材料与试剂

生物材料

TRVb-1 细胞，一种缺乏内源转铁蛋白受体并稳定表达人转铁蛋白受体的 CHO 细胞系（McGraw 等，1987）。任何易于转染的细胞系都可以替代 CHO 细胞

材料

质粒 pDS-YFP-HA-Orai1 编码双重标记的 Orai1，在 N 末端带有 YFP，并在第二个胞外环中插入 HA 标记（参见Hodeify等人，2015）
碳酸氢盐缓冲的 Ham's F-12 培养基（Invitrogen，目录号：11765054）
Cy3-和Cy5-缀合的抗小鼠二抗（Invitrogen，目录号：A10521和A10524）
纯化的单克隆抗 HA.11 表位标签抗体（Covance，目录号：MMS-101P）
聚-D-赖氨酸涂层玻璃底板（MatTek Corporation，目录号：P35GC-1.5-14-C）
Lipofectamine 2000（Invitrogen，目录号：11668019）
Gibco TM Opti-MEM TM I 减少血清培养基，500 mL（ Thermo Fisher Scientific，目录号：31985047）
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma，目录号：D8537-500ML）
青霉素-链霉素（GIBCO REF，目录号：15140122）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：16005-1KG-R）
Triton X-100（Sigma，目录号：T8787-50ML）
10% 热灭活 FBS（Sigma ，目录号：F4135-500ML）
Falcon TM 15 mL 锥形离心管，聚丙烯
Falcon TM锥形离心管，15 mL（Corning，目录号：352095）
微量离心管，1.5 mL（Sigma-Aldrich，目录号：HS4323）
250 mL 玻璃锥形烧瓶（VWR，目录号：89000-362-250ML）

解决方案

多聚甲醛，4% PBS 溶液（参见配方）
含有 0.1% (w/v) Triton X-100 的 PBS（参见配方）

食谱

多聚甲醛，4% 的 PBS 溶液
将 80 mL 的 1× PBS 添加到带有干净磁力搅拌棒的 250 mL 玻璃锥形烧瓶中。
在搅拌下将溶液加热至约60℃并添加4g PFA粉末（粉末不会立即溶解）。
滴加 1 N NaOH 缓慢提高 pH 值，直至溶液澄清。
从火上移开并冷却至室温 (RT)。
用 1× PBS 将体积调整至 100 mL。
通过含水滤纸过滤以除去不溶解的颗粒。

含有 0.1% (w/v) Triton X-100 的 PBS
将 5 μL Triton X-100 添加到 50 mL 的 1× PBS 中。

设备

Leica SP 倒置共焦成像显微镜（Leica； Lasertechnik ；S/N：5100001464）
带加热板的磁力搅拌器（IKA 磁力搅拌器 RCT basic，货号：0025006052）
细胞培养箱型号：Sanyo MIR-262 实验室培养箱 153 L 容量，带两个搁板 S/N：08020051（Sanyo）

软件

ImageJ软件（ http://imagej.net/mbf/ ）
Adobe Photoshop CS3
起源（v 2019b）

程序

胞吞作用测定方案

PM处标记整个 Orai1 池（图 1）。当 Orai1 在质膜上循环时，HA 相关的 Orai1 将通过内吞作用被内化，从而标记细胞内池。随着时间的推移，人们可以通过与 Cy5 二级抗体一起孵育来标记PM Orai1 池。随后对细胞进行透化处理并与 Cy3 一起孵育以标记细胞内 Orai1。拟合细胞内 (Cy3) 与表面 (Cy5) Orai1 比率的时间过程来量化内吞速率。

图 1. 内吞作用测定的概要。将表达 YFP-HA-Orai1 的 CHO 细胞与单克隆抗 HA 抗体一起孵育不同的时间。将细胞固定并用 Cy5 缀合的抗小鼠 IgG 染色，然后再次洗涤并固定、透化并用 Cy3 缀合的抗小鼠 IgG 染色。然后使用定量荧光显微镜测量 Cy5 和 Cy3 强度。

细胞制备和转染（图2）

图 2. 细胞制备和 YFP-HA-Orai1 DNA 转染的流程图

细胞生长于 37 °C 和 5% CO 2 ，碳酸氢盐缓冲的 Ham's F-12 培养基，补充有 10% 热灭活的 FBS 和 5% (v/v) 的含有青霉素和链霉素的储备溶液。对于瞬时转染，将 300,000 个细胞接种在聚 D-赖氨酸包被的玻璃底板上 18 – 20 小时至 50% – 60% 汇合，以便在第二天开始实验。
对于每个玻璃底板的转染，按如下方式制备转染混合物：
在两个单独的 Eppendorf 管中，添加 50 μL Opti-MEM TM I 低血清培养基。
将 1.5 μg pDS-YFP-HA-Orai1 质粒 DNA 添加到一个管中，将 2 μL Lipofectamine 2000添加到另一管中，并轻轻涡旋。
室温孵育 5 分钟。
将两种混合物合并在一根管中，轻轻混合，并在室温下孵育 20 分钟。
等待期间，从板中取出培养基并用 500 μL Opti-MEM TM清洗。
孵育 20 分钟后，向每种混合物中添加 300 μL Opti-MEM TM并添加到细胞中。在 37°C 下孵育 18 – 20 小时。
过夜孵育后，用正常培养基替换转染混合物，并再孵育细胞 18 – 20 小时。

标记和成像（图 1）

从转染细胞中取出培养基，并与 400 μL单克隆抗 HA.11 表位标签抗体（在 1× PBS 中按 1:100 稀释）在 37 °C 下孵育。
在不同的时间点（2、4、6、10 和 20 分钟），除去含有 HA 抗体的 PBS，并立即在 500 μL 4% PFA 中在 RT 中固定细胞 10 分钟。
然后，除去 PFA 并用 1 mL 的 PBS 清洗细胞两次。
注意：如果需要断点，可以向细胞中添加几滴 PBS，将细胞保持在室温下进行染色。
用 Cy5 缀合的抗小鼠二抗（1:400 稀释于含 5% FBS 的 1× PBS 中）在 37°C 下将细胞染色 30 分钟。
μL 4% PFA 在 RT下重新固定10 分钟，然后用 1 mL PBS 清洗。
使用 1 mL 的 1× PBS 和 0.1% Triton 在 RT 下透化细胞 10 分钟。
用 1 mL PBS 清洗细胞，然后用 Cy3 缀合的抗小鼠二抗（1:400 稀释）在 37°C 染色 30 分钟，然后用 1 mL PBS 清洗两次。
笔记：
在用二抗标记期间和之后，用铝箔覆盖板以尽量减少光暴露。
如果需要断点，可向细胞中添加几滴 PBS，并用铝箔覆盖以减少光照。
使用定量荧光显微镜测量 Cy3 和 Cy5 的荧光强度。成像参数如下：对于YFP， λex = 514， λem = 516–545；对于 Cy3， λex = 561， λem = 566–622；对于 Cy5， λex = 633， λem = 648–703。 Cy5 信号显示表面 Orai1，而 Cy3 信号测量与抗 HA 抗体结合的细胞内 Orai1 库随时间的积累。
(Cy3/YFP)内部/(Cy5/YFP)表面比率随时间变化绘制并用线性回归函数拟合。

影像学

使用配备有 63×1.4 NA 油透镜的 Leica SP 倒置共焦成像显微镜，使用定量荧光显微镜测量 Cy3 和 Cy5 的荧光强度。在检测的早期时间点，表面 Orai1 的 Cy5 标记很明显，细胞内的 Orai1 逐渐变为 Cy3 阳性（图 3）。

图 3. 表达 YFP-HA-Orai1 并饲喂抗 HA 抗体的 CHO 细胞的代表性图像。显示 YFP 分布的细胞，并使用抗 HA 抗体和 Cy5 和 Cy3 偶联的二抗对表面和内部 Orai1 进行染色。表面染色（Cy5 信号）由箭头表示，内部染色（Cy3）由箭头表示。比例尺，5 μm 。

数据分析

使用 ImageJ 软件在单细胞水平上分析 YFP、Cy5 和 Cy3 的荧光。未转染的细胞（无 YFP 表达）用于背景校正。在单独选择细胞（椭圆形选择工具）后，使用 ImageJ 测量强度工具确定单细胞水平的 YFP、Cy3 和 Cy5 信号。测量 Cy3 和 YFP 通道的强度以进行比率计算。类似地，确定了单细胞水平上 Cy5 与 YFP 荧光的比率。不表达 YFP-HA-Orai1 的未标记细胞用于背景校正。与表面 YFP-HA-Orai1 结合的 HA 用 Cy5 缀合的抗小鼠 IgG 标记。 Cy5 标记后，用与 Cy3 缀合的抗小鼠 IgG 进行染色。使用Cy5-抗小鼠 IgG 的初始染色会阻断所有 PM HA 表位，从而将 Cy3 标记限制在 YFP-HA-Orai1 上的内部 HA 表位上。 (Cy3/YFP)内部/(Cy5/YFP)表面比率随时间绘制，并用线性回归函数拟合以产生一条直线，其斜率与 Orai1 内吞率成正比，但不相等，因为两种不同的使用荧光团（图 4）。内吞速率常数可以根据表面和内部 Orai1 的水平以及胞吐速率常数使用以下方程计算：

Orai1表面× 剑道 = Orai1内部× Kex

这些方法已在 Machaca 实验室中通过 CHO 细胞和 HEK293 细胞验证了 Orai1 回收动力学的表征（ Hodeify等人，2015）。 McGraw 实验室使用类似的方法成功表征了 GLUT4 转运蛋白内吞作用（ Karylowski等，2004；Blot 和 McGraw，2008）。

图 4. 抗 HA 结合的 Orai1 的细胞内累积量以内部 (Cy3/YFP) 表面 (Cy5/YFP) Orai1 与时间的关系进行测量。数据通过线性回归拟合。直线的斜率与内吞率成正比。

胞吐作用测定方案

为了量化 Orai1 胞吐率，将细胞与过量的抗 HA Ab 孵育不同时间，以使 HA 标记的 Orai1 分子内化，并使细胞内的 Orai1 到达PM 。最初，抗 HA 抗体将在 PM 处与 YFP-HA-Orai1 结合，并且随着更多细胞内 Orai1 易位到表面，结合会随着时间的推移逐渐增加。当新的 Orai1 分子通过回收到达PM时，它们将被 HA Ab 标记，直到整个回收的 Orai1 池被标记。随着时间的推移量化细胞相关抗 HA 的量可以量化 Orai1 胞吐率。

细胞制备和转染

如上文内吞作用测定中所述，用 YFP-HA-Orai1 制备并转染细胞。

标记和成像（图 5）

图 5. 胞吐作用测定的概要。将表达 YFP-HA-Orai1 的 CHO 细胞与单克隆抗 HA 抗体一起孵育不同的时间。将细胞固定、透化并用 Cy5 缀合的抗小鼠 IgG 染色。使用定量荧光显微镜测量 YFP 和 Cy5 强度。

从转染细胞中除去培养基，并与单克隆抗 HA.11 抗体（在 1× PBS 中按 1:100 稀释）在 37 °C 下孵育。
在不同的时间点（2、5、15、30 和 45 分钟），取出含有 HA 抗体的 1× PBS，并立即在 4% PFA 中于 RT 中固定细胞 10 分钟。
除去 PFA，用 1× PBS 清洗细胞，然后使用 0.1% Triton 在 RT 下透化 10 分钟。
用 1× PBS 清洗细胞，然后用 Cy5 缀合的抗小鼠二抗（1:400 稀释）在 37°C 染色 30 分钟。
使用定量荧光显微镜测量 YFP 和 Cy5 的荧光强度。

绘制 Cy5/YFP 比率随时间的变化曲线并拟合单指数增长曲线

数据分析

使用 ImageJ 软件在单细胞水平上分析 YFP 和 Cy5 的荧光。为了校正背景，使用未转染的细胞（无 YFP 表达）进行背景校正。计算Cy5/YFP荧光的比率。 Cy5/YFP 比率随时间变化绘制并拟合单指数增长曲线（图 6）。该比率随着时间的推移而增加，直到达到稳定水平，此时 YFP-HA-Orai1 的总池已对 PM 进行采样并附着在抗 HA 抗体上。胞吐速率常数可以使用以下方程确定：

〖(Cy5/YFP)t=A-Be〗^(-(Kex)t)

其中A是最大摄取平台， B是信号幅度， t是时间， K ex 是胞吐速率常数。 (Cy5/YFP) t是抗 HA 单克隆抗体结合的 YFP-HA-Orai1 的分数。

图 6. 胞吐作用测定的代表性图像。 A. 将用抗 HA 抗体喂养不同时间段的细胞进行固定、透化并用 Cy5 抗小鼠 IgG 染色。比例尺，5 μm 。 B.绘制Cy5/YFP比率并用单指数生长曲线拟合。

表面/总比测定方案

细胞制备和转染

按照上述胞吞作用和胞吐作用测定中的说明，用 YFP-HA-Orai1 制备并转染细胞。

标记和成像

从转染细胞中除去培养基，用 1× PBS 洗涤一次，并立即用 4% PFA 在 RT 下固定 10 分钟。
同时，检测类似细胞中的内部 Orai1，用 4% PFA 在 RT 下固定 10 分钟，用 1× PBS 清洗，然后使用 0.1% Triton 在 RT 下透化 10 分钟。
用 1× PBS 清洗非透化和透化细胞，然后与饱和浓度 (1:300) 的单克隆抗 HA 抗体一起在 37 °C 下孵育 45 分钟。用 1× PBS 清洗细胞，然后用 Cy5 缀合的抗小鼠二抗（1:400 稀释）在 37°C 染色 30 分钟。
使用定量荧光显微镜测量 YFP 和 Cy5 的荧光强度。
通过将非透化细胞的 Cy5/YFP 除以透化细胞的 Cy5/YFP 值来确定表面 Orai1。

计算Kexo和 Kendo

Kexo和 Kendo的示例，我们使用了图 4 和图 6 中所示的数据。
图 6 中的胞吐数据显示了 Cy5/YFP 的时间进程，使用以下公式将其拟合为单指数曲线：
〖(Cy5/YFP)t=A-Be〗^(-(Kex)t)

最大吸收平台A = 0.7969，
初始值Y0=0.07393，
信号幅度，B = 平台 – Y0 = 0.7895。
使用这些 Kex 值求解方程得出 0.048 ± 0.006 min -1
使用上述表面与总比协议，我们还计算出总 Orai1 的 45%在稳定状态下位于表面。这提供了0.45 的相对 Orai1 表面和 0.55 的内部。使用胞吐作用测定中计算出的 Kex 和该值，我们可以使用以下公式计算 Kendo：

Orai1表面× 剑道 = Orai1内部× Kex

所以，剑道 = 0.05866/分钟。

一般注意事项和故障排除

该方案可适用于任何可转染的细胞系。一种限制是由于瞬时转染后目标蛋白的非同质表达，这可能导致内源运输机制的过度表达和饱和。为了评估这种可能性，可以使用荧光标签（在本例中为 YFP）评估目标蛋白的表面/总比作为总表达的量度。如果贩运机制未饱和，表面/总比率应在广泛的表达范围内保持稳定。或者，可以生成表达低水平标记蛋白的稳定细胞系（参见Hodeify等人，2015）。
制备 PFA 时应采取预防措施，因为它会刺激眼睛、呼吸系统和皮肤。穿戴适当的个人防护装备，并在经过认证的化学通风柜中制备溶液。

致谢

这项工作得到了卡塔尔国家研究基金向 KM 提供的 NPRP 9-767-3-208 拨款以及卡塔尔威尔康奈尔医学院生物医学研究项目（该项目由卡塔尔基金会资助）的支持。
该协议源自Hodeify等人的原创作品。（2018）。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突。

参考

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