软件说明

RefSeeker 是一个用 R 开发的软件包，旨在兼容不同的操作系统。 R 是一种广泛使用的免费开源统计环境，从而为表达数据分析提供了良好的基础（R Core Team，2022）。 R 提供了出色的工具来处理表格格式的数据以及绘图和绘图。 RefSeeker 包利用广泛可用的工具，可通过 Base R 或综合 R 存档网络 (CRAN) 获得。
对于 RefFinder，要使用 RefSeeker 包，需要以表格格式准备表达数据。但是，数据可以准备为在 R 中准备的数据对象，也可以准备为受支持的文件类型之一（.xls、.xlsx、.ods、.csv、.tsv 或 .txt）。每列代表一个命名目标（基因、miRNA 或其他），每行代表一个样本。如果数据文件是使用 R 创建的，则默认情况下可能会将索引列添加到 .csv 文件中。应通过设置 row.names = FALSE 来避免这种情况。如果电子表格（Excel 或 .ods）包含多个数据集，则电子表格文件中的每个工作表都可以包含一个数据集。为工作表命名将使以后更容易识别数据，因为名称会被保留。对于基于 txt 的文件（例如 .csv、.tsv 或纯 .txt 表），每个数据集必须位于同一文件夹中的单独文件中。

包函数可以分为四类：
1. 数据导入功能，从不同来源（.csv、.tsv、.txt、.xls、.xlsx 和 .ods）导入数据并安排进一步处理。包装函数 rs_loaddata() 可识别文件扩展名并调用正确的导入函数。
2.数据处理功能。 RefSeeker 使用四个主要函数来执行 RefFinder 分析：rs_normfinder()、rs_genorm()、rs_bestkeeper() 和 rs_deltact()。这些函数均由 rs_refinder() 函数调用来确定稳定性排名。然后将综合排名计算为这些稳定性排名的几何平均值。
3. 数据导出功能，用于进一步分析、可视化和发布结果。函数 rs_graph() 处理打印以及可选择将图形导出为 .png、.tiff、.jpeg 或 .svg 文件格式。同样，函数 rs_exporttable() 处理数据表的导出，可以是电子表格（.ods 或 .xlsx）、基于 txt 的格式（.csv、.tsv、.txt）或 docx 格式的格式化表。
4. 通过rs_wizard()交互式实现上述功能。该功能提供了一个图形用户界面对话框窗口，用于选择数据和输出表以及图形格式。

请参阅图 1 了解主要功能及其与工作流程的关联的概述。

图1 。简单的数据分析流程图。可以通过 rs_load() 或 rs_wizard() 函数从外部源加载数据。可以使用 rs_refinder() 对数据执行 RefFinder 分析，并且可以通过 rs_exporttable() 和 rs_graph() 函数可视化和导出分析的数据。输出示例如图 3、图 4、图 5 和表 1 所示。

设备

1.装有与 R (≥ 4.1.0) 兼容的基于 Windows、MacOS 或 Linux 的操作系统的计算机

软件和数据集

1.R软件环境（ ≥4.1.0 ）（ https://www.r-project.org/ ）
2.RStudio集成开发环境（ ≥1.4.0 ）（可选， https://posit.co/ ）
3.数据集可以通过多种方式准备，原始表达数据的处理超出了本协议的范围。然而，一般来说，应该对数据进行清理、质量检查并针对板间变异性进行调整（Petersen 等人，2022）。
数据可以采用受支持的文件类型之一（.xlsx、.ods、.csv、.tsv 或 .txt）来准备，也可以作为 R 中的数据框来准备。
示例数据可以从以下网址下载： https: //github.com/Hannibal83dk/RefSeeker/blob/main/SampleData/RefSeekerSampleData.xlsx （见图 2）。这些数据之前已经描述过，有关实验设计、数据采集和处理的详细信息可以在 Petersen 等人的文章中找到。（2022），数据是从那里获得的。
•无论输入源如何，以下要求都是相同的：
• 每列必须代表一个基因/靶标，每行必须代表一个单独的样本*。
•每列都必须命名。
•必须排除行名称。
•不允许丢失数据**。
*虽然 RefSeeker 包可以处理列名称中的空格和破折号，但某些下游 R 进程可能无法处理。因此，最佳实践建议避免在列名称中使用这些字符。
**缺失数据可以通过多种方式处理。如果需要保存样本，可以将目标移除；如果更希望保留目标，可以移除样本。如果两者都很重要，则可以选择允许丢失数据的百分比阈值。这个阈值是单独选择的；然而，它应该尽可能低。这里无法提供具体建议；然而，之前曾使用过 20% 缺失数据的阈值，这似乎是一个近似的上限。目标排除后，可以使用不同的工具对剩余的缺失数据点进行插补[例如，MissForest（missForrest 包）、k-最近邻（VIM 包）、链式方程多重插补（mice 包）或 max + 1（手动实现）] 。

图2 .用于 RefSeeker 分析的 Excel 文件中的表达式数据示例。这些可以是三次重复或四次重复的平均值，并且应该针对例如可能的板间变化进行调整。目标在第一行给出。以下每一行代表从每个样本获得的原始 Cp 值（根据板间方差进行调整）。该文件包含三个电子表格：新鲜冷冻、福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 和 Plasma，每个电子表格包含不同的数据集。

程序

A.安装 R 和 RStudio

R和RStudio的安装超出了本协议的范围；但是，有关如何安装这些的更多信息可以在各自的网站上找到：
R 库： https: //cran.r-project.org/
RStudio： https://posit.co/download/rstudio-desktop/

B.安装依赖项

RefSeeker 有一些依赖项，需要首先通过键入以下内容进行安装：

install.packages(c('ctrlGene', 'ggplot2', 'reshape2', 'readxl', 'openxlsx', 'data.table', 'readODS', 'flextable', 'officer'))

C.安装 RefSeeker 软件包

安装依赖项后，可以通过两种方式安装包：
1.从 GitHub 下载包存档：
a.下载最新版本的 RefSeeker_lates t.tar.gz 文件到您的计算机：
最新版本可以在以下位置找到：
https://github.com/Hannibal83dk/RefSeeker/releases/latest/download/RefSeeker_latest.tar.gz
b.打开 R 或 RStudio。
c.在 R 控制台中，键入：

install.packages("", repos = NULL, type = "source")

注意：请注意，的整个部分需要更改为下载文件在计算机上的具体位置。
或者，如果正在使用 RStudio：从菜单栏中打开下拉菜单“工具” > “安装包” > “从安装位置”下拉菜单中选择“从存档文件中选择包” 。浏览下载的软件包存档 > 按Install 。
2.使用devtools从GitHub下载：
确保您的 R 环境中安装了 devtools 包。在 R 控制台中，可以使用以下命令从 CRAN 安装 devtools：

a.安装.packages(“开发工具”)

在 R 控制台中输入：

b.devtools::install_github("Hannibal83dk/RefSeeker", build_vignettes = TRUE)

D.RefFinder 分析

为了说明该软件包的可用性和易用性，将使用三个表达数据集，其中包含来自 20 名患者的 6 个 miRNA 的 Cp 数据，三种样本类型 [新鲜冷冻、福尔马林固定和石蜡包埋 (FFPE) 以及血浆] (Petersen等人，2022）。数据作为单独的工作表存储在 .xlsx 文件中（图 2）。
目的是确定最稳定的 miRNA，用于每个数据集的标准化。首先，需要将包加载到 R 环境中。有两个选项可用于分析。
1.快速一体化分析向导：
a.加载 RefSeeker 包：
在 R 控制台中首先输入：

图书馆（RefSeeker）

b.运行 RefSeeker 向导将打开一个图形界面对话框窗口，提供输入数据和输出格式的快速选择。
现在，在控制台中运行以下命令：

rs_wizard()

这将导致弹出一个对话框窗口（参见图 3）。

图3 . rs_wizard() 对话框允许交互式快速分析。该对话框由九个部分组成：i) 输入文件的选择，ii) 输出文件的文件夹选择，iii) 输出文件名的可选前缀，iv) 条形图格式的选择，v) 选择文件的顺序目标轴，vi) 选择条形图的方向，vii) 选择图形输出文件格式，viii) 选择表格格式，以及 ix) 用于继续或退出分析的选项。

c.按“选择输入文件”按钮（图 3-i）将打开文件管理器。从这里导航到 .xlsx 文件并选择它。
d.按更改输出文件夹按钮（图 3-ii）并从文件管理器中选择输出目录。
可以选择文件名前缀来标识输出文件（图 3-iii）。通过单选按钮，可以修改所需的输出。
e.首先，选择所需的图表类型（图 3-iv）： Individual将为每个数据集制作一个图表， Multi将创建一个将所有数据集组合在一个图表中的分面图表（参见图 4）。
f.x 轴的顺序也可以更改（图 3-v）。默认为综合排名，这意味着 x 轴上的所有目标排列将根据综合排名提供的排名从最稳定到最不稳定进行排序。
g.可以选择所需的条形图方向（图 3-vi）。
h.选择所需的文件格式来输出图形（图 3-vii）。
i.最后，选择所需的表格输出格式（图 3-viii）。
j.按“确定”并将输出收集到选定的输出文件夹中（图 3-ix）。
根据默认选择，将在选定的输出文件夹中创建一个 .png 文件和一个 .xlsx 文件（图 4 和图 5）。在步骤D1i（图3-viii）中，可以选择docx类型表而不是.xlsx文件。 docx 类型表格格式的示例如表 1 所示。这是展示出版物稳定性的不错选择。
从生成的输出（图 4 和图 5）来看，稳定性值较低的目标被认为更稳定。可以看出，最稳定的内源 miRNA 是血浆中的 hsa-miR-191-5p 和 hsa-miR-23a-3p，新鲜冷冻组织中的 hsa-miR-23a-3p 和 hsa-miR-30c-3p，以及 hsa -miR-30c-3p ahashsa-miR-191-5p 用于 FFPE 组织。请注意，由于不同的算法对稳定性的评估不同，因此结果可能会有所不同（De Spiegelaere 等人，2015）。由于 BestKeeper 仅评估每个样本的标准差，因此通常会观察到 BestKeeper 与其他更加相互依赖的算法之间存在很大差异，特别是 GeNorm 和 delta-Ct，它们评估高度相关的目标更稳定。孙达拉姆等人。（2019）提出了解决此问题的综合方法，即在再次进行分析之前删除总体方差较高的目标。

图4 .使用 RefSeeker 创建的图形输出示例。包含来自三个不同数据集的数据的多重图，使用水平布局和按综合排名排序的目标。

图5 . Excel 表格输出示例。第一张表中提供了每种算法的稳定性值，目标按综合排名排序。第二张表与第一张表类似，但包含排名而不是稳定性值。

表1. docx-Combi 类型表输出格式示例
等离子体δ-Ct最佳守门员规范发现者基因规范综合排名
目标平均。标准差。秩疯狂的秩稳定秩平均M秩吉姆.平均值秩
hsa-miR-191-5p0.75611.35520.07510.33211.1891
hsa-miR-23a-3p0.76521.52630.27430.33212.0602
hsa-miR-30c-5p0.82631.54140.21720.48843.1303
hsa-miR-451a1.73551.17211.70450.98653.3444
hsa-miR-103a-3p0.85041.63950.60340.40833.9365

2.命令行分析：
为了更好地控制输出并运行额外的分析，可以使用 R 命令行。建议创建一个可以运行命令的 R 脚本。此外，使用详细信息和会话信息库的 R-markdown 文档是记录会话信息和所用包版本并以可重复的方式报告结果的好方法。
a.首先，加载 RefSeeker 包：

图书馆（RefSeeker）

数据导入
b.将数据加载到 R 变量中：

输入数据 <- rs_loaddata()

从文件选择对话框中，查找并选择数据文件。
或者，文件路径可以作为函数的参数给出；建议这样做以提高代码的可重复性。

inputData <- rs_loaddata(c('路径/到/文件1', '路径/到/文件2'))

RefFinder 分析
c.执行 RefFinder 分析：

结果 <- rs_refinder(inputData)

可以通过键入以下内容来检查结果：

结果

有关给定输出的示例，请参阅文件S1 。输出作为包含每个数据集结果的列表列表返回。每个数据集的结果以两个表的列表形式给出：一个用于稳定性值，另一个用于所有目标的稳定性排名。
d.可以通过键入以下内容来访问每个单独数据集的结果：

结果$Fresh_Frozen

这将返回 Fresh Frozen 数据集的两个表。
e.要访问单个表，请键入：

结果$Fresh_Frozen$rankTable

这将返回新鲜冷冻数据集的排名表。
从结果中，可以选择一组参考。对于血浆组，hsa-miR-191-5p 和 hsa-miR-23a-3p 似乎最稳定； hsa-miR-23a-3p 和 hsa-miR-30a-3p 似乎在新鲜冷冻组织中最稳定； hsa-miR-30a-3p 和 hsa-miR-191-5p 在 FFPE 中最稳定。

图表导出
f.要生成说明结果的条形图预览，请使用：

rs_graph（结果）

通过创建匹配目标和颜色的数据框来向图表添加颜色。

颜色 <- data.frame(目标 = 名称(inputData[[1]]), 颜色 = c("#E69F00", "#0072B2", "#009E73", "#CC79A7", "#D55E00"))

此处，第一列的目标名称收集在 inputData 数据集列表的第一个数据集中。然后为第二列创建自定义配色方案。建议使用能体现不同色觉的颜色。此处提供的颜色是为此目的而选择的；然而，通过 colorblindr 包可以获得更广泛的选择。
g.再次运行函数 rs_graph，输入颜色数据框将在绘图窗格中创建彩色图形的预览（参见图 6）：

rs_graph（结果，颜色=颜色）

该函数将输出宽度和高度。如果稍后在步骤 D2g 中未更改，这些将用于导出的图像。

> 宽度设置为 2400
> 高度设置为 960

其他参数可用于调整图表。鼓励输入 help(rs_graph) 来获取概述。这里显示了导出到文件之前可以调整的主要参数：

rs_graph （结果， forceSingle = FALSE，ordering = “综合排名”，orientation =“水平”，colors =颜色）

图6 .使用 rs_graph 函数创建的彩色 .png 文件的示例输出

h.一旦图表具有所需的外观，就可以将其导出为多种不同的图像文件类型。再次输入 help(rs_graph) 以查看参数选项的完整列表。在这里，我们将使用之前选择的颜色创建默认图表。要创建图像文件，应将文件名传递给函数：

rs_graph(结果，文件名=“卵巢癌”，颜色=颜色)

同样在这里，该函数将输出宽度和高度以及文件已创建的确认信息和文件路径：

> 宽度设置为 2400
> 高度设置为 960
> 在以下位置创建了一个 png 文件：

i.检查创建的图像文件（图 6）。如果需要，请使用先前输出中给出的宽度和高度作为参考来调整大小。分辨率可以使用res-参数设置；较小的数字将使线条和文本变得更小、更精细：

rs_graph（结果，文件名=“卵巢癌”，颜色=颜色，宽度= 2000，分辨率= 200）

表导出
创建表输出在很多方面都很有用：
• 以通用轻量级文件格式（例如.csv 或.tsv）存储结果。
• 通过Excel 或OpenDocument 电子表格共享。
• 以文字文件或出版物的形式展示调查结果。在这里，我们将为每个数据集创建一个 Excel 文件（参见图 5）以及一个 docx-combi 表（参见表 1）。
j.创建Excel文件：默认的表格类型是.xlsx，所以不需要指定：

rs_exporttable（结果，文件名=“卵巢癌”）

在本例中，将创建三个 .xlsx 文件，每个数据集一个文件。
k.创建 docx-combi 类型表可以通过设置 tabletype 参数来完成：

rs_exporttable（结果，文件名=“卵巢癌”，表类型=“docx-combi”）

E.运行单独的算法

可以单独获得每个算法的稳定性值。在这种情况下，数据集必须单独传递：

rs_genorm(输入数据$等离子体)
rs_normfinder(inputData$Plasma)
rs_deltact(输入数据$等离子)
rs_bestkeeper（输入数据$等离子）

F.Normfinder未分组和分组稳定性分析以及配对候选稳定性

由于建议使用多个参考基因，因此可能需要识别组合最稳定的一对靶标。如果选择了一组参考目标，则可以通过Normfinder算法粗略地验证它们，该算法能够提供进一步的稳定性统计数据以及对组间和基因对之间的稳定性的评估。这种方法有利于识别稳定对并比较选定的参考。
在以下示例中，我们将使用 Normfinder 算法快速检查之前为新鲜冷冻和 FFPE 组织选择的选定参考。
1.对新鲜冷冻和 FFPE 数据集执行单独的 Normfinder 分析。

a.rs_normfinderFull(inputData$Fresh_Frozen, 组 = FALSE)

给出输出：

$已订购
组SD
hsa-miR-23a-3p0.512
hsa-miR-30c-5p0.607
hsa-miR-191-5p0.668
hsa-miR-103a-3p0.830
hsa-miR-451a1.075

$PairOfGenes
基因1基因2组SD
1hsa-miR-30c-5phsa-miR-23a-3p0.424

该输出表明，对于新鲜冷冻样品，hsa-miR-30c-5p 和 hsa-miR-23a-3p 的组合是最稳定的对。这与之前的结果一致，之前的结果显示 hsa-miR-23a-3p 和 hsa-miR-30c-3p 是两个最稳定的靶标。

b.rs_normfinderFull(inputData$FFPE, 组 = FALSE)

给出输出：

$已订购
组SD
hsa-miR-30c-5p0.344
hsa-miR-23a-3p0.493
hsa-miR-191-5p0.513
hsa-miR-103a-3p1.179
hsa-miR-451a1.857

此输出表明，对于 FFPE 样品，hsa-miR-30c-5p 和 hsa-miR-23a-3p 最稳定。这与之前的 Normfinder 结果一致。
注意：由于没有显示 PairOfGenes，因此在配对分析的第一轮计算中，没有候选者被评估为足够稳定。该阈值默认设置为 0.25；但是，它可以通过 pStabLim 参数进行设置。
如果要评估两种样品类型之间的差异表达，例如在治疗之前或之后，可能会感兴趣的是找到组合起来显示两种样品类型之间高稳定性的目标参考。在这里，我们将使用 Normfinder 分组分析来识别稳定的参考候选对，以比较新鲜冷冻和 FFPE 组织的表达。
2.对新鲜冷冻和 FFPE 数据集执行完整的 Normfinder 分组分析。
a.首先，我们需要创建一个分组数据集。

freshFrozen <- inputData$Fresh_Frozen
新鲜冷冻$组 <- 1

FFPE <- 输入数据$FFPE
FFPE$组 <- 2
分组 <- rbind(freshFrozen, FFPE)

b.现在，进行分析：

rs_normfinderFull(分组, 组 = TRUE)$ 基因对

注意：这里，我们只选择要打印的 PairOfGenes 表。

给出输出：
基因1基因2稳定
1hsa-miR-30c-5phsa-miR-103a-3p0.128
2hsa-miR-30c-5phsa-miR-191-5p0.086
3hsa-miR-30c-5phsa-miR-23a-3p0.079
4hsa-miR-103a-3phsa-miR-191-5p0.133
5hsa-miR-103a-3phsa-miR-23a-3p0.127
6hsa-miR-191-5phsa-miR-23a-3p0.088

根据 Normfinder 分组分析，hsa-miR-30c-5p 和 hsa-miR-191-5p 被认为是两组中最稳定的对。

数据分析

结论
在此协议中，我们展示了如何使用广泛使用的算法执行稳定性分析：geNorm、Normfinder、delta-Ct、BestKeeper 和 RefFinder（通过 R 的 RefSeeker 包）。该协议通过其分步指南和允许非 R 程序员执行稳定性分析。它可用于识别任何类型的表达分析中的稳定参考，并为准备发布的图形和表格的数据导出提供了很好的选择。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
洛帕辛斯卡-约根森等人。（2023）。数据标准化和缺失数据插补的策略以及上皮性卵巢癌潜在诊断性 microRNA 生物标志物的后果。 PLoS One（表 3、表 5 和表 S3）。

致谢

我们感谢道格拉斯·维尼修斯·奥利维拉的宝贵讨论。此外，我们感谢 Rasmus Adalbert Meldgaard 对该软件包进行了早期测试。我们感谢丹麦癌症生物银行（丹麦生物和基因组银行）和丹麦妇科癌症数据库提供可供本研究使用的标本和数据。这项工作的发起人：The Mermaid Foundation，网址：http: //www.mermaidprojektet.dk/ （PHDP、JLJ、CKH 和 EVH 获得资助）、丹麦癌症研究基金会：网址：http://www.dansk -kraeftforsknings-fond.dk/（EVH收到了资金），以及 Herlev 医院研究委员会，URL： https: //www.herlevhospital.dk/forskning/ （EVH 收到了资金）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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补充资料

在此处下载以下支持信息：
1.文件S1。 rs_refinder 结果输出示例