材料与试剂

试剂

1.人TLR4的胞外结构域（残基1-631，70.5 kDa ）（Sino Biological，目录号：10146-H08B）
2.人RAGE的胞外结构域（残基1-344，36.0 kDa ）（Sino Biological，目录号：11629-H08H）
3.对应于携带 N 端6x His标签的各个组织蛋白酶L 的残基 17-333 的人pCTS -L 在大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS细胞中表达，并如前所述纯化(Zhu 等人，2023）。

解决方案

1.磷酸盐缓冲盐水（PBS），含有 10 mM Na 2 HPO 4 、10 mM NaH 2 PO 4 、140 mM NaCl 和 3 mM KCl ， pH 7.4（ Nicoya Lifesciences，Kitchener，目录号： NI-PBS）
2.HBS-T运行缓冲液含有 0.01 M HEPES、0.15 M NaCl 和 0.005% Tween-20，pH 7.4（ Nicoya Lifesciences，目录号：HBS-T）
3.使用NTA 试剂盒（ Nicoya Lifesciences，目录号：NTA-RK）制备NiCl 2溶液（40 mM，储存于 2 – 8 °C ）和咪唑溶液（200 mM，储存于 2 – 8 °C ）
4.通过 0.2 μm真空过滤瓶系统过滤的去离子水（Corning，目录号：431097）
5.80% 异丙醇（去离子水中的 v/v，由异丙醇制备）（Sigma-Aldrich，目录号：563935）

实验室用品

1.缓冲瓶（ Nicoya Lifesciences，目录号：BTL-SQ-250）
2.OpenSPR设备的标准供应中）
3.无绒湿巾（Fisher Scientific，目录号：S47299）
4.一次性注射器（ Nicoya Lifesciences，目录号：SYR-PL-50 ）
5.气密玻璃注射器（ Nicoya Lifesciences，目录号：SYR-G）
6.钝端注射头（ Nicoya Lifesciences，目录号：TIP-BLUNT-50）
7.OpenSPR 次氮基三乙酸 (NTA) 传感器芯片（ Nicoya Lifesciences，目录号：SEN-Au-100-10-NTA）
8.mM NiCl 2溶液和 200 mM 咪唑溶液的 NTA 试剂盒（ Nicoya Lifesciences，目录号：NTA-RK ）
9.丁腈或乳胶手套
10.Declogging Kit（Nicoya Lifesciences，目录号：DECLOG OpenSPR ）

设备

1.Nicoya Lifesciences 第一代基于金纳米颗粒的开放表面等离子共振 ( OpenSPR ) 1 通道仪器（ Kitchener，目录号： REV 3.0 ，图 1)。

图 1. OpenSPR 1 通道仪器和安装了 Nicoya Lifesciences 软件的笔记本电脑的照片

注意： OpenSPR由用户手动操作，使用带有实验数据接口的笔记本电脑，允许用户控制 OpenSPR 仪器的各个方面，例如更改运行缓冲液、流体流速以及样品注射。例如，当样品通过注射端口手动注射到样品环中时，用户需要将注射阀顺时针切换到注射位置，以开始将注射的样品从样品环输送到传感器。
2.安装了 Nicoya Lifesciences 软件（实验数据接口）的笔记本电脑，用于控制仪器和快速实时数据采集（图 1）。

软件和数据集

1.TraceDrawer动力学数据分析软件 V.1.6.1 (Nicoya Lifesciences)，用于动力学和亲和常数的数据处理和分析。

程序

1.根据OpenSPR手册中制造商的详细说明设置OpenSPR仪器和软件，其中包括使用 USB 电缆将OpenSPR仪器连接到计算机以及三个瓶子（用于缓冲液和废物）的流体设置。
2.打开电脑上的实验数据界面，点击开始，进行仪器的准备，方法如下：
a.OpenSPR的流体，方法是用指定的运行缓冲液（HBS-T，pH 7.4）以 150 μL /min的流速填充泵和管道2.5 分钟，以清除任何污染物或气泡测试前的流体管线。
b.在仪器中没有传感器芯片的情况下，采用新的光学参考光谱来计算传感器吸光度信号，然后加载新的传感器芯片以开始新的测试。
c.在开始测试之前加载新的 NTA 传感器芯片：
我。使用浸有 80% 异丙醇的无绒抹布清洁流通池表面，并使其完全风干，然后再安装新的传感器芯片。
二.用蒸馏水彻底冲洗传感器芯片并使其完全风干，以防止流通池中泄漏和形成气泡。
三.小心地将传感器芯片以正确的方向滑入传感器支架，然后将传感器支架放入仪器中，首先将其与流体模块对齐，然后慢慢使其接触。
3.通过以下方式准备测试：
a.将进样阀切换至加载位置并通过以下方式准备样品注射：
我。使用至少 1.0 mL 运行缓冲液（HBS-T，pH 7.4）缓慢冲洗进样口和样品环，以将任何先前的样品/溶液冲洗出样品环流体管线。
二.使用充满至少 1.0 mL 空气的同一缓冲液注射器吹扫样品环，将空气推入样品环，通过出口管线去除环中多余的缓冲液。
b.去除流体管线内的气泡。
我。将泵速设置为 150 μL /min，并将进样阀逆时针旋转至加载位置。
二.使用钝头注射器通过进样口将 300 μL 80% 异丙醇注入样品环，然后顺时针转动进样阀至进样位置，将异丙醇输送至传感器。
三.将注射阀逆时针旋转回加载位置。
4.根据说明将含有 6×His 标签的pCTS -L 配体固定到 NTA 传感器上。
a.表面调节：将泵速设置为 150 μL /mL，并使用一次性注射器将 200 μL咪唑溶液(200 mM)填充到100 μL样品环中，然后将注射阀转到注射位置以开始输送注射液将咪唑溶液从样品环注入传感器以清洁传感器表面。 5 分钟后，逆时针转动注射阀回到加载位置。
b.使用至少 1.0 mL 运行缓冲液（HBS-T，pH 7.4）冲洗进样口和样品环，并在下次进样前按照步骤 3a 中所述使用至少 1.0 mL 空气进行吹扫。
c.表面活化：将泵速设置为 20 μL /mL，并使用一次性注射器将 200 μL NiCl 2溶液(40 mM)填充到样品环中，然后将注射阀切换到注射位置以开始输送注射的NiCl 2将溶液从样品环注入传感器以激活 NTA 传感器表面。在整个激活时间内将进样阀保持在进样位置，直到获得稳定的基线，然后逆时针将进样阀转回到加载位置。
d.使用至少 1.0 mL 运行缓冲液（HBS-T，pH 7.4）冲洗进样口和样品环，并使用至少 1.0 mL 空气吹扫，如步骤 3a 中所述。
e.从 HBS-T 切换运行缓冲液至 1× PBS：
我。单击实验数据界面泵菜单中的停止按钮可停止泵。
二.切换含有 HBS-T 的瓶子的入口管到含有 1× PBS (pH 7.4) 的瓶子中。
三.单击泵菜单中的启动按钮即可恢复泵。
f.将泵速设置为 20 μL /mL，并使用带有气密钝头尖端的一次性注射器 ( TIP-BLUNT-50)将在运行缓冲液 ( 1× PBS ，pH 7.4)中稀释的200 μL pCTS -L 溶液注入到最终浓度为50μg / mL 。快速顺时针转动注射阀至注射位置，开始将注射的pCTS -L 配体溶液从样品环输送至 NTA 传感器。在配体与传感器表面相互作用的整个持续时间内，将注射阀保持在注射位置。将pCTS -L配体固定到 NTA 传感器芯片上的代表性传感图如下所示（图 2）。

图 2. pCTS -L 配体固定的传感图

注意：对于大多数蛋白质配体，固定化的推荐配体浓度通常为 10 – 50 μg / mL。我们选择了更高浓度（50 μg /mL）的pCTS -L 配体，以确保其最大限度地固定到 NTA 传感器的大多数活性位点。固定在 NTA 传感器芯片上的配体量可以通过相应传感图中响应信号的后续增加来确定。一旦固定信号达到平台水平，它表明最大配体固定的状态。然而，用户可以再重复一次固定程序，以确保与额外的配体固定相对应的响应信号（即“净信号偏移”）不会进一步增加，因此大多数（如果不是全部）NTA开放位点被配体占据，以防止与含有暴露的组氨酸残基的分析物发生非特异性相互作用。

g.进样时，会出现“进样详细信息”框，供用户输入配体名称（ pCTS -L）以及浓度（50 μg /mL），用于数据分析中识别进样。
笔记：对于除气泡进样和分析物进样之外的所有进样，至少在样品与传感器表面相互作用的整个持续时间内将进样阀保持在进样位置。准备好执行下一次进样时，将进样阀转回加载位置，并用运行缓冲液冲洗进样口和样品环，并按照步骤 3a中所述用空气吹扫样品环。
5.一旦固定信号达到稳定水平，则表明处于最大配体固定状态。让仪器在运行缓冲液的情况下稳定下来，直到基线斜率 < 5 pM /min，这可能需要 5 分钟到 1 小时。
6.使用运行缓冲液（1× PBS，pH 7.4）冲洗进样口和样品环，并按照步骤 3a 中所述用空气吹扫。
7.在分析运行缓冲液（1× PBS，pH 7.4）中以 3 倍连续稀释（即 283.7 nM 、94.6 nM和 31.5 nM ）制备 TLR4 分析物溶液，并以一定流速注入至少 200 μL分析物溶液20 μL /min，按照浓度递增的顺序，结合时间为 240 秒，解离时间为 480 秒。
a.将 200 μL浓度为 31.5 nM的 TLR4 分析物溶液装入注射器，将其完全插入进样口，然后缓慢压下柱塞，将分析物引入仪器。从进样口取出注射器之前，等待至少 5 秒以稳定样品环中的注射器流体压力。
b.将注射阀顺时针旋转到注射位置，启动将注射的 TLR4 分析物溶液从样品环输送到 NTA 传感器，并等待 240 秒以确保配体和分析物之间的最大相互作用。
c.当注射剩余计数器达到 00:00:00 时，快速将注射阀转回加载位置，并等待 480 秒，以使配体和分析物之间最大程度地解离。
d.通过重复步骤 6 和 7 分别以94.6 nM和 283.7 nM继续注射下一轮 TLR4 分析物。
笔记：当进行注射时，将出现“注射详细信息”框，让用户输入分析物样品名称（例如，TLR4）以及浓度（例如，31.5 nM ），以便软件可以在后续数据分析中识别该注射。每次分析物进样前，必须用分析运行缓冲液（例如 1× PBS，pH 7.4）冲洗进样口和样品环并按照步骤 3a 中所述用空气吹扫，以防止注射之间的交叉污染。
8.要完成实验，请单击“完成”停止跟踪吸光度峰值并创建最终数据文件。
9.为了表征pCTS -L-RAGE 相互作用，加载新的 NTA 传感器芯片，并在分析运行缓冲液（1× PBS，pH 7.4）中以 3 倍连续稀释（即 250 nM ， 83.3 nM和 27.7 nM ）。分别以20 μL /min的流速向样品环注入200 μL RAGE分析物溶液，按照浓度递增的顺序，关联时间为 240 s，解离时间为 480 s，遵循步骤 2 中所述的类似程序–8。
10.数据分析：用户完成测试后，软件将创建多种类型的数据文件，这些文件将始终保存在 Documents\ OpenSPR \ TestResults \ 下，并以用户在测试开始时指定的名称保存。
a.打开TraceDrawer软件并单击添加运行以选择并导入保存的文件和相关曲线（即TLR4 或RAGE）进行分析。
b.新建叠加来创建叠加，然后左键单击并将运行拖动到叠加以在叠加窗口中执行数据修改。
c.在屏幕左侧，单击“新建评估”将“评估类型”设置为“动力学评估”。
d.定义数据中发生浓度变化的两个时间点，即关联阶段的开始和结束。
e.在显示具有所选时间点的行的动力学评估表中，定义每条曲线的浓度，然后按下一步。
f.在“拟合模型”下拉列表中，选择 OneToOne 模型以启动具有全局拟合的 1:1 扩散校正结合模型，然后按“拟合”。
g.有关TraceDrawer软件的更全面说明，请参阅手册。
注意：用户可以通过清除图表中的所有数据点并将 y 轴上建立新基线的实验中的响应跟踪标准化为零来将图表归零。例如，用户可以将图表归零，以便在配体固定步骤之后和注射分析物进行分析之前的任何阶段对后续注射进行相对比较。用户还可以打开高级设置，通过单击图形菜单中的齿轮（设置）按钮并在保存图形图像之前设置自定义轴来手动调整轴比例。
11.关机程序
如果用户近期不打算使用仪器，建议完全关闭仪器，然后用至少20 mL 去离子水和 20 mL 80% 异丙醇以最大速度（150 μL /min），然后用足够量的空气吹扫管线以干燥管线。有关其他冲洗程序和维护的信息，请参阅仪器手册。

数据分析

对于pCTS -L 与 TLR4 或 RAGE 相互作用的OpenSPR分析，将pCTS -L 作为配体固定在 NTA 传感器上，并以递增的浓度应用 TLR4 或 RAGE 作为分析物。信号响应的动态变化记录在传感图中，其中包括缓冲液响应的基线阶段、分析物通过固定配体的结合阶段以及缓冲液流恢复且结合的分析物被结合的解离阶段。从传感器表面移除（图 3 和 4）。

图 3. pCTS -L–TLR4 相互作用的传感图。 TLR4 以 31.5 nM 、94.6 nM和 283 nM的浓度递增注射，接触时间为 240 秒，并监测解离 480 秒。与原始数据拟合的 1:1 模型显示为黑色实线。

图 4. pCTS -L–RAGE 相互作用的传感图。 RAGE 以 27.7 nM 、83.3 nM和 250 nM的浓度递增注射，接触时间为240 秒，并监测解离 480 秒。与原始数据拟合的 1:1 模型显示为黑色实线。

在关联阶段，传感图显示运行缓冲液和分析物之间的吸光度峰值波长与分析物浓度成比例的动态变化，并且始终表现出某种类型的曲率作为指数增长的指标（图 3 和 4）。当传感图曲线趋于平稳时，表明缔合数等于解离数时处于平衡状态。然而，当以较高浓度注射分析物时，会达到新的平衡并具有较高的响应（图3和图4），直到所有配体结合位点都被占据，并达到最大响应。因此，注入分析物的浓度范围很重要，因为较高浓度的分析物往往会在传感图的上部产生曲线，而较低浓度会产生较低的响应和较小的曲率。建议以“平衡解离常数”（ K D ，即 0.1 × KD至10 × K D )，这将在具有低响应和高响应的传感图上均匀地间隔曲线。当分析物注射结束时，它将进入解离阶段，在此期间解离曲线遵循单指数下降（图3），但在强相互作用的情况下有时可以几乎水平（图4）。要分析缓慢解离，解离期应足够长，与初始响应相比，信号至少减少 5%。
OpenSPR实验可以重复多次以获得平均k on 、 k off和K D ，以提高可靠性和再现性。 pCTS -L 和 TLR4 或 RAGE之间动力学相互作用的代表性传感图分别如图 3 和图 4 所示。传感图曲线的总体形状由特定配体和分析物对之间的分析物浓度、结合速率 ( k on ) 和解离速率 ( k off ) 常数决定。在特定的配体-分析物对中，重复实验之间的传感图曲线的整体形状极其相似（图 3 和 4），表明OpenSPR技术在评估蛋白质-蛋白质相互作用的动力学和亲和力方面具有一定程度的再现性和可靠性。然而，在不同的配体-分析物对之间（图 3 与图 4），相应的传感图曲线的整体形状似乎明显不同，这表明即使在相同的实验条件下，与特定配体也存在明显的分析物特异性相互作用。使用单指数相互作用的 1:1 相互作用算法对传感图进行分析，得出每个代表性实验的估计k on 、 k off以及K D （图 3 和 4）。 TLR4 和 RAGE 分析物的解离率 ( k off ) 之间几乎 100 倍的差异可能是pCTS -L 分别与 TLR4（图 3）和 RAGE（图 4）相互作用的不同传感图曲线的基础。

协议验证

由于我们对Biacore设备的访问有限，我们没有对OpenSPR和Biacore与TLR4 或 RAGE 的pCTS -L 相互作用进行头对头比较。然而，我们确实使用Biacore和OpenSPR来并行测量两种不同相互作用物（人 dermcidin 和人 EGFR 胞外域）之间的KD ( Qiang 等人，2022）。对于传统的Biacore ，将 dermcidin作为配体固定在 CM5 芯片上，并使用Biacore T200 仪器（GE Healthcare）以五种不同浓度应用重组 EGFR。假定结合比为1:1，使用Biacore评估软件2.0测定KD 。对于 Nicoya OpenSPR ，带有 6× His 标签的重组 dermcidin同样作为配体固定在 NTA 传感器芯片上，并以三种不同浓度应用重组 EGFR，以使用Trace Drawer Kinetic Data Analysis v.1.6.1估计KD 。令人印象深刻的是， OpenSPR估计dermcidin-EGFR 相互作用的KD为 58.1 ± 29.6 nM （平均值 ± SEM，n = 3 个技术重复），这与使用传统Biacore SPR估计的KD值 (58.8 nM )几乎相同技术（强等人，2022）。这些发现验证了使用OpenSPR评估两种不同蛋白质之间的结合亲和力的可靠性。
当高度纯化的人pCTS -L 固定到 NTA 传感器芯片上并分别应用不同浓度的人 TLR4 或 RAGE 作为分析物时， OpenSPR显示pCTS -L 对 TLR4 和 RAGE具有相似的高亲和力，估计K D为 20.2 ±分别为3.5 nM和 3.5 ± 2.6 nM （朱等人，2023）。表 1总结了八个独立实验的计算K D以及平均值和平均值标准误差 (SEM)，这表明OpenSPR估计平均值K D的精度。当 SEM表示为估计平均值的一部分时，所得相对标准误差 (RSE) 相对较小 (< 20%)，特别是对于pCTS -L/TLR4 相互作用，验证了使用OpenSPR估计某些蛋白质的可靠性 -蛋白质结合亲和力。

表 1. pCTS -L 与 TLR4 或 RAGE 相互作用的八次OpenSPR实验的平均KD
实验
#PCTS - L /TLR4的 KD ( nM )PCTS -L/RAGE的KD ( nM )
124.12.89
220.62.66
324.90.59
419.70.0023
57.70.222
610.30.014
715.40.019
839.021.5
平均值±SEM20.2±3.53.5±2.6
相对标准误差 (RSE)17.3%

鉴于ClusPro蛋白对接中pCTS -L–TLR4 相互作用的 1:1 化学计量（朱 et al., 2023），我们使用 1:1 拟合模型进行数据分析。 1:1 结合模型与pCTS -L–TLR4 相互作用的相应数据（图 3）之间的完美拟合确实略微削弱了我们对根据 k关闭/ k开启_ 动力学数据。毕竟， 1:1 拟合模型无法处理许多伪影响应，例如：1)由于分析物和运行缓冲液之间的折射率差异而导致的整体位移（整体折射率变化）； 2)分析物从其本体溶液传输到传感器芯片表面所产生的质量传输效应。然而，我们确实使用相同的分析物和运行缓冲液 ( 1× PBS) 来消除任何可能的整体位移或整体折射率变化。同时，在pCTS -L-TLR4相互作用的关联阶段观察到的传感图曲率表明信号出现典型的指数增加，这与潜在的传质效应相反（图 3）。然而， TLR4 分析物异质性（例如寡聚化）或微量污染物相关的非特异性结合是否在一定程度上导致了pCTS -L–TLR4传感图的不规则性仍然难以捉摸（图 3）。
在无法完美拟合最简单的 1:1 结合模型的情况下，如果稳态结合数据涵盖较宽的分析物浓度范围，则还应通过平衡分析独立估计平衡常数( KD ) 。据此，我们估计了KD 对于pCTS -L–TLR4 相互作用，通过评估外推稳态信号作为分析物浓度的函数，假设在 0.1 倍、1.0 倍和分别是K D的 10.0 倍。我们根据剂量依赖性信号饱和度估计的 KD 值（< 28.3 nM）与根据以下公式计算的KD （ 20.2 ± 3.5 ，表 1）非常一致 k关闭/ k开启_ 动力学数据。此外，我们通过将 TLR4 反向缀合到不同的传感器芯片上进行了额外的OpenSPR实验，然后将pCTS -L 作为连续稀释的分析物（Zhu 等人，2023）。因此，我们从改进的传感图中获得了略高但相似的pCTS -L–TLR4 相互作用的KD （64.6 nM vs. 20.2 ± 3.5 nM ），该传感图表现出与1:1 结合模型几乎完美的拟合（ Zhu et al. , 2023) ，支持OpenSPR在估计蛋白质-蛋白质相互作用的KD方面的有用性。
与通过分析物注射和表面再生交替循环进行的典型动力学分析相反，我们采用在配体上连续注射浓度不断增加的分析物，而无需在每个样品浓度之间进行再生，因为苛刻的再生程序可能会破坏 NTA 传感器芯片对配体的捕获。然而，这种单循环动力学OpenSPR使我们有机会评估其他配体结合蛋白（例如， pCTS -L–中和抗体）的预处理是否会影响pCTS -L 配体与随后引入的分析物（例如，TLR4 或 RAGE）的结合。相同且不断增加的浓度。例如，当将不相关的对照单克隆抗体（“c- mAb ”）以极高浓度（例如1200 nM ）注射到pCTS -L缀合的NTA传感器上时，它不会影响随后的pCTS -L配体与TLR4 或 RAGE（图 5）（朱等人，2023）。与此形成鲜明对比的是，当pCTS -L 中和IgG (mAb20) 首次注射到pCTS -L 缀合的 NTA 传感器上时，它显着减少了pCTS -L 配体与 TLR4 或 RAGE 分析物的相互作用，随后以相同且不断增加的浓度引入，如TLR4 和 RAGE 的KD分别增加了近 55 倍（从 20.3 ± 2.3 nM到 1144.3 ± 173.6 nM ）和 10 倍（从 3.1 ± 0.4 nM到 30.4 ± 9.8 nM ）（图 5）（朱等人，2023）。 pCTS -L 配体特异性mAb对pCTS -L 与 TLR4 或 RAGE 相互作用的特异性损害支持pCTS -L 配体与 TLR4 或 RAGE 分析物之间的特异性相互作用。

pCTS -L 中和单克隆抗体 (mAb20) 对pCTS -L 配体与 TLR4 相互作用的影响或愤怒。重组pCTS -L 固定在 NTA 传感器芯片上，并且在随后注射之前，将不相关的对照单克隆抗体 (c- mAb ) 或pCTS -L 中和mAb (mAb20) 预先暴露于pCTS -L 结合的 NTA 传感器芯片TLR4（左图）或 RAGE（右图）分析物浓度逐渐增加以估计KD 。

一般注意事项和故障排除

1.由于OpenSPR使用直径相对较窄的微流体管来保存珍贵的分析物样品，因此所有溶液（例如运行缓冲液和蒸馏水）都必须通过 0.2 μm 过滤器进行过滤，以防止任何大颗粒进入并堵塞 OpenSPR的流体管路。同样，在注入OpenSPR之前，还应仔细检查分析物溶液中是否有任何大颗粒。
2.如果发生管道堵塞，用户可以从Nicoya Lifesciences 购买堵塞套件来解决问题。
3.不同样品的注射应使用单独的一次性注射器进行，以避免交叉污染。如果使用玻璃汉密尔顿注射器，请确保在将其用于不同样品之前用电泳缓冲液彻底清洗。
4.所需的最小样品体积是样品环的体积加上 50 μL的过量体积，以确保均匀的样品浓度分布以及样品环内不存在剩余空气。
5.OpenSPR NTA 传感器提供了一种方便的捕获偶联技术来固定带有 6× His 标签的重组蛋白，因为其功能性 NTA 基团可以在 NiCl 2 存在的情况下通过其 His 标签捕获蛋白配体。这些与 NTA 缀合的金纳米粒子以特定方向捕获 His 标签配体，但His 标签与 Ni-NTA 表面之间的离子相互作用弱于共价直接偶联。随着时间的推移，这可能会导致配体样品从表面损失一些，特别是在使用OpenSPR测量更强（低解离率）的动力学相互作用时。由于捕获的配体可能存在固有解离，因此不建议使用这种固定方法来分析解离缓慢的动力学系统。
6.k on ) 和解离速率 ( k off ) 常数决定，这些常数与分析物和配体的浓度无关。然而，这些缔合和解离常数对溶液的pH 值和盐浓度高度敏感，这强调了在整个研究过程中保持实验条件恒定的重要性。当然，运行缓冲液不应含有螯合剂或还原剂（例如，EGTA），它们会去除必要的 Ni 2+离子或改变 Ni 2+氧化还原态，这两者都可能损害 NTA 表面活化。
7.我们不知道可与 OpenSPR 一起使用的配体是否有大小限制，因为我们尚未在OpenSPR分析中尝试过任何较小的肽。
8.并且分析物含有多个表面暴露的组氨酸残基，则可能会出现假阳性结果。因此，使用His标签阴性对照蛋白（具有相似的分子量但无法与配体相互作用）进行对照实验应采取措施解决这些潜在问题。

致谢

王博士实验室的研究得到了美国国立卫生研究院 (NIH) 拨款 R01AT005076、R01GM063075 和 R35GM145331 的支持。 Zhu 等人的研究文章中首次描述了用于表征pCTS -L 与两种假定受体相互作用的OpenSPR方法。（2023）。

利益争夺

所有作者都没有任何需要声明的利益冲突。

参考

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Drescher, DG、Selvakumar, D. 和 Drescher, MJ (2018)。通过表面等离子共振分析蛋白质相互作用。副词。蛋白质化学。结构。生物。 110：1 – 30。
强X.、李J.、朱S.、何明、陈W.、Al-Abed, Y.、Brenner, M.、Tracey, KJ、王P.、王H. ，等人。（2022）。人 Dermcidin 保护小鼠免受肝缺血再灌注引起的局部和远端炎症损伤。正面。免疫学。 12：e821154。
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朱CS、强X.、陈W.、李J.、兰X.、杨H.、龚J.、Becker, L.、王P.、Tracey, KJ, 等。（2023）。鉴定组织蛋白酶 L (pCTS-L) 中和单克隆抗体，用于治疗潜在致命的败血症。科学。副词。 9（5）：eadf4313。