092），储存于 4 °C

解决方案

1.胰蛋白酶溶液（参见食谱）
2.解离缓冲液（参见配方）
3.冲洗介质（参见配方）
4.培养基（参见食谱）

食谱

1.胰蛋白酶溶液（1× HBSS）
试剂最终浓度数量（25 毫升）
赫佩斯 (1 M)10毫米250微升
乙二胺四乙酸 (0.5 M)0.54毫米27微升
胰蛋白酶0.25%0.0625克
HBSS溶液（1×）不适用25毫升

2.解离缓冲液（在 1× HBSS 中），4 °C
试剂最终浓度数量（25 毫升）
马血清10%2.5毫升
胎牛血清5%1.25毫升
赫佩斯 (1 M)
HBSS解决方案（1×）不适用
不适用250微升
21.2毫升

3.冲洗介质（在不含 Ca 2+的 DMEM 中）
试剂最终浓度数量（50 毫升）
马血清10%5毫升
胎牛血清5%2.5毫升
抗生素抗真菌药
Ca 2+ DMEM1%
不适用0.5毫升
42毫升

4.培养基（Opti-MEM）
试剂最终浓度数量（20 毫升）
马血清10%2毫升
胎牛血清5%1毫升
抗生素抗真菌药
优化MEM0.1%
不适用20微升
17毫升

注意：在分离和铺板心肌细胞步骤中，高质量和优化浓度的胎牛血清和马血清对于细胞活力和细胞粘附至关重要。

实验室用品

1.手术剪刀（Roboz，目录号：RS-5882）
2.弯钳（Stoelting，目录号：52102-54P）
3.7 mL 移液管（Globe Scientific，目录号：135038）
4.24孔培养板（Denville，目录号：T1024）
5.1.5 mL微量离心管（Stellar Scientific，T3 Tube，目录号：T17-300）
6.60毫米细胞培养皿（Eppendorf，目录号：0030701111）
7.70 μm 网状细胞过滤器（Swish，目录号：TC70-MT-3）
8.15 mL 离心管（Denville，Thomas Scientific，目录号：1158R11）

设备

1.M205 FCA显微镜（徕卡）
2.杂交炉/摇床（Amersham Biosciences）
3.离心机 5425 R (Eppendorf)
4.TSX60086A -80 °C 冷冻柜（Thermo Scientific）
5.Isotemp CO 2培养箱（Fisher 品牌）
6.离心机 5702 (Eppendorf)
7.手持式自动细胞计数器（Millipore，Scepter 3.0，目录号：PHCC30000）
8.60 μm 传感器（Millipore、Sceptre 3.0、PHCC360050）
9.-20 °C 冷冻柜（Fisher Scientific、Isotemp）
10.4°C 冰箱（Insignia）
11.BZ-X800 显微镜（基恩士）
12.标准轨道摇床，型号 5000（VWR，目录号：89032-100）

软件和数据集

1.ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/download.html )

程序

A.心肌细胞分离

1.E13.5 – E14.5胚胎中收集 GFP 阳性突变体心脏（参见一般说明 1）。
a.制定实验解决方案并准备无菌工作空间。确保 PBS 提前冷藏并在整个程序期间保持在冰上。
b.根据 IACUC 指南，在 E13.5 – E14.5麻醉大坝。
c.用手术刀做一个腹部切口，用弯钳取出胚胎。用手术剪刀将胚胎与胎盘和卵黄囊分开。轻轻地取出每颗心（参见一般说明 2）使用弯钳并使用移液管将其移至含有冷 PBS 的 24 孔板中。每颗心脏都应放置在单独标记的孔中。
d.在荧光发射显微镜下检查心脏的荧光（图1）并相应地标记孔。

图 1. 胚胎日 (E) 13.5 颗来自同一窝 ( TNNT2 H2B-GFP/+ ) 的心脏在明场和 GFP 荧光下以 10倍放大倍数成像。与野生型（上图）相比， TNNT2 H2B-GFP/+小鼠（下图）的 GFP 标记TNNT2基因呈阳性指示。比例尺，1 毫米。

2.分离细胞（参见一般说明 3）。
a.使用转移移液器，将每个 GFP 阳性样品从 24 孔板移至 1.5 mL 微量离心管。来自窝的所有 GFP 阳性样本将被汇集到同一管中并一起消化。然后，用微量移液器吸出多余的 PBS。将 500 μL 胰蛋白酶溶液（参见配方）添加到管中，并用微量移液器轻轻地上下移液以混合。
注意：每颗心脏可以根据胚胎年龄和实验需要单独分离（参见一般说明 4）。
b.使用胶带将微量离心管固定到杂交摇床的平台上。确保其位置使得溶液可以在管中移动并正确混合。在 37°C 下以 70 次/分钟的速度摇动 20 分钟。
c.从摇床上取出试管，用 1 mL 移液器轻轻上下移液 10 – 15 次，直至没有可观察到的组织碎片。
d.使用相同的微量移液器将液体从 1.5 mL 微量离心管转移到 15 mL 离心管中。将 5 mL 冷 (4 °C) 解离缓冲液（参见配方）添加到 15 mL 离心管中。用 7 mL 移液管上下移液，直至细胞在溶液中解聚。
e.g离心5 分钟。
f.在具有消毒表面以避免污染的无菌通风罩中，真空移液器并从管中丢弃所得上清液。
g.微量移液器在无 Ca 2+ DMEM（参见食谱）中添加 1 mL 的冲洗介质。
h.g离心5 分钟。
i.真空移液器并从管中丢弃所得上清液。用微移液器在无Ca 2+ DMEM（参见食谱）中添加 1 mL 的培养基。
j.使用新的微量移液器解聚沉淀并再次离心（400× g ，4°C，5分钟）。所得上清液将用于电镀，不应丢弃。
协议在步骤B2中继续。

B.在培养基中铺板细胞（参见一般说明 3）

1.层粘连蛋白涂层
注意：此步骤应在电镀前一天完成。
a.为了避免过度冷冻和解冻损坏层粘连蛋白，用微量移液器移出层粘连蛋白（最终浓度：10 μg/mL）并转移到 1.5 mL 微量离心管中。将剩余的层粘连蛋白返回-80°C 冰箱。
b.2+ /Mg 2+ )稀释层粘连蛋白（参见一般说明 5），并将溶液添加到 24 孔培养板中（参见一般说明 6）。确保整个表面被层粘连蛋白涂层溶液覆盖。
c.用封口膜密封板以防止蒸发和污染。
d.– 8 °C 下孵育过夜。如果需要更快速的包被，请在 37°C 下孵育 2 小时。
2.电镀心肌细胞
a.使用辅助移液器控制器的 5 mL 血清移液器附件，将 4 mL 培养基添加到未涂层的 60 mm 细胞培养皿中。
b.通过 70 μm 网孔细胞过滤器，将微量离心管中的 1 mL 上清液添加到细胞培养皿中。
c.在荧光显微镜下检查培养皿中是否存在细胞（图 2）。

图 2. 从胚胎日 (E) 13.5 心脏收集的细胞在 20倍放大倍数下的可视化结果，将其接种到带有培养基的 48 孔细胞培养板中。明场成像显示培养皿中存在的所有心脏细胞，而 GFP 荧光通过 H2B-GFP 标签识别心肌细胞。组合的明场/GFP 图像说明了胚胎心脏中非心肌细胞与心肌细胞的比率，需要随后的层粘连蛋白铺板步骤来分离心肌细胞。比例尺，100 μm。

d.2的细胞培养箱中预板 1 小时，以使非肌细胞（成纤维细胞和内皮细胞）粘附到培养皿上。
e.将整个培养皿放入带有斗式转子的 Eppendorf 5702 离心机中，以 400× g离心 5 分钟。
f.小心收集悬浮细胞以避免贴壁细胞，因为它们主要是非心肌细胞（例如成纤维细胞和内皮细胞）。
g.将称重传感器放入 60 μm 传感器中，并通过 Scepter 3.0 手持式自动细胞计数器运行。输出将决定层粘连蛋白电镀所需的孔的大小。
h.使用真空移液器从预制 24 孔板中除去多余的层粘连蛋白溶液。
i.将细胞转移至预制的层粘连蛋白包被板（10 μg/cm 2 ）。
j.在 37 °C、5% CO 2中孵育。
k.24小时后，在显微镜下可以看到心肌细胞跳动（视频1）（参见一般说明7）。除去溶液并用无血清培养基 (DMEM) 替换它一小时以使细胞挨饿。

视频 1. 胚胎日 (E) 13.5 TNNT2 H2B-GFP/+心肌细胞在培养基中 24 小时后跳动

l.用 PBS 清洗细胞。
m.用 100 ng/mL 重组 IGF-2 蛋白生长因子处理细胞。

C.免疫细胞化学和细胞计数（参见一般说明 8）

1.用冰冷的 PBS 清洗细胞。
2.每孔使用 200 μL IC 固定缓冲液在室温下固定细胞 10 分钟。
3.用室温 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
4.通过在每孔中添加 50 µL（或足以覆盖细胞）的 PBS-T（含 0.1% Triton X-100 的 PBS）在室温下透化样品 10 分钟。
5.用室温 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
6.每孔用 50 µL（或足以覆盖细胞）5% 驴血清的 PBS 溶液孵育细胞 1 小时，以阻止非特异性抗体结合。
7.每孔用 50 µL（或足以覆盖细胞）1:250 稀释一抗 [p-H3（兔）- 驴抗兔]（含 1% 驴血清的 PBS）在 4 °C 下孵育细胞过夜。
8.倒出溶液并在 PBS 中洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
9.将细胞与 50 µL（或足以覆盖细胞）1:500 稀释二抗 [驴抗兔 IgG (H+L)、Alexa Fluor 555]（溶于 PBS 的 1% 驴血清）在室温下孵育 1 小时黑暗中的温度。
10.倒出二抗溶液，并在黑暗中用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
11.每孔加入 50 µL（或足以覆盖细胞）0.1 µg/mL 1:1,000 DAPI 工作浓度的细胞，孵育 1 分钟。
12.除去 DAPI 并向每个孔中添加 200 μL 的 PBS。
13.倍对细胞板进行成像（图 3）。

图 3. 无血清培养基中p-H3 免疫细胞化学染色的胚胎日 (E) 13.5 心肌细胞（上图）和 IGF-2 重组蛋白（下图）在 20 倍放大倍数下的荧光成像。当暴露于 GFP 荧光时，H2B-GFP 标记的心肌细胞是可见的（第 1 列）。使用 p-H3 染色剂识别增殖细胞（第 2 列）。组合的 GFP/p-H3 图像（第 3 列和第 4 列）允许对无血清和 IGF-2 处理的 E13.5 心脏细胞中的 GFP+p-H3+ 与仅 GFP+ 心肌细胞进行定量。比例尺，275 μm。对p-H3+心肌细胞的百分比和心肌细胞总数进行定量。 IGF2，每组 n = 4。 P 值通过 Mann-Whitney U 检验确定。

14.ImageJ 图像处理软件对细胞总数（绿色）和 pH3+ 细胞（红色）进行计数。对于心肌细胞总数，我们在 ImageJ 中计数了 GFP 阳性心肌细胞。对于总心肌细胞中 p-H3 的百分比，我们对每个 p-H3 阳性细胞和 GFP 阳性细胞进行了计数。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.E13.5 是心肌细胞的理想收集日。如果在 E12.5 之前收集心脏，则可能没有足够的细胞，而如果在 E14.5 之后收集心脏，则样品中会存在太多成纤维细胞。
2.由于无法在整个胚胎中观察到荧光，因此必须首先取出心脏来检查荧光。出于本研究的目的，收集了整个心脏，但在这个阶段可以根据需要分离心房或心室。此外，该方案可通过染色心肌细胞标记物（例如心肌肌钙蛋白 T）用于野生型 (WT) 心脏。在铺板细胞之前可通过 FACS 进行 GFP+ 细胞分选。
3.所有细胞培养步骤都需要在无菌通风柜中戴上消毒的手套和表面，以防止污染。
4.由于 E13.5 心脏的大小约为 1-2 毫米，因此 500 μL 胰蛋白酶溶液足以消化从一窝中收集的尽可能多的心脏。
5.含有 Ca 2+和 Mg 2+的 DPBS来稀释层粘连蛋白，因为二价阳离子对于蛋白质结构和功能很重要。
6.根据预铺板细胞培养皿中存在的细胞数量，可以将 24 孔板替换为 48 孔板（适用于 1 × 10 4 个细胞）或 96 孔板（适用于 4 × 10 4个细胞）细胞）。
7.分离细胞铺板 24 小时后，心肌细胞明显跳动，48 小时后达到汇合。在此方案中，我们在无血清条件下处理重组蛋白，且细胞传代时间不超过 7 天。然而，在正常血清条件下，从心脏中分离细胞14天后，我们可以观察到跳动的心肌细胞。
8.对于每个洗涤步骤，每孔添加约 200 μL 或足以覆盖细胞，并在 5 分钟后用真空移液器移除；然后，迅速进行下一步，以防止细胞干燥。免疫细胞化学程序的步骤在标准轨道摇床上进行。

致谢

我们非常感谢 Chen-Leng Cai 博士（印第安纳大学，印第安纳州印第安纳波利斯）提供TNNT2 H2B-GFP/+小鼠。这项工作得到了美国心脏协会职业发展奖 23CDA1046244 (JJ) 、国家心肺血液研究所 R01 拨款 HL153406 (DL) 和美国心脏协会转型项目奖 20TPA35490132 (DL) 的部分支持。使用 BioRender.com 创建的图形概述。

利益争夺

不存在利益冲突或利益竞争。

道德考虑

Tnnt2 H2B-GFP/+小鼠先前已有描述。动物方案得到了全国儿童机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。

参考

Jang, J.、Song, G.、Pettit, SM、Li, Q.、Song, X.、Cai, C. l.、Kaushal, S. 和 Li, D. (2022)。心外膜 HDAC3 通过新型 MicroRNA 途径促进心肌生长。循环。资源。 131（2）：151-164。
Rodgers, LS、Schnurr, DC、Broka, D. 和 Camenisch, TD (2009)。用于分离和培养小鼠胚胎肌细胞的改进方案。细胞技术59(2): 93–102。
Yan, J.、Zhang, L.、Sultana, N.、Oh, JG、Wu, B.、Hajjar, RJ、Zhou, B. 和 Cai, CL (2016)。一系列强大的遗传指标，用于明确鉴定心肌细胞。 J.莫尔。细胞。心脏。 97：278-285。
Zaidi, S. 和 Brueckner, M. (2017)。先天性心脏病的遗传学和基因组学。循环。资源。 120（6）：923-940。