背景

环状 RNA ( circRNA ) 是一类有趣的非编码 RNA，它是通过称为反向剪接的独特机制形成的，其中5 '和 3 '末端共价连接（Jeck 和 Sharpless，2014）。由于环状结构中缺乏游离末端， circRNA可以很容易地逃脱多种细胞核酸外切酶的水解。 CircRNA可以源自外显子、内含子或两者，长度差异很大。新的证据表明， circRNA通过充当 miRNA 海绵、RNA 结合蛋白海绵、转录调节因子、mRNA 陷阱、细胞蛋白组装和运输调节因子以及翻译模板，参与许多不同的生物过程和人类疾病。
已经开发了几种计算方法，例如 CIRI2、CIRCexplorer2 和find_circ ，通过采用基于比对的策略来识别circRNA ，以识别反向剪接连接 (BSJ)，这是circRNA的独特特征（Szabo 和 Salzman，2016；蔡等人，2020）。确认circRNA的存在已确定在计算机上，应用实验方法来验证计算预测的circRNA （Zhang 等人，2016）。
逆转录 PCR (RT-PCR) 通常用于验证使用不同引物的 RNA 测序鉴定的circRNA 。在这种方法中， circRNA通过逆转录 (RT) 在随机六聚体或基因特异性反向引物的存在下转化为 cDNA。使用随机六聚体引发通过确保所有 RNA 序列的 RT 提供了灵活性，但基因特异性 RT 通过将感兴趣的靶标（而不是转录混合物中的所有 RNA）转换为 cDNA，增强了检测感兴趣靶标的灵敏度。用基因特异性引物引发可以增强感兴趣的circRNA的检测，特别是对于低丰度的 circRNA （Bustin 和 Nolan，2004）。
使用线性基因组作为引物设计的模板时，使用会聚引物的传统 RT-PCR 测定无法区分circRNA与其线性转录本。 RT-PCR 需要不同的引物，因为它们可以直接检测 BSJ 和定量circRNA 。发散引物是一对向外的引物，可扩增circRNA和非线性 mRNA，其序列与 cDNA 而非 gDNA 相同（图 1）。通常对用不同引物扩增的 PCR 产物进行 Sanger 测序，以确认 BSJ 的存在，从而排除任何不正确的扩增或伪影。定量 RT-PCR (RT-qPCR) 可用于相对定量一组样品中circRNA的表达。

图 1. 用于环状 RNA ( circRNA ) 检测的引物设计。发散引物是一对向外的引物，可以扩增circRNA 反向剪接连接 (BSJ)，而会聚引物是一对向内的引物，可以从制备的 cDNA 中扩增线性 mRNA。

将亚细胞分级分离和 RT-qPCR 与不同引物相结合可能会为circRNA 的生物学功能提供一些提示。例如，主要存在于细胞质中的circRNA更有可能参与转录后基因调控，而核保留的circRNA预计将在转录调控中发挥作用。目前可用的方案主要用于蛋白质工作，描述了亚细胞分级分离和蛋白质印迹分析的步骤，这并不完全适合RNA工作。相反，该协议允许通过 RT-qPCR 使用不同的引物对circRNA进行下游检测。还将包括生成特定circRNA富集 cDNA 的详细方案，以更好地检测低丰度circRNA 。

材料与试剂

生物材料

GM12878细胞系

试剂

杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Fisher Scientific，目录号：BP399-1）
胰蛋白酶-EDTA溶液（0.5％）（Gibco，目录号：15400054）
组织培养基：Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基（Gibco，目录号：11875093）
胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10270106）
青霉素-链霉素（Gibco，目录号：15140122）
台盼蓝（Alfa Aesar ，目录号：A1860）
Tris-Base（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
氯化钾（ KCl ）（Fisher Scientific，目录号：BP366-1）
氯化镁（MgCl 2 ）（Fisher Scientific，目录号：BP214-500）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
NP-40（Sigma-Aldrich，目录号：9016-45-9）
核糖核苷氧钒复合物（NEB，目录号：S1402S）
乙酸钠（Fisher Scientific，目录号：BP333-500）
分子级乙醇（Merck，目录号：64-17-5）
TRIzol （Life Technologies，目录号：15-596-018）
氯仿：异戊醇（1：24）（Fisher Scientific，目录号：BP1752I-400）
分子级异丙醇（Fisher Scientific，目录号：BP2618-1）
无 RNase 水（ Macherey Nigel，目录号：740378）
10× M- MuLV RT 缓冲器（NEB，目录号：#M0253）
DNase I（NEB，目录号：#M0303）
M- MuLV逆转录酶（NEB，目录号：#M0253）
RNase 抑制剂（NEB，目录号：#M0314）
dNTP 混合物（ Thermo Scientific，目录号：R0192）
随机六聚体（Invitrogen，目录号：N8080127）
底漆（IDT，产地：美国）
SYBR Fast qPCR Master Mix（KAPA Biosystem，目录号：KK4602）

解决方案

GM12878 细胞系的完整培养基（参见配方）
低渗缓冲液（参见食谱）
RNA 沉淀溶液 (RPS)（参见配方）

食谱

GM12878 细胞系的完整培养基
试剂库存集中度最终浓度体积（毫升）
RPMI 介质第395章
胎牛血清100%20%100
青霉素-链霉素10 , 000 单位/毫升100单位/毫升5
全部的500

低渗缓冲液
试剂库存集中度最终浓度体积（ μL ）
三羟甲基氨基甲烷 (pH 7.5)100毫米10毫米500
氯化钾100毫米10毫米500
氯化镁2150毫米1.5毫米50
数码地面电视100毫米0.5毫米25
NP-4010%0.075%37.5
核糖核苷氧钒复合物200毫米2毫米50
水分子_3837.5
全部的5,000

RNA沉淀溶液（RPS）
试剂库存集中度最终浓度体积（毫升）
乙酸钠 (pH 5.5)3M150毫米0.5
乙醇99.5%9.5
全部的10
每种组分的最终浓度为 0.15 M 乙酸钠 (pH 5.5) 的乙醇溶液。
保存在-20°C 下。

设备

冷冻台式离心机（ 15 或 50 mL锥形管适配器）（ Thermo Scientific，型号： Multifuge X1R）
冷冻台式离心机（1.5 mL 管转子）（艾本德，型号：5424R）
光学显微镜（奥林巴斯，产地：美国）
涡旋仪（ Biosan ，型号：V-1 plus）
微量移液器（Gilson，产地：美国）
NanoDrop 2000c 紫外可见分光光度计（ Thermo Scientific，产地：美国）
Applied Biosystems Veriti Dx 96 孔热循环仪 PCR Thermocycler（Applied Biosystem，产地：美国）
Bio-Rad Connect 实时 PCR 系统（Bio-Rad，产地：美国）

程序

亚细胞分离

从培养板中收获细胞
将细胞培养至约 80% 的汇合度。用 1× PBS 冲洗细胞。
对于贴壁细胞，用胰蛋白酶-EDTA 分离细胞。对于悬浮细胞，继续步骤 A1d。
添加等体积的完全培养基以停止胰蛋白酶的蛋白水解。
将细胞悬液收集在锥形管中，并以 200× g离心5 分钟。
去除上清液并用 1× PBS 重悬细胞沉淀。
进行细胞计数并将 1 × 10 6 个细胞等分到 1.5 mL 微量离心管中。
将管以 200× g离心 5 分钟，除去上清液。
在进行下一步之前，将细胞沉淀置于冰上。
从细胞的细胞质和核部分分离 RNA
用 100 μL冰冷的低渗缓冲液轻轻重悬细胞沉淀，并在冰上孵育 5 分钟。
注意：低渗缓冲液的体积可以根据细胞沉淀的大小进行调整。
用台盼蓝检查膜裂解情况。在 4°C 下以 500× g离心10 分钟，直至 > 90% 的细胞裂解。否则，增加步骤 A 2a的孵育时间，直至 > 90% 的细胞裂解。
注意：不要过度溶解细胞。
收集上清液（细胞质部分）并用 300 μL冰冷的低渗缓冲液洗涤沉淀（细胞核部分） 3 次，并在 4°C 下以 500× g离心5 分钟。
将 1 mL 的 RPS 添加到细胞质分数中，并在 -20°C 下孵育至少 1 小时。
涡旋 RPS 中的细胞质部分并以 18,000× g离心 4°C 下15 分钟。
弃去上清液并用 70% (v/v) 冰冷乙醇冲洗沉淀。
将 1 mL TRIzol添加到半干核和细胞质沉淀中，然后添加 10 μL 0.5 M EDTA。
将两个级分在 65 °C 下加热，直至沉淀通过涡旋溶解。
将样品冷却至室温并添加 200 μL氯仿:异戊醇 (1:24)。
涡旋样品并在室温下以18,000× g离心 10 分钟。
将水性上清液转移至干净的微量离心管中。
添加等体积的异丙醇并在-20°C孵育至少1小时。
涡旋样品并在室温下以18,000× g离心 15 分钟。
用 70% (v/v) 乙醇清洗沉淀，并以 18,000× g离心5 分钟。
将沉淀风干 5-10 分钟。
将风干的 RNA 沉淀溶解在 30 μL无 RNase 水中。
NanoDrop 2000c 紫外-可见分光光度计定量 RNA 浓度和纯度。

cDNA合成

DNase I 处理分离的 RNA
在 PCR 管中准备用于 DNase I 处理的 RNA，如表 1 所示。
表 1. 用于 DNase I 处理的组分
成分库存集中度最终浓度体积（ μL ）
穆尔夫实时缓冲液10×1×1.4
脱氧核糖核酸酶I1U0.5
核糖核酸500–2,000 纳克X
水分子_充值至14

将管在热循环仪中于 37°C 孵育 30 分钟。
逆转录（RT）
准备 RT 反应，如表 2 所示。

表 2. 用于逆转录的组分
成分库存集中度最终浓度体积（ μL ）
随机六聚体底漆专用
穆尔夫实时缓冲液10×1×0.60.6
dNTP 混合物10毫米0.5毫米11
随机六聚体50毫米2.5毫米1-
反向引物10μM _0.5μM _-每个底漆 0.5
核糖核酸酶抑制剂2U0.50.5
逆转录酶10U0.50.5
水分子_2.4充值最多6个
小计66
DNAse I 处理过的 RNA1414
全部的2020

在热循环仪上进行 cDNA 转换，设置为 42°C 60 分钟，然后在 65°C 下热灭活 20 分钟。

笔记：
我。如果引物特异性 cDNA 转换需要超过四对引物组（针对线性 mRNA 和/或circRNA ），请制备 5 μM引物混合物，并将 1 μL 添加到RT 反应中。
二.如果目标circRNA BSJ的扩增较弱、不存在或非特异性，则可以从随机六聚体开始进行 cDNA 转换，然后切换到引物特异性 cDNA 转换。
三.随机六聚体生成的 cDNA 允许在任意时间扩增任何感兴趣的circRNA靶标，而引物特异性生成的 cDNA 只允许扩增计划的circRNA靶标，不允许扩增任何计划外的circRNA靶标。
四.生成circRNA特异性 cDNA时需要小心，因为 RT 反应中剩余未使用的反向引物可能会中断或参与 qPCR 过程，并导致线性 mRNA 发生不需要的扩增。

定量 PCR (qPCR)

准备 PCR 反应，如表 3 所示。

表 3.用于 SYBR Green RT-qPCR 的组分
成分库存集中度最终浓度体积（ μL ）
SYBR 快速 qPCR 预混液2×1×5
正向引物10μM _0.1μM _0.1
反向底漆10μM _0.1μM _0.1
6倍稀释的cDNA3
无RNase水1.8
全部的10

在实时热循环仪上执行 qPCR，循环参数为95°C 3 分钟，然后进行 40 个 95°C 2 秒和 60°C 20 秒的循环。
根据以下方程计算每个基因的相对表达量：

(a)Relative expression in cytoplasm=2^((〖Cq〗_cyto-〖Cq〗_nuc))/(RNA ratio)

(b)Relative expression in cytoplasm=2^((〖Cq〗_nuc-〖Cq〗_cyto))/(RNA ratio)

RNA比率是在相似体积的水中洗脱的细胞质RNA浓度与核RNA浓度的比率。使用公式(a)计算细胞质标记的基因表达，而使用公式(b)计算核标记的基因表达。

数据分析

代表性数据

使用 GM12878 细胞进行亚细胞分离，该细胞是含有 Epstein-Barr 病毒 (EBV) 的类淋巴母细胞系。使用NanoDrop 2000c测量每个级分的浓度和纯度（表 4）。细胞质RPL30和细胞核MALAT1转录物用作阳性对照，分别指示细胞质和细胞核部分的纯度。如图2所示， RPL30在细胞质中富集，而MALAT1在核部分富集，表明亚细胞分级分离成功进行。在这个代表性数据中，线性 EBV 潜伏膜蛋白 2 ( LMP-2 ) 转录物在细胞质和细胞核部分中均被发现。环状LMP-2_e5的亚细胞定位模式与线性LMP-2A和LMP-2B相似。
请注意，此处描述的协议需要实时 PCR 机来生成数据，这可能并非在所有实验室都可用。在这种情况下，可以进行传统的基于琼脂糖凝胶的 RT-PCR 以获得半定量结果。

表 4. 细胞质和细胞核组分的浓度和纯度
浓度（纳克/微升）260/280260/230
细胞质部分 11,2791.961.95
细胞质部分21,242 人1.931.74
核分数 1第566章1.760.71
核分数2430.31.871.46
1和2代表生物复制。

图 2. circ LMP-2_e5的亚细胞定位。 RT-qPCR分析显示LMP-2和circ LMP-2_e5定位于GM12878细胞的细胞核和细胞质中。数据标准化为 RNA 产量比，代表两次独立实验的平均值±SD。该结果发表在 Tan 等人的图 3C 中。（2021）。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
谭等人。（2021）。 LMP-2 基因中新型 Epstein-Barr 病毒编码的环状 RNA 的鉴定和表征。科学报告（图 3，C 组）。

致谢

这项工作得到了马来西亚高等教育部通过基础研究补助金计划 (FRGS/1/2017/SKK08/UM/02/11) 和马来亚大学高影响力研究补助金 (UM.C/625/1/HIR) 的资助/MOE/CHAN/02/07）。
Tan 等人描述并验证了该协议的原始研究论文。（2021）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Bustin SA 和 Nolan, T. (2004)。定量实时逆转录聚合酶链反应的陷阱。 J.Biomol 。 _技术。 15（3）：155 – 166。
蔡Z.、范Y.、张Z.、卢成.、朱Z.、蒋T.、单T.和彭Y. (2020)。 VirusCircBase：病毒环状 RNA 数据库。简报Bioinf 。 22（2）：2182-2190。
Gagnon, KT、Li, L.、Janowski, BA 和 Corey, DR (2014)。通过亚细胞分级和 Argonaute 加载分析人类细胞中的核 RNA 干扰。纳特。协议。 9（9）：2045-2060。
Jeck, WR 和 Sharpless, NE (2014)。检测和表征环状 RNA。纳特。生物技术。 32（5）：453-461。
萨博，L. 和萨尔兹曼，J. (2016)。检测环状 RNA：生物信息学和实验挑战。纳特。牧师神父。热内特. 17（11）：679-692。
Tan KE、Ng WL、Marinov GK、Yu KH、Tan LP、Liau ES、Goh SY、Yeo KS、Yip KY、Lo KW 等。（2021）。 LMP-2 基因中新型 Epstein-Barr 病毒编码的环状 RNA 的鉴定和表征。科学代表。 2021 年 7 月 13 日；11(1):14392。
张Y.、杨L.和陈LL(2016)。环状RNA的表征。见：Feng, Y. 和Zhang, L.（编辑）。长非编码 RNA （第 215-227 页）。分子生物学方法。哈马纳出版社，纽约。