材料与试剂

以下规定不包括 PCR 和下游程序（例如凝胶电泳）所需的消耗品和仪器。

生物材料

1.人类口腔粘膜（舌头或内颊/牙龈）的拭子/碎片样本
2.水果和蔬菜上生长的真菌菌丝体

试剂

1.任何便利店和制造商提供的家用商用蒸馏水（即蒸汽熨烫）（视供应情况而定）
2.无水乙醇，99.8%，用 IPA、MEK 和Bitrex pure（ Panreac / Applichem ，目录号：147194）或任何其他类似浓度（高纯度不是必需的）变性

解决方案

1.70% 乙醇（参见食谱）

食谱

1.70%乙醇
试剂最终浓度体积
乙醇（绝对）70%700毫升
水分子_30%300毫升
全部的不适用1,000 毫升

实验室用品

1.猎鹰形塑料管，50 mL（KIMA Vacutest ，目录号：KIMA-17102-50）
2.烧杯，1,000 mL（Hamed，目录号：303173）
3.聚丙烯浮动架，8 个位置（Flinn Scientific，目录号：FB1671）
4.巴斯德移液器，玻璃（Hamed，目录号：303107）
5.用于巴斯德移液器的橡胶球（ Isolab Laborgerate ，目录号：084-03-001）
6.移液器 P20，0 – 20 μL （Gilson PIPETMAN ® ，目录号：F123600）
7.移液器 P200，20 – 200 μL （Gilson PIPETMAN ® ，目录号：F123601）
8.移液器 P1000，200 – 1,000 mL（Gilson PIPETMAN ® ，目录号：F123602）
9.移液器吸头，0 – 200 μL （KIMA Vacutest ，目录号：KIMA-18260）
10.移液器吸头，1,000 μL （KIMA Vacutest ，目录号：KIMA-18172）
11.塑料微管，1.5 mL（ Pierce TM ，目录号：69715）
12.PCR 塑料微管，0.2 mL（ Thermo Scientific TM ，目录号：AB0620）
13.手术刀刀片（22 号一次性不锈钢；FEATHER，批号 03067430）或美工刀（例如 Q-Connect，目录号：233471）
14.架（50 个位置，用于 18 毫米直径微管）（ Fruugo ）
15.亲水棉（如药房包装）
16.塑料勺子（如任意便利店，10件装），勺子（如不锈钢18/0便利店），载玻片（76 毫米 × 26 mm，Knittel Glass，目录号：303157），或木质压舌板（一次性，Heine，目录号：508424）
17.塑料颗粒杵，蓝色聚丙烯，可高压灭菌（Sigma-Aldrich，目录号：Z359947-100EA）
18.棉花（任何药房/便利店）或纸巾/餐巾纸（任何便利店）

设备

1.野营燃气灶（例如 KEMPER，12.3厘米 × 12.3厘米 × 21.7 厘米，型号：06450208）或电厨房炉灶（例如，Severin，型号：3519368）
2.打火机（例如，KEMPER，型号：10422）

程序

A.样品采集（见一般说明1 ）和准备

1.如果拭子/组织收集器物品未经过消毒，请用 70% 酒精在棉布或纸巾/餐巾上擦拭，然后用打火机点燃。
2.让火焰熄灭并让它在空气中冷却。
3.样本采集；任何一个：
a用任何建议的或其他类似物体轻轻刮擦，从舌头上表面或脸颊内表面收集拭子（参见一般说明 2 ）；
b切下植物组织上生长的菌丝体一块（直径3 – 5 毫米）。或者，使用一次性无菌手术刀刀片或火焰灭菌手术刀、剃刀或美工刀，将其从动物组织中刮除，或从任何此类表面上刮除细菌或酵母生长物（参见一般说明 3）。
4.将样品储存在 1.5 mL 微量管中（参见故障排除 1）直到步骤B1。如果需要，请使用一些指导/帮助将其放入（请参阅一般说明 4）。
5.将自来水装满烧杯至一半容量；这将用作水浴。
6.用市售蒸馏水将 50 mL Falcon 管填充至一半容量，然后将其放入烧杯中。
7.将烧杯放在炉子（野营煤气或电炉）上以最大强度加热，直到水浴开始沸腾；然后，将强度降低一半，以在整个过程中保持水沸腾。

B.细胞裂解

1.将沸腾的热水加入提取管中
a.如果需要机械辅助裂解（由于样品的性质、数量或物理质量），请向样品中添加 250 μL滚热蒸馏水或您打算使用的体积的一半（精度并不特别重要）。含有步骤 A4 中的样品的提取微管（参见一般说明 5）。
b.如果不需要机械辅助，则添加沸水的提取体积的总和并直接进行步骤B4。注意：拧开螺丝后， S团队可能会从 Falcon 管中出来，并且管子可能很热。在触摸和处理过程中要采取预防措施，并将其安全地放置在相应的架子或任何类似的支撑物上（例如，小烧杯或玻璃）。
2.用杵或其他类似仪器螺旋运动压碎 2-3 分钟。
3.使用等体积的滚热蒸馏水（例如，250 μL ，如步骤 B1a 中建议的）清洗微管内杵的细胞碎片。
4.盖上微管的盖子，涡旋或用手剧烈摇动 1 分钟（参见一般说明 6）

C.孵化

1.根据提取体积和提取的严格程度，将微管放入沸水浴中 20 – 30 分钟或更长时间（参见一般说明 7；参见故障排除 2）。如果适用的话，使用孵育时间来准备分子测试反应（步骤 E1）。
2.完成后，小心打开微管，并从提取体积的中心吸取 10 μL至 PCR 微管。
注意：微管中会积聚蒸汽压力；因此，请小心操作并远离脸部。在打开和进一步处理之前，最好将其放置在定制或临时的架子上。

D.稀释液

1.10 μL中的5 μL转移至第一个稀释管中，与 45 μL蒸馏水轻轻吸移 5 – 10 次混合，以得到 1/10 稀释。整个过程使用 20 μL移液器。
2.将 5 μL 1/10 稀释液移至第二个 PCR 管（体积为 200 μL或按照标准实践使用）。
3.另取 5 µL 1/10 稀释液至第二个稀释管中，与 45 µL蒸馏水轻轻吹打 5 – 10 次，混匀，得到 1/100 稀释液。
4.将 5 μL 1/100 稀释液移至第三个 PCR 管中（参见一般说明 8）。

E.PCR扩增

1.制备主混合物，同时在水浴中孵育提取物并保持在冰上直至使用（参见一般说明 8）。此步骤应在步骤 C1 期间实施。
2.将所需体积的预混液分配到三个 PCR 管中，对每个样品进行系列稀释，然后按照标准程序/方案在热循环仪中进行扩增。该步骤应在步骤D4之后实施。

数据分析

每次提取均独立进行三次，连续两次提取之间的间隔不超过一周。产生扩增子的三种稀释度中的任何一种都被认为是成功的。在这里，我们报告，该方案可用于以下情况：三个独立提取工作中的至少两个在三个系列稀释液中的至少一个中产生扩增子（未稀释的粗提物被理解为三个稀释液系列中的第一个））。

协议验证

无法直接验证本方案的性能：它是一种提取方案，由于其产品未经纯化，因此无法通过分光光度法进行正确测试，因为细胞碎片会吸收或散射发射的紫外线，也无法通过分光光度法进行正确测试。通过凝胶电泳，如上所述，碎片会阻碍 DNA 的运动，破坏电场，还会吸收荧光染料，产生噪音和拖尾。唯一适用的验证方法是间接的，通过一些下游核酸扩增测试 ( NAAT)的成功或失败来进行。为了确保验证，使用仅在模板中添加等体积蒸馏水的阴性对照，以确保扩增子的产生不是由于 NAAT 试剂、消耗品或设备的污染。
此外，为了确保 NAAT（此处为 PCR）在方案、循环仪和试剂方面确实有效，使用了阳性对照。这些是通过其他既定方法（例如碱提取和/或 CTAB）半同步提取菌丝体组织（Velegraki 等人，1999a；Goudoudaki 等人，2021），以及实验室中保存的库存 DNA 提取物项目，使用传统协议提取，有时通过微型分光光度计进行量化（Psarias 等人，2020）。验证和控制的完整程序可以在源出版物中找到（Goudoudaki 等人，2023）。简而言之，从许多尝试的应用中，两种样本均返回了阳性 PCR 结果：(a) 通过针对局部细菌组的共有序列 PCR 测试的拭子样本（产物条带大小与预期目标范围兼容）或对于一个特定的内源性（人类）基因座（预期大小的产物带）； (b) 对冷藏水果表面生长的真菌菌丝体提取物进行共有序列 PCR（产物条带大小与预期目标范围一致）。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.该方法对于目标基因组丰富（高度富集）的相对较软且不复杂的样本是有效的。口腔拭子产生细菌的特定人类基因组扩增子和共有序列扩增产物，但不产生真菌，因为真菌在口腔粘膜中的数量要少得多。
2.可以使用显微镜载玻片、塑料或金属勺子（尤其是用于甜点的一次性勺子）或全金属餐具的手柄或压舌板。
3.在采样过程中，必须收集尽可能纯的靶细胞样本（“纯”被理解为“含有尽可能少的混合物和尽可能同质的细胞群”）。样品的数量必须受到限制，因为没有纯化步骤来处理细胞碎片以及随之而来的背景噪音和可能的抑制。
4.如果需要，使用类似灭菌的微生物针或类似部件（即第二个载玻片）或塑料尖端帮助/引导微管内的样品。
5.如果需要机械辅助，请注意样品 + 开水的体积约为 500 μL 。添加额外的沸水以洗去杵上附着的碎屑，但最终体积最好不超过 1 mL。
6.如果提取微管太满 (> 1 mL)，请在孵育前使用针、细钉子或大头针在微管盖上打孔，以免压力将盖子吹开，将内容物从管中抛出。
7.使用专用浮动架或对从包装盒中回收的厚度小于 50 毫米的felizol （EPC -发泡聚苯乙烯）片材进行打孔/切孔。
8.NAAT 期间的功能浓度可调整为其他值：通过i ) 增加反应管中的模板体积，同时从预混液中减去等体积的无菌蒸馏 H 2 O ，或 ii) 如果未制备预混液，则通过更改反应微管中的体积。有时，相反的情况也可能适用（减少模板体积，同时增加无菌蒸馏 H 2 O 的体积）。类似的操作适用于连续稀释步骤。

故障排除

1.如果微管内的样品量过大（操作员的呼叫，取决于正确处理提取混合物的难度，但请参阅一般注释 6的示例），它可能会被分成两部分。如果是实心的，可以用消毒的一次性手术刀片切割；如果是液体，则可以将多余的物质移至另一根管中，从而创建技术复制品。
2.(a) 当处理体积/质量较大的样品时，以及 (b) 如果细胞裂解阶段不那么严格，如在没有机械辅助的情况下，建议更长的孵育时间。请参阅步骤 C1。

致谢

该项目部分由欧盟委员会 Horizon 2020（H2020-668353；无处不在的药物基因组学）资助。
该协议基于研究论文（ Goudoudaki等人，2023）。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突或利益竞争。

道德考虑

该研究得到了帕特雷大学机构研究伦理委员会的批准。如论文中明确所述（Goudoudaki 等人，2023），从执行方案制定和后续分析的操作人员处收集拭子ADDIN CSL_CITATION {"citationItems":[{"id":"ITEM-1","itemData":{"DOI":"10.1089/OMI.2022.0168","ISSN":"1557-8100","PMID":"36809194","abstract":"The coronavirus disease-2019 (COVID-19) pandemic has raised the stakes for planetary health diagnostics. Because pandemics pose enormous burdens on biosurveillance and diagnostics, reduction of the logistical burdens of pandemics and ecological crises is essential. Moreover, the disruptive effects of catastrophic bioevents impact the supply chains in both highly populated urban centers and rural communities. One \"upstream\" focus of methodological innovation in biosurveillance is the footprint of Nucleic Acid Amplification Test (NAAT)-based assays. We report in this study a water-only DNA extraction, as an initial step in developing future protocols that may require few expendables, and with low environmental footprints, in terms of wet and solid laboratory waste. In the present work, boiling-hot distilled water was used as the main cell lysis agent for direct polymerase chain reactions (PCRs) on crude extracts. After evaluation (1) in blood and mouth swabs for human biomarker genotyping, and (2) in mouth swabs and plant tissue for generic bacterial or fungal detection, and using different combinations of extraction volume, mechanical assistance, and extract dilution, we found the method to be applicable in low-complexity samples, but not in high-complexity ones such as blood and plant tissue. In conclusion, this study examined the doability of a lean approach for template extraction in the case of NAAT-based diagnostics. Testing our approach with different biosamples, PCR settings, and instruments, including portable ones for COVID-19 or dispersed applications, warrant further research. Minimal resources analysis is a concept and practice, vital and timely for biosurveillance, integrative biology, and planetary health in the 21st century.","author":[{"dropping-particle":"","family":"Goudoudaki","given":"Stavroula","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Kambouris","given":"Manousos E.","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Siamoglou","given":"Stavroula","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Gioula","given":"Georgia","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Kantzanou","given":"Maria","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Manoussopoulou","given":"Marianna","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Patrinos","given":"George P.","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Manoussopoulos","given":"Yiannis","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""}],"container-title":"Omics : a journal of integrative biology","id":"ITEM-1","issue":"3","issued":{"date-parts":[["2023","3","1"]]},"page":"116-126","publisher":"OMICS","title":"Can Water-Only DNA Extraction Reduce the Logistical Footprint of Biosurveillance and Planetary Health Diagnostics? Toward a New Method","type":"article-journal","volume":"27"},"uris":["http://www.mendeley.com/documents/?uuid=f3adb801-1205-3927-8289-29e531b8be9d"]}],"mendeley":{"formattedCitation":"(Goudoudaki et al., 2023)","plainTextFormattedCitation":"(Goudoudaki et al., 2023)","previouslyFormattedCitation":"(Goudoudaki et al., 2023)"},"properties":{"noteIndex":0},"schema":"https://github.com/citation-style-language/schema/raw/master/csl-citation.json"}。

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