材料与试剂

试剂

衣藻生长培养基
1.三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）（Sigma，目录号：252859），在室温下保存（ RT）
2.赫特纳微量元素（衣藻资源中心）
3.磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma，目录号：P5655），储存在室温下
4.磷酸二氢钾（K 2 HPO 4 ）（Sigma，目录号：P3786），储存在室温下
5.乙酸（Sigma，目录号：A6283）
6.TRIS-乙酸盐-磷酸盐 (TAP) 培养基（参见食谱）
7.磷酸盐缓冲液 II（参见配方）
8.溶液 A (40 × )（参见配方）

常规U - ExM协议
1.甲醛，36.5%–38% (FA)（Sigma，目录号：F8775），室温保存
2.丙烯酰胺，40% (AA)（Sigma，目录号：A4058），储存于 4 °C
3.十二烷基硫酸钠 (SDS)（Carl Roth，货号：CN30.3），室温保存
4.N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，2% (BIS)（Sigma，目录号：M1533），储存于 4 °C
5.丙烯酸钠，97% – 99% (SA)（Sigma，目录号：408220），储存于 -20 °C
6.过硫酸铵（APS）（ Thermo Fisher，目录号：17874），储存在室温下
7.四甲基乙二胺（TEMED）（ Thermo Fisher，目录号：171919），储存在室温下
8.TWEEN 20（Sigma，目录号：P1379），储存于室温
9.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A3059），储存于4°C
10.聚-D-赖氨酸，0.1 mg/mL (PDL)（Gibco，目录号：A3890401），储存于 4 °C
11.PBS（1 ×和 10 × ）
12.水蒸气_ _
13.无核酸酶水（ Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9937）
14.抗体（一抗和二抗）
15.NHS-酯Atto488（Sigma，目录号：BCCJ6663）
16.NHS-酯 405（Sigma，目录号：250966）
17.NHS-酯 Atto 594（Sigma，目录号：08AA12）
18.NHS-酯 Atto 647（Sigma，目录号：BCCD9924）
19.BODIPY 558/568（红色）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：D3835）
20.多聚甲醛（PFA），16%（EMS，目录号：15710）
21.戊二醛（GA），25%（Sigma，目录号：G5882）
22.甲醇 (MeOH)（Sigma，目录号：34860）
23.α-微管蛋白抗体（ABCD Antibodies，目录号：AA345）
24.β-微管蛋白抗体（ABCD Antibodies，目录号：AA344）
25.SNAP 标签抗体（New England Biolabs，目录号：P9310S）
26.PsbA抗体（ Agrisera ， AS06 143）
27.Centrin抗体克隆 20H5（Millipore，目录号： 04-1624）
28.甲醛/丙烯酰胺混合物（1.4% FA ， 2% AA）（参见配方）
29.丙烯酸钠溶液（38% w/w）（参见配方）
30.单体溶液，10 份，90 µL （参见食谱）
31.10% TEMED，10 份 100 µL （参见食谱）
32.10% APS，10 份 100 µL （参见食谱）
33.变性缓冲液，pH 9，100 mL（参见配方）
34.PBS-Tween (0.1% w/v) (1×, 1 L) （参见配方）
35.PBS-BSA (2%) (1×, 100 mL) （参见配方）

ExM方案的附加试剂
1.丙酮（99.8% AcroSeal ）（ Acros Organics，目录号：67-64-1）
2.乙醇（EtOH，绝对）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：397691000）
3.干冰
4.乙烷气瓶（ PanGas ）。也可以使用 37%:63% 的乙烷:丙烷混合物( PanGas )，这样可以避免气体在制备过程中冻结

材料

常规 U- ExM协议
1.锥形瓶
2.带超薄尖端的杜蒙 5 型镊子 (0203-L5-PO) 或负作用镊子型号 5 号5 (0203-N5-PO)
3.12 毫米盖玻片，高精度 1 号1.5H（ Marienfeld实验室玻璃器皿，目录号：47442）
4.24 毫米盖玻片，高精度 1 号1.5H（ Marienfeld实验室玻璃器皿，目录号：48639）
5.12孔板（ Thermo Fisher Scientific，目录号：150200）
6.6孔板（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 150239）
7.P1000 移液器吸头
8.P200 移液器吸头
9.P20 移液器吸头
10.抹刀（ Bochem ，目录号：3101）
11.勺子（ Bochem ，目录号：3421）
12.剃须刀刀片（Carl-Roth，目录号：CK07.2）
13.250 mL 烧杯（VWR，目录号：213-1124）
14.500 mL 烧杯（VWR，目录号：213-1126）
15.卡尺
16.细网（例如花园用的蚊帐或防虫网）
17.封口膜（ Bemis TM ，目录号：PM996）
18.剪刀
19.巴斯德移液器（Alpha Laboratories，目录号：LW4111）
20.1.5 mL Eppendorf 管
21.35 mm 成像室（金属 O 形圈 35 mm）（ Okolab ，目录号：RA-35-18 2000–06）
22.盖玻片架（ Thermo Fisher Scientific，目录号：C14784）

ExM协议的附加材料
1.聚苯乙烯盒（23厘米× 23厘米× 21厘米）
2.5 mL Eppendorf 管（Eppendorf，目录号： 0030119401）
3.带夹紧环的 Dumont Style L5 Inox 8 镊子（电子显微镜科学）
4.Whatman 滤纸，55 毫米（GE Healthcare，目录号：1001-055）

设备

常规 U- ExM协议
1.37°C培养箱或气候控制室
2.加热块（Cole- Parmer TM ，目录号： SBH130DC）
3.倒置荧光显微镜，例如宽场 Leica Thunder、SP8 或 Zeiss LSM 980，配备 63 ×油镜。

ExM协议的附加设备
1.Cryo-EM 手动柱塞 [准备本手稿时使用的两种设备都是自制的柱塞；然而，商业手动低温插入装置是可用的（ https://www.mitegen.com/product/manual-plunge-cooler/ ），自制手动插入装置可以由团体生产（Comolli et al., 2012 ） ] 。

软件

1.斐济（ImageJ， https://imagej.net/software/fiji/ ）（Schindelin 等人，2012）

根据用于成像的显微镜品牌，需要专用软件，例如：
2.LAS X（徕卡， https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ ）
3.禅蓝（蔡司、 https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen.html ）

程序

A.衣藻细胞培养物和菌株

1.将衣藻菌株接种到至少 10 mL 的 1 × TAP 培养基中，并在 23°C 下摇动孵育（Hoober，1989）。接种盖玻片仅需几百微升培养物。
2.培养细胞直至达到对数生长期并且培养物变成亮绿色。这个时间相当于大约三天。
注意：与酵母不同（Hinterndorfer et al., 2022），衣藻细胞壁似乎不会阻止扩张或诱导扩张伪影（图 1）。我们在未固定的 U- ExM中测试了两种菌株，CC124-（细胞壁阳性）和 CW15-（细胞壁阴性），在两种情况下，细胞均正常扩增 4 倍。

莱茵衣藻的细胞壁不影响超微结构放大显微镜 (U- ExM )中的四倍放大因子。（A）代表性的明场图像衣藻属 CC124-（细胞壁阳性）扩张前应变，显示为单个 z 平面。比例尺：25 μm 。 (二) 代表性的宽场图像衣藻属扩增后的 CC124- 菌株，用泛 NHS-酯（远红色）染色。细胞在扩增前未固定。比例尺：25 μm 。比例尺显示未根据扩展系数重新缩放的测量物理长度。（C）整个细胞平均面积的测量衣藻属 CC124- 和 CW15-（细胞壁阴性）菌株，扩增前后。扩增细胞的面积除以扩增因子，以便与未扩增的细胞面积进行比较。（n = 329、126、256 和 111 个细胞，分别来自两个独立实验。CC124-非扩展 = 40.50 ± 2.21 μm 2 ，扩展 = 42.12 ± 0.06 μm 2 ，CW15-非扩展 = 50.10 ± 0.36 μm 2 展开= 50.69 ± 3.07 μm 2 ；平均值±S 。 D.)（纳秒，p > 0.05） (四) 细胞面积计算示意图衣藻。

B.培养基、原液和扩增显微镜试剂制备

1.衣藻生长的日子里，准备丙烯酸钠、APS 和 TEMED 等份、变性缓冲液、PBS-Tween 和 PBS-BSA 的储备溶液。
2.12毫米和 24 毫米 PDL 涂层盖玻片，这相当于12 毫米盖玻片的大约 50 μL和24 毫米盖玻片的100 μL 。将盖玻片置于 37° C 、环境湿度下 30 分钟，并用无菌水清洗 3次。除去多余的水并风干。将盖玻片储存在 4°C 下直至使用。
注意：在 PDL 涂层之前对 24 mm 盖玻片的表面进行等离子清洁可大大减少采集过程中的样品漂移。请参阅程序 E 部分和注释。

C.衣藻盖玻片接种、固定和凝胶形成（第 0 天）

1.当衣藻细胞达到对数生长时，从 4°C 取出 PDL 涂层的 12 mm 盖玻片，并置于 RT 约 10 分钟。
使用带有切割尖端的 P1000，将 100 μL衣藻培养物添加到 PDL 涂层的 12 mm盖玻片的中心。 5-10分钟后，细胞将粘附到盖玻片的底部（图 2）。

衣藻工具和视觉辅助工具超微结构扩张显微镜（ U- ExM ）。 A. U- ExM中使用的抹刀、勺子、镊子、塑料刀片和成像室。 B.固定前将衣藻接种在 12 mm 盖玻片上。此处用于固定盖玻片的镊子是负作用镊子，型号为 10 号。 5. C. 用于形成凝胶的冰上凝胶室。蓝色环是湿纸巾。插图：45 °将盖玻片滴到凝胶液滴上。 D. 第一轮扩增后的代表性凝胶。 E. 扩张前的代表性凝胶。

2.继续进行固定步骤。
固定的多种选择是可能的，并且应该根据要成像的细胞区室来选择。固定选择包括冷甲醇、多聚甲醛 + 戊二醛 (PFA + GA)、浸入式冷冻冷冻固定（Laporte 等人，2022b），以及我们最近优化的冷冻固定方案，通过使用 0.1% PFA + 0.02 实现理想的膜保存取代过程中丙酮中的 GA 百分比（Louvel 等人，2022）。众所周知，甲醇固定可以保护细胞骨架网络，但由于蛋白质沉淀和提取，会产生大量其他细胞成分的细胞质和膜清除率。另一方面，PFA + GA 是保存膜结合细胞器（例如线粒体和高尔基体）的金标准固定方法，但会导致细胞骨架的某些元件扩张不良。特别是，我们观察到，如果固定含有太多 GA，中心粒就不能很好地扩展，而 PFA 或 FA 似乎不会干扰扩展因子（Gambarotto 等人，2019）。最后，冷冻固定和冷冻替代最近适用于免疫荧光和扩增显微镜技术，是最好地将细胞保存在天然状态的方法（Laporte 等人，2022b）。这种方法与 U- ExM结合已被证明可以保留细胞骨架和膜结构。为了进一步改善膜保存，最近在冷冻替代步骤中添加了 PFA + GA （Louvel 等人，2022）（图 3）。值得注意的是，细胞也可以保持不固定，特别是为了可视化基体和鞭毛，在这种情况下保持完整，以及通过 Centrin 染色可视化的一些纤维结构（图 3A-3C）（van den Hoek等）等，2022）。然而，一些细胞结构可能会受到影响，例如动态微管(Gambarotto et al., 2021) 、膜细胞器或蛋白核 (图 3B)。为了最好地保存这些细胞器的组织，冷冻固定是首选方法（Laporte 等人，2022b；Louvel 等人，2022）（图 3D）。

图 3.未固定的超微结构扩张显微镜 ( U- ExM ) 与冷冻ExM的比较。 A.按照 U- ExM方案扩增衣藻CW15- 细胞。扩张之前未进行固定。凝胶用Centrin （青色）、Tubulin（洋红色）和 NHS-ester（灰色）染色。顶部面板显示整个细胞。请注意， Centrin信号过度曝光，以揭示细胞核周围的Centrin定位。中图显示了Centrin的内部基体和横纹纤维定位。底部面板显示了NBBC（核-基底体连接器）上的Centrin定位。使用 Leica TCS SP8 采集图像。比例尺：10 μm 。比例尺显示未根据扩展系数重新缩放的测量物理长度。 B.来自与 (A) 相同的单元的 10 个 z 堆栈的分组最大强度投影。使用 ImageJ 蒙太奇堆栈工具将九个分组项目剪辑在一起。细胞留下的数字表示距 z = 0 的物理距离。图像使用 Leica TCS SP8 采集，z 步长为 0.22 μm 。比例尺：10 μm 。比例尺显示未根据扩展系数重新缩放的测量物理长度。 C.按照冷冻ExM方案扩增衣藻CW15-细胞。凝胶用Centrin （青色）、Tubulin（洋红色）和 NHS-ester（灰色）染色。顶部面板显示整个细胞。请注意， Centrin信号过度曝光，以揭示细胞核周围的Centrin定位。中图显示了Centrin的内部基体和横纹纤维定位。底部面板突出显示了NBBC 的Centrin本地化。使用 Leica TCS SP8 采集图像。比例尺：10 μm 。比例尺显示未根据膨胀系数重新缩放的测量物理长度。 D. 来自与 (C) 相同的单元的 10 个 z 堆栈的分组最大强度投影。使用 ImageJ 蒙太奇堆栈工具将九个分组项目剪辑在一起。细胞留下的数字表示距 z = 0 的物理距离。图像使用 Leica TCS SP8 采集，z 步长为 0.18 μm 。比例尺：10 μm 。比例尺显示未根据扩展系数重新缩放的测量物理长度。

不同的固定程序如下：
a.甲醇
将甲醇冷却至 -20°C 至少 1 小时。我们通常将其储存在 -20°C 的小塑料盒中，在其中浸入适合 12 毫米盖玻片的小型陶瓷盖玻片架，如此处所述（Guichard 等人，2015）。添加 100 µL衣藻培养物置于 12 mm PDL 涂层盖玻片上。孵育 5 分钟，轻轻吸干液体，然后快速放入浸入冷 MeOH 的盖玻片架中。将容器放置在 -20°C 10 分钟。取下盖玻片并放入 PBS 中。储存于 4 °C 或进行处理以防止 U- ExM交联。
b.冷冻ExM
要进行冷冻固定，首先，在聚苯乙烯盒中填充干冰，并准备 5 mL Eppendorf 管和 2.5 mL 丙酮（每个条件/盖玻片一根管）。将 5 mL 管快速冷冻在液氮中。接下来，用液氮填充低温插入站（图 4A），冷却至 -180°C（大约 5 分钟），并向制冷剂容器中添加乙烷或乙烷-丙烷混合物。准备好插入站后，添加 100 µL衣藻培养物置于 12 mm PDL 涂层盖玻片上（图 2B）。孵育 5 分钟，然后使用插入镊子在盖玻片的大约一半处抓住盖玻片（图 4B）。将一张滤纸放在其底部约 3 秒，以吸干盖玻片。最初会有过量的介质被滤纸吸收，但允许在盖玻片上保留一薄层介质。插入站包含一个按钮或脚踏板，用于启动盖玻片快速插入冷冻剂中。印迹后立即按下按钮或脚踏板插入盖玻片（图 4C）。然后将盖玻片转移到固体丙酮中以进行冷冻置换步骤。请注意，这种转移必须在液氮上方的乙烷气体区域中进行，以防止盖玻片升温并失去玻璃态。
为此，快速将冷冻盖玻片转移到含有冷冻丙酮的 5 mL 管中（图 4D）。将 5 mL 管放置在 45°角，浸入干冰中。使用桌面摇床 (50 rpm) 轻轻搅拌过夜，使温度升至 -80°C。第二天早上，除去干冰，使样品达到 0°C，这需要大约 1.5 小时。达到 0°C 后，使用温度计测量，使用 12 孔板连续执行 5 分钟乙醇：水浴以补水。顺序如下：100% EtOH、100% EtOH、95% EtOH、95% EtOH、70% EtOH、50% EtOH，最后是 PBS。现在可以对盖玻片进行处理以防止 U- ExM交联。

图 4. 12 mm 盖玻片冷冻固定的设置和方法。 A. 用于在液体乙烷中快速玻璃化的手动柱塞。 B. 用插入式镊子夹住含有细胞的盖玻片，同时用滤纸吸干。注意镊子在盖玻片中间的位置。 P 表示 PDL 和包含细胞的一侧。 C. 将盖玻片浸入低温室的液体乙烷中。 D. 将盖玻片从低温室代表性转移到含有冷冻丙酮的 5 mL 管中。打开管子以促进盖玻片的快速转移，转移发生在液氮上方的乙烷气体区域。

c.膜优化冷冻ExM
为了更好地保存膜并保留脂质，可以按如下方式进行冷冻置换步骤（Louvel 等人，2022）。在骤冷之前，将 0.1% PFA + 0.02% GA 的丙酮溶液放入 5 mL Eppendorf 管中，然后将管放入液氮中冷却，得到固体丙酮。在此步骤中，管子应保持垂直。然后，如上所述，使用插入式冷冻进行冷冻固定。对于替换步骤，将盖玻片转移到含有补充有 PFA 和 GA 的固体丙酮的 5 mL Eppendorf 管中。对于初始的 Cryo- ExM协议，将 5 mL 管放置在 45°角，浸入干冰中。轻轻搅拌过夜，使温度升至 -80°C。第二天早上，除去剩余的干冰，使温度升至约 0 – 4 °C。接下来，通过在还含有 0.1% PFA + 0.02% GA 的连续 4°C 乙醇浴中孵育盖玻片来重新水化样品。顺序如下：乙醇 100% + 0.1% PFA + 0.02% GA（5 分钟），乙醇 100% + 0.1% PFA + 0.02% GA（5 分钟），乙醇 95% + 0.1% PFA + 0.02% GA （ 3 分钟），乙醇 95% + 0.1% PFA + 0.02 % GA（3 分钟），乙醇 70% + 0.1% PFA + 0.02% GA（3 分钟），乙醇 50% + 0.1% PFA + 0.02% GA（3 分钟）），乙醇 25% + 0.1% PFA + 0.02% GA（3 分钟），水（3 分钟）和 PBS。
注意：我们还观察到，70%、50% 和 25% 乙醇步骤可以在不添加 PFA + GA 的情况下进行，并且膜保持不变，如图 5 所示。
d.未修复
添加 100 µL衣藻培养物置于 12 mm PDL 涂层盖玻片上，并直接进行 U- ExM交联预防步骤。
3.固定后，协议进行如下。对于每个固定盖玻片，制作一个在 PBS 中含有 2.0% AA/1.4% FA 的交联预防溶液，每个样品的总体积为 1 mL。将单独的盖玻片添加到 12 孔板的孔中，并添加 1 mL 的交联预防溶液。用ddH 2 O填充未使用的孔以防止蒸发，用封口膜包裹板的边缘，并在37°C孵育3小时。
4.当盖玻片孵育约 3 小时后，将凝胶室（图 2）置于 4°C 下进行冷却。将所需数量的单体溶液 (MS) 等分试样（每两个盖玻片一份等分试样）以及 10% APS 和 10% TEMED 等分试样置于冰上。
注意：APS 和 TEMED 的等分试样可以再次存储以供将来使用，而 MS 是一次性使用的。
5.只需将湿纸巾放入石蜡膜顶部的聚苯乙烯盒或盘中以产生湿度即可创建凝胶室（图 2C）。
6.从交联预防中取出样品并从孔中取出盖玻片。轻轻吸去多余的液体，并将冷冻的湿度室放入尽可能水平的冰桶中（图 2）。将 P200 移液器预设为 35 μL ，将 P20 移液器预设为 5 μL 。
7.μL MS 等分试样中添加 5 μL APS，然后添加 5 μL TEMED 来激活MS 。快速而平静地涡旋活化溶液，并将两个 35 μL液滴添加到湿度室底部的石蜡膜上（图 2）。快速将两个盖玻片一张接一张地放在液滴上，盖玻片呈 45° 角（图 2，插图）。
8.让凝胶室在冰上放置 5 分钟，然后将其转移到 37°C 环境中 1 小时。
9.从 37°C 检索凝胶室，并用抹刀除去与盖玻片相关的现已形成的凝胶。将凝胶/盖玻片相关面朝下放入 6 孔板的孔中。使用巴斯德移液器向每个样品中添加约 1 mL 的变性缓冲液。将 6 孔板放在摇床上，在 RT 下放置 15 分钟。在此阶段，凝胶将开始膨胀约 2倍并与盖玻片分离。
10.将加热块预热至 95°C，并将 1 mL 变性溶液添加到 1.5 mL Eppendorf 管中，每个样品一个。凝胶从盖玻片上分离后，用勺子收集凝胶并将其放入装有变性缓冲液的 Eppendorf 管中（轻轻滚动凝胶以进入管内）。确保凝胶完全浸没在变性缓冲液中，并将 Eppendorf 管添加到 95°C 加热块中 1.5 小时。在管子顶部放置一个重物，以防止它们爆裂。
11.变性 1.5 小时后，使用抹刀将变性溶液移至废液中，将凝胶捕获在 Eppendorf 管边缘。立即将凝胶倒入含有约 100 mL ddH 2 O 的 500 mL 烧杯中。将凝胶洗涤 30 分钟，然后除去 ddH 2 O。按照刚才的说明再进行一次洗涤，然后重新填充 ddH 2 O 并让凝胶坐过夜进行第一轮扩张。注意：洗胶过程中除去水时，可用细网网盖住废液烧杯，以接住掉落的凝胶。

D.凝胶的抗体染色（扩增后标记）（第 1 天）

1.准备 PBS-0.1% Tween 和 PBS-2% BSA 的库存并储存在 4°C 下。
2.从 500 mL 烧瓶中取出凝胶，并将其放置在干净、平坦的表面上。确保凝胶没有完全干燥。使用卡尺测量完全膨胀的凝胶的直径以确定膨胀系数。从 12 mm 盖玻片上测得的膨胀凝胶直径为 54 mm，对应的膨胀系数为 4.5（图 2）。
3.将凝胶放入装有 100 mL PBS 的 500 mL 烧杯中，并静置 15 分钟，从而收缩凝胶。重复1 × 。
4.将收缩的凝胶放在平坦的表面上，再次确保凝胶保持轻微水合。用刀片将凝胶切成四块，并将每块放入 12 孔板的孔中。
注意：可以保留整个凝胶进行免疫染色，但随后使用 6 孔板和两倍体积的抗体（总体积 500 μL与 1 mL；本节的下一步）。进一步切割凝胶可以在同一样品上提供更多的抗体染色条件。如果不需要所有凝胶碎片立即染色，则可以将碎片在 4 °C 的 PBS 中保存几周，或在 -20 °C 的 50% 甘油溶液中保存更长时间（参见注释部分）。
5.将所需的一抗组合添加到最终体积为 500 μL的 PBS-2% BSA 中，并将该混合物添加到所需的凝胶中。（请注意，抗体浓度需要优化，但 1:300 稀释是一个不错的起点。）
6.用封口膜密封 12 孔板，并将其放在 37°C 的摇床上 3 小时。
7.取出 12 孔板并用巴斯德移液器从孔中除去一抗溶液。将大约 1 mL 的 PBS-0.1% Tween 添加到凝胶中，并在 RT 下轻轻摇动 10 分钟。重复 2次以完全清洗未结合的抗体。
8.μL PBS 2% BSA中制备所需的二抗组合。将二抗溶液添加到相应的凝胶片中，并用铝箔包裹 12 孔板，因为二抗的荧光团可能具有光敏性。
注意：1:400 稀释是大多数二抗的合理浓度。
9.将包裹好的 12 孔板放在37°C 的摇床上 3 小时。
10.取回 12 孔板并重复步骤 D7 中所述的 PBS-0.1% Tween 洗涤。清洗过程中注意包裹 12 孔板。
11.完成最终洗涤后，如果需要，可进行 NHS 酯染色（E 部分）或重新扩增。为了重新扩展，使用勺子或抹刀从孔中取出凝胶块，并将其放入含有约 50 mL ddH 2 O 的 250 mL 烧杯中。在 RT 下孵育 30 分钟并除去水。再重复一次，然后在 ddH 2 O 中孵育凝胶直至成像。
注意：NHS-酯染色也可以在第二天进行。将凝胶块保留在 12 孔板中，向孔中添加 PBS，并储存在 4°C 下，直至进行 NHS-酯染色。

表格1。针对标记蛋白的抗体
标签物种制造商参考号U- ExM稀释
绿色荧光蛋白兔子多利松TP4011:200
YFP兔子多利松TP4011:200
mNeongreen *老鼠克罗莫泰克32F6不兼容
哈老鼠西格玛奥德里奇H69081:100
HRV3C兔子赛默飞世尔PA1-1181:150
折断老鼠鼻P9310S1:100

针对标记蛋白的抗体。针对标记的抗体列表、制造商以及在标记衣藻菌株的U- ExM中测试的稀释度。

E.NHS-酯染色

M'Saad和Bewersdorf引入了扩展显微镜中的 NHS 酯染色（ M'Saad和Bewersdorf ，2020）以及 Mao 等人。（2020）和Yu等人。（2020）。 NHS-酯是一种酯-染料缀合物，可与蛋白质上的伯胺发生反应。通过这种标记，可以与电子显微镜图像相媲美地揭示细胞背景（ M'Saad和 Bewersdorf，2020）。
1.实验前，制备 20 μL 将 NHS-酯染料 (1 mg/mL) 悬浮在 PBS 中并储存在 -20°C 下。 NHS-酯染料具有光敏性。存放在避光盒中。注意：NHS-酯可以与许多不同的荧光团结合，从而根据疏水性、pH 等优先标记不同的细胞区室(Sim et al., 2021) 。该方案描述了与 Atto 488、405、594 和 647 缀合的 NHS-酯中使用的浓度。
2.实验当天，从冰箱中取出所需数量的工作等分试样并在黑暗中解冻。
3.将解冻的工作等分试样添加到最终体积为 1 mL 的 PBS 中，以生成 20 的最终浓度 μg /mL NHS-酯。每孔中添加 500 μL NHS-酯溶液，其中含有 PBS 中的凝胶。注意：1 mg/mL 的20 μL NHS-酯的一份工作等分试样相当于对 12 孔板的两个孔进行染色。进一步稀释也是可能的。
4.用铝箔覆盖 12 孔板，并在摇床上在 RT 下孵育 1.5 小时。
5.用巴斯德吸管从孔中取出 NHS 酯染色溶液，并用大约 1 mL 的 PBS 代替进行清洗。放在摇床上 10 分钟。重复洗涤 4次。
6.如步骤 D11 中所述，在 ddH 2 O中进行重新膨胀。

F.BODIPY TM膜染色

为了保存 U- ExM中的脂质膜，应使用冷冻固定，然后使用含有 PFA 和 GA 的冷冻替代来获得最佳结果。为了使膜可视化，可以使用 BODIPY TM以与 NHS-酯相同的方式使用（图 5）。

图 5.使用膜优化的cryo- ExM方案对衣藻进行 BODIPY TM脂质染色。 A.在扩增之前，将衣藻CC124- 菌株冷冻固定并冷冻替代在补充有 0.1% PFA 和 0.02% GA 的丙酮中（详细信息请参见冷冻固定步骤）。凝胶用BODIPY TM染色。该图像显示单个 z 平面。观察到的结构用星号标记。比例尺：10 μm 。比例尺显示未根据扩展系数重新缩放的测量物理长度。 B.来自与 (A) 相同的单元的 12 个 z 堆栈的分组最大强度投影。使用 ImageJ 蒙太奇堆栈工具将九个分组项目剪辑在一起。请注意，此处显示了鞭毛膜和蛋白核结构，这些结构在 (A) 所示的单个 z 平面中不可见。单元格下方的数字表示距 z = 0 的物理距离。图像使用 Leica TCS SP8 采集，z 步长为 0.18 μm 。比例尺：10 μm 。比例尺显示未根据扩展系数重新缩放的测量物理长度。 C. 使用 ImageJ 线扫描工具在鞭毛膜上绘制绘图轮廓 [如 (B) 中的 1 所示]。 L 显示测量的峰到峰距离。测量的长度通过膨胀系数进行校正。校正后的距离显示基于 BODIPY TM染色的鞭毛膜的直径。 D. 使用 ImageJ 线扫描工具在细胞壁上绘制绘图轮廓 [如 (B) 中的 2 所示]。 W 表示峰的 50% 强度之间的距离。

1.制作 10 在 DMSO 中稀释，得到 2 mM的 BODIPY TM μL等分试样。未使用的等分试样应避光保存在 -20°C 下。
2.要对 BODIPY TM进行染色，请用 PBS 2% BSA 进行 1:200 稀释，然后添加到含有 PBS 中的收缩凝胶的孔中。一份 10 μL的BODIPY TM应足以对 12 孔板中的两块凝胶进行染色。
3.用铝箔盖住 12 孔板，并在摇床上室温孵育 1.5-2 小时。
4.用巴斯德吸管从孔中取出 BODIPY TM染色溶液，并用大约 1 mL 的 PBS 替换进行洗涤。放在摇床上 10 分钟。重复洗涤 3次。
5.如步骤 D11 中所述，在 ddH 2 O中进行重新膨胀。

G.凝胶成像（第 2 – 7 天以上）

1.将膨胀的凝胶块从 250 m L 烧杯中倒出，同时捕获凝胶块（用抹刀或戴手套手动）。将其放置在干净平坦的表面上，并切成约 1.5 cm × 1.5 cm的正方形用于成像在尺寸方面。将剩余的凝胶块放回含有 ddH 2 O的烧杯中以备将来使用（参见注释 5）。
2.放置 1.5 厘米× 1.5 厘米将凝胶片放在 24 mm 盖玻片的中心，并将盖玻片放置在成像室内部（成像室示例，图 2A）。
注意：凝胶片不应接触成像室的边缘，以防止采集过程中发生漂移。
3.确保显微镜载物台上有合适的载物台安装座并插入成像室。
4.将物镜更改为中等放大倍数（20倍或类似）以确定含有细胞的凝胶一侧。
注意：这可能需要拆下成像室并用抹刀翻转凝胶片。如果凝胶的侧面相反，则可以在成像平面中观察到浓背景荧光。
5.当确定凝胶的正确侧面后，轻轻吸干凝胶的四个边缘以及反面以除去多余的水。取出 PDL 涂层的 24 mm 盖玻片，并将含有细胞的一面朝下放置在中心。使用小画笔或抹刀的侧面轻轻地将凝胶贴在 PDL 涂层上，直到凝胶完全粘附在表面上。将含有凝胶的 PDL 涂层盖玻片放回成像盘中。轻轻地将约 5 μL ddH 2 O 添加到凝胶顶部，并在顶部放置 24 mm 盖玻片以创建微型潮湿室。
注意：未能去除凝胶中多余的液体或不良的 PDL 涂层会导致采集过程中出现大量样品漂移并无法收集图像。有关样本漂移的帮助，请参阅注释部分。
6.将成像室返回到显微镜阶段并进行采集，大约每小时添加5 μL ddH 2 O 以防止凝胶收缩。在室顶部添加未涂层的 24 mm 盖玻片，以防止水蒸发。
7.衣藻细胞在凝胶内以不同的方向定位。检查凝胶以找到所需方向的样品。
8.使用徕卡显微镜成像时，在闪电模式下成像，策略为“自适应”，选择“水”作为封片剂以获得最佳结果。如果使用 Leica 共焦（例如 SP8），请将像素大小设置为 35 nm 以获得最大分辨率。如果使用蔡司显微镜（例如 LSM980）成像，请在Airyscan模式下选择“分辨率”进行成像。（代表性 z 堆栈，视频 1。）
注：由于先前发布的预期横向分辨率尺寸为 70 nm，因此奈奎斯特采样时获得的像素尺寸为 35 nm 是最大边界(Chen et al., 2015) 。然而，鉴于显微镜的光学特性不变，使用较大像素尺寸的采样将减少采集时间，同时对分辨率的影响最小。有关该决议的更深入解释，请参阅数据分析。

衣藻细胞顶视图的代表性 z 堆栈。表达IFT46-mNeonGreen:D1bLIC-mCherry 的转基因细胞的Cryo - ExM使用 LSM980 共聚焦显微镜使用Airyscan模式进行成像，步长为 0.15 μm 。使用 NHS-酯（灰色）、抗微管蛋白抗体（洋红色）和抗乙酰化微管蛋白抗体（绿色）进行染色。通过扩展系数校正的比例尺：5 微米。

数据分析

共焦显微镜的传统应用保守地将横向尺寸衍射限制在约 200 nm （MacDonald 等人，2015）。根据原始扩展显微镜方案的测量， 4.2 – 4.5 ×的正常扩展因子可产生约 70 nm 的有效横向分辨率（Chen 等人，2015）。通过这种分辨率，可以解析距离为 188 nm 的鞭毛两侧用 BODIPY 标记的膜（图 5C）。此外，当测量也被 BODIPY 染色的细胞壁厚度时，40 nm 厚的细胞壁（Horne 等人，1971）显示为 80 nm 厚的层。这与大约 70 nm 的分辨率一致。
可以在固定后但在开始 U- ExM交联预防之前测量在非膨胀衣藻中可观察到的特征。例如，核大小、蛋白核面积或鞭毛长度可以通过明场显微镜测量，然后在 U- ExM后重新测量以确认各向同性。
在分析收集的图像时，有必要了解扩展因子以正确缩放距离。正如 D 节中提到的，扩展因子可用于缩放图像。在我们的实验室中，我们还经常使用明确描述的基准（例如基体的宽度）来缩放图像。例如，考虑到基体的实际宽度为 225，近端扩展宽度为 900 nm 的基体对应于扩展因子 4。另外，我们在U- ExM中发现，测量膨胀前后的凝胶来确定膨胀系数是相当可靠的，其值与通过测量基体获得的值相似，因此如果您没有膨胀系数，可以使用这种更简单的方法。内部分子标尺。
通过抗体标记可以可视化各种细胞区室，例如通过针对 IFT 成分的抗体标记，IFT 序列定位在基体和沿着鞭毛（图 6A），与细胞体中叶绿体的标记形成对比（图 6C，视频 2)。
为了进行分析，可以使用任何常规图像分析软件。我们通常使用斐济，特别是绘图轮廓函数来评估共定位并使用峰峰值或全宽半最大值来测量沿基板的距离和周期性。例如，我们对动力蛋白调节复合物亚基 3 (DRC3) 进行染色，这是一种对鞭毛波形调节很重要的鞭毛蛋白(Huang et al., 1982) ，并发现了与微管双联体的共定位信号 (图 6B)。

图 6.超微结构扩张显微镜 ( U- ExM )中衣藻成像的代表性示例。 A. 甲醇固定的衣藻IFT46-YFP 细胞对微管蛋白和 IFT46 进行染色。注意鞭毛内运输列车（IFT）颗粒在基体和鞭毛尖端的积累，以及鞭毛轴丝上的列车状染色。通过膨胀系数校正的比例尺：2 μm 。 B. 用 SNAP 标记的 DRC3（动力蛋白调节复合物的一个组成部分）染色的微管蛋白的高倍放大图像。右下图是根据 DRC3 染色中的虚线生成的绘图轮廓。通过扩展因子校正的比例尺：50 nm。 C. Cryo- ExM固定的衣藻细胞对叶绿体（ PsbA染色）、微管蛋白和 NHS-酯进行染色。通过膨胀系数校正的比例尺：2 μm 。使用 Leica Thunder (A) 和 LSM980 Airyscan2 (B、C) 采集图像。

叶绿体染色的扩展衣藻细胞的代表性 z 堆栈。表达IFT46-mNeonGreen:D1bLIC-mCherry的转基因细胞的Cryo - ExM使用 LSM980-NLO 共聚焦显微镜使用Airyscan模式进行成像，步长为 0.15 μm 。使用 NHS-酯（灰色）、抗乙酰化微管蛋白抗体（品红色）和抗PsbA抗体（绿色）进行染色。通过膨胀系数校正的比例尺： 10μm 。

笔记

1.丙烯酸钠
与所有膨胀显微镜方案一样，丙烯酸钠的质量是膨胀显微镜问题的常见原因。将丙烯酸钠粉末逐渐溶解到搅拌水中以促进溶解。注意在 4 °C 的冰上溶解丙烯酸钠，或立即转移至4 °C。不同批次的丙烯酸钠纯度不同。实验中只能使用澄清或淡黄色的溶液。
2.固定方法
在开始实验之前应考虑所需的固定方法。每种方法都有其优点和缺点，但冷冻固定可以最好地保存样品的自然状态（Dubochet 等，1988）。如果冷冻固定不可用，请考虑对细胞区室进行染色，并相应地使用未固定、甲醇或 PFA/GA 固定。
固定时，尤其是使用冷冻固定时，重要的是要确保盖玻片没有被过度吸干。完全干燥盖玻片会导致细胞脱水，细胞质体积缩小，但细胞壁保持相同体积，导致细胞质体积和细胞壁之间存在较大间隙，在膨胀显微镜中形成“光环”外观。避免盖玻片过度印迹可以避免这种伪影。
3.成像时鞭毛断裂
衣藻通常通过鞭毛粘附在表面上。在这些情况下，鞭毛在膨胀过程中可能会破裂，并且可以在盖玻片上观察到裂缝或碎片。这很常见，可以扫描凝胶以找到完整的鞭毛。
4.微观漂移
如“程序”部分所述，显微镜上的样品漂移是一个常见问题，导致无法获取可用图像。我们发现，在添加 PDL 之前对 24 mm 盖玻片的表面进行等离子清洁可大大增强凝胶和盖玻片之间的粘附力。即使添加水后，凝胶也应保持完全粘附，以防止凝胶收缩。避免在凝胶边缘成像并保持朝向中心进行数据收集。如果凝胶在成像开始时明显漂移，则从显微镜中取出成像室，轻轻吸干凝胶边缘，然后返回显微镜进行成像。新涂有 PDL 的盖玻片可减少漂移。
5.凝胶储存
由于逐渐的荧光降解或抗体损失，凝胶的成像质量随着时间的推移而降低。我们建议尽可能在染色时间附近对凝胶进行成像。一旦它们在ddH 2 O中扩增，通常允许在染色后最多 7 天进行成像。通过将膨胀的凝胶浸入10 cm 培养皿中含有 50% 甘油的dd H 2 O中，摇动 3 小时，用封口膜包裹培养皿，并置于 -20 °C，可以延长标记和未标记凝胶的保存时间。要解冻冷冻凝胶，用 ddH 2 O 洗涤一次以去除多余的甘油，然后在 PBS (1×) 中洗涤至少 3 次，每次 1 小时。（凝胶会在 PBS 中收缩并迫使甘油流出。）确保完全洗掉甘油，否则染色中可能会产生信号背景。

食谱

假定所有库存与试剂中列出的库存相同。

1.水龙头，0.5升
三羟甲基氨基甲烷，1.21 克
磷酸盐缓冲液 II，0.5 mL
溶液 A，5 mL
赫特纳微量元素，0.5 mL
乙酸，0.5 mL
混合成分并加水至 0.5 L。将 pH 调节至 7.0。高压灭菌器进行灭菌。

2.磷酸盐缓冲液II
1 MK 2 HPO 4 , 250 毫升
1 M KH 2 PO 4 , 170 mL
将pH值调节至7

3.溶液 A (40 × )
三羟甲基氨基甲烷，96.8 克
磷酸盐缓冲液 (pH 7)，40 mL
乙酸，40 mL
用蒸馏水将溶液定容至1L。

4.甲醛/丙烯酰胺混合物（1 .4% FA ， 2% AA), 1 mL/1 盖玻片
FA (38%), 38 μL
AA (40%), 50 μL
PBS 1 × , 912 μL
混合成分并将 1 mL 添加到 12 孔板的孔中。下表显示了按比例放大盖玻片数量时每种试剂的体积。
盖玻片12345678
FA (1.4%)3876114152190228266304
AA (2.0%)50100150200250300350400
PBS（1 × ）9121824年273636484560547263847296

5.丙烯酸钠溶液（38% w/w）
丙烯酸钠，19 克
无核酸酶水， 31 mL *
将丙烯酸钠逐渐添加到搅拌的水中以混合。尝试在4 °C下工作，并在丙烯酸钠溶解后立即在 4 °C下保存。
*31 mL 无核酸酶水 = 31 g 无核酸酶水。 31 g 无核酸酶水 + 19 g 丙烯酸钠 = 总共 50 g。 19 克丙烯酸钠/50 克总计 = 38% w/w 溶液。
！由于溶液中丙烯酸钠的密度较高，38% w/w 丙烯酸钠溶液相当于 46% w/v 溶液。

6.单体溶液，10 份 90 µL *
丙烯酸钠溶液（38% w/w），500 μL
丙烯酰胺 (40%)，250 μL
BIS (2%)，50 μL
10 × PBS， 100μL
将成分在冰上混合并涡旋 30 秒。制成 90 μL等份并在 - 20 °C下保存三周。一份用于两张盖玻片。

7.10% TEMED，10 份 100 µL
TEMED，100 μL
无核酸酶水， 900 μL
将 TEMED 和无核酸酶水混合。制成 100 μL等份并储存在 - 20 °C下。

8.10% APS，10 份 100 µL
APS，0.1 克
无核酸酶水, 1 , 000 µL
将 APS 粉末和无核酸酶水混合。制成 100 μL等份并储存在 - 20 °C下。

9.变性缓冲液，pH 9，100 mL
SDS 溶液（350 mM 库存溶液，10 g，溶于 ddH 2 O，最终体积 100 mL），57.14 mL
氯化钠 (5 M)，4 mL
Tris-BASE，0.6 克
ddH 2 O，填充至100 mL
将 0.6 g TRIS-BASE 溶解在 10 mL ddH 2 O 中。添加 NaCl 和 SDS。用 HCl 将 pH 调节至 9。用 ddH 2 O 填充至 100 mL 并储存在 RT 下。

10. PBS-吐温 (0.1% w/v) (1×, 1 L)
准备 1 × PBS：
氯化钠，8 克
氯化钾，0.2克
Na 2 HPO 4 ,1.44 克
KH 2 PO 4 , 0.24 克
用蒸馏水将溶液调整至 1 L。
添加 100 µL Tween 20 洗涤剂。

11. PBS-BSA (2%) (1×, 100 mL)
将 2 g BSA 溶解在 100 mL 的 1 × PBS 中。

致谢

我们感谢 Human Technopole 的光成像设施和日内瓦大学的光子生物成像中心。我们感谢文森特·卢维尔对手稿的批判性阅读。我们感谢 NK 获得 EMBO 奖学金 ALTF 537-2021 我们要感谢 Human Technopole、欧洲研究理事会 (ERC) 根据欧盟地平线 2020 研究和创新计划（拨款协议编号 819826）向 GP 提供的资助这项工作也是得到 PG 和 VH 的瑞士国家基金会 310030_205087 以及日内瓦大学的支持。该协议源自van den Hoek等人的原创作品。（2022）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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