材料与试剂

耗材

1.Eppendorf 管，1.5 mL（ Tarsons ，印度）
2.试剂瓶，琥珀色 25 mL（ Borosil ，目录号：1519009）
3.载玻片，76 mm × 26 mm（ Borosil ，产品代码9100P02）
4.盖玻片，矩形，24 mm × 60 mm（蓝星，印度）
5.铝箔，72 m（世纪，印度）
6.解剖针（ Labkafe ，印度产品代码： LKBI 008/1）

植物材料

树龄约15年的树木，保存在CSGRC的田间基因库中，具有不同的细胞类型，如二倍体（MI-0014和MI-0308）、三倍体（MI-0173和MI-0799）、四倍体（K2-4X）、六倍体（ ME ）本研究选择了-0126、MI-0426 和 MI-0571)和十倍体(ME- 0241 )。在本方案中，对于中期染色体计数，在修剪20天后收集顶端芽分生组织尖端。

试剂

1.无菌双蒸水 (ddH 2 O)
2.100% 冰醋酸（ Rankem ，目录号： A0031）
3.0.5 M乙二胺四乙酸 ( EDTA)（GeNei ，目录号： FC43）
4.乙醇（ HiMedia ，目录号：MB106 ）
5.氯化钾（ KCl ）（ HiMedia ，目录号： PCT0012）
6.2.5 （w/v）果胶酶（ HiMedia ，目录号： PCT1519）
7.2.5 （w/v）果胶酶（ HiMedia ，目录号： PCT1520）
8.1:1 (v/v)纤维素酶（ HiMedia ，目录号：RM3331 ）
9.1% 乙酰胭脂红（ HiMedia ，目录号： PCT1304）
10.1% Orcein （ HiMedia ，目录号： RM277）
11.饱和对二氯苯 (PDB) （ HiMedia ，目录号： GRM6907）（参见配方）
12.0.002 M 8-羟基喹啉 (HQ)（ HiMedia ，目录号： GRM7135 ）（参见配方）
13.45% GAA（冰醋酸）（参见食谱）
14.70% 乙醇（参见配方）
15.3EtOH:1GAA（参见食谱）
16.75 mM氯化钾（参见食谱）
17.酶鸡尾酒（参见食谱）
18.1% 乙酰地雷因（参见食谱）

设备

1.手术刀片，尺寸 22（Surgeon，印度，REF 10122）
2.个人防护装备（Oriley，型号： ORPPE6 ），包括手套（型号：KSN30）和安全眼镜（ Augen ，型号：安全玻璃-SG-03）
3.刨冰机( PAREX , PSW-130 )
4.挤压瓶（ Borosil ，型号： 0166024）
5.高吸水性吸墨纸（ Swastik，印度）
6.尖头镊子，5 英寸（ Borosil ，型号：LAFP8888005）
7.迷你冷却器（Tarson，型号：525060）
8.培养箱（ESCO，型号：CCL-050B-8）
9.微量移液器（Eppendorf）
10.冷冻柜（惠而浦，型号：ICEMAGIC FF-350）
11.体视变焦显微镜（徕卡，型号：Wild M8-308700）
12.便携式数码显微镜（ Medprime ，型号： BT-E2020），带 iPad（ Apple Inc. ）
13.iMac 27'' M1 芯片-macOS Monterey (Apple Inc.)
14.Sankalp 浸油（Oil LV，型号：1017）
15.酒精灯（ HiMedia ，型号：LA275）
16.密封蜡（Alpha Chemika，型号：AL2934）

软件

1.Cilika （版本 1.30）， Medprime Technology Pvt. Ltd. ( www.medprimetech.com )，图像采集软件
2.微软Excel、微软
3.Keynote 演示软件（ Apple Inc.版本 10）
4.Floreada.io（ https://floreada.io/flow-cytometry-software ）

程序

A.样品采集和预处理

1.上午 9:00 至 10:00 之间，选择 3-5 个年轻的健康芽，用针和镊子解剖新鲜的顶端芽分生组织尖端，约 0.5 至 1.0 厘米。立即将收集的样品转移到预固定溶液中，即1.5 mL Eppendorf 管中的 1 mL PDB 和 20 µL HQ（图 1 ）。
注意：对于茎尖分生组织尖端的预处理，每个Eppendorf 管可使用最少 3 个（用于大尺寸四倍体加入）和最多 5 个（小尺寸尖端专门用于二倍体加入）样品。样品应立即转移至预固定溶液中，以加强中期停滞阶段。 PDB 和 HQ 库存溶液应在室温 (RT) 下分别保存在琥珀色试剂瓶中，并在收集样品前轻轻颠倒五次以适当混合。

图 1.使用桑属植物芽分生组织制备有丝分裂中期平板的详细步骤和日常活动。

2.°C 的迷你冷却器中5 分钟，然后 4 °C 4 小时。
注意：在进行样品采集之前，请将微型冷却器放入冰桶中，以维持微型冷却器的温度。
3.丢弃预固定剂（PDB + HQ）溶液，并在立体变焦显微镜下使用尖钳和针去除幼叶原基。将修剪后的顶端芽转移到过滤器中，并在流动自来水下彻底清洗 5 分钟，然后在表面皿中加入 5 mL ddH 2 O 10 分钟（图 2 ）。
注意：去除幼叶原基（通常为 3 – 4 个）有助于增强酶处理（步骤 C9）。必须彻底清洗以去除 PDB+HQ 残留物。

图2.样品采集、预处理、固定、染色、挤压进行显微观察的分步流程图

B.分生组织的固定

4.将洗涤后的样品转移到 1.5 mL Eppendorf 管中的 1 mL 冰冷的 3EtOH:1GAA 中，并在 RT (24 ± 2 °C )下孵育 1 小时。
注意：固定前新鲜准备 3EtOH:1GAA。
5.丢弃 3EtOH:1GAA 溶液，并更换为新鲜制备的冰冷 3EtOH:1GAA 溶液。将样品在 4 °C下孵育至少两天。每 12 小时更换一次新鲜的 3EtOH:1GAA 溶液。
6.丢弃 3EtOH:1GAA 溶液，并在 5 mL ddH 2 O 中彻底清洗 10 分钟；然后，将样品储存在 1 mL 70% 乙醇中，置于 1.5 mL Eppendorf 管中，4 °C保存以供进一步使用。
7.在表面皿中用 5 mL ddH 2 O清洗样品两次，每次 10 分钟。将样品转移到 1.5 mL Eppendorf 管中的 1 mL 45% GAA 中，并在 RT 下孵育 1 小时。
8.在表面皿中用5 mL ddH 2 O 彻底清洗 10 分钟，然后用吸水纸除去样品中的水。

C.酶消化

9.使用由纤维素酶 (2%)、果胶酶 (2.5%) 和果胶酶(1%)组成的酶混合物在黑暗中使用培养箱在37 °C下处理4 小时。

D.染色

10.将酶处理的样品转移到1.5 mL Eppendorf 管中，用铝箔覆盖（以保持黑暗条件），并加入 500 μL 1% 乙酰地雷因，并在室温下将含有样品的管孵育 12-14 小时。

E.挤压（参见视频1）

视频 1.用于桑属染色体研究的挤压技术。

11.将已处理（染色）的样品之一从乙酰地衣红染色剂转移到载玻片上。
注意：如果需要，可以用吸墨纸去除多余的污渍。
12.将两滴 45% GAA 添加到样品中，并用针背面轻轻溶解组织。
13.加入一滴乙酰胭脂红和三滴乙酰地衣红染色剂轻轻混合样品；随后，用解剖针清除碎片。
14.将盖玻片放在载玻片上。将载玻片放在折叠的吸墨纸内，用拇指轻轻按压，去除多余的污渍并使其均匀分布。
15.使用针背面轻轻敲击盖玻片，以获得细胞和染色体的最佳扩散。
注意：为了提高铺展质量，需要连续敲击，直到细胞团铺满载玻片成为细胞薄层。确保没有气泡残留。
16.在已安装的载玻片底部施加火焰加热（使用酒精灯）2-3 秒，然后轻轻敲击以实现精确的染色体扩散。
17.用蜡密封安装好的幻灯片（可选）。
18.将载玻片放在显微镜下观察染色体（便携式数字显微镜， Medprime ，型号： BT-E2020 ）。任何具有 40倍或 100倍油浸物镜的复合显微镜都可以使用。来自每个倍性组的代表性种质的显微图像如图3所示。

F.流式细胞仪(FCM) 分析

为了确认倍性水平细胞型，通过 FCM 估计了选定倍性（2x、3x、4x、6x 和 22x）种质的基因组大小，这些倍性通过染色体计数来鉴定（图 4 ）。双激光FACSCalibur TM （BD Biosciences，美国）用于估计基因组大小，并对 Galbraith 等人描述的方案进行了一些修改。（1983）。简而言之，在上午 8:30 至 9:00 之间收集约 0.5 cm 2的幼桑叶（5-6 天）。用刀片将叶子样品切碎于 2 mL核分离缓冲液中[低渗碘化丙啶 (50 μg /mL)、二氢化柠檬酸三钠 (3 g/L)、0.05% (v/v) Nonidet P-40、和 RNase A (2 mg/mL )]；将过滤（ 30μm尼龙网）的细胞核悬浮液收集在管中。将管盖上并在 37 °C下保持30 分钟。然后，对样品进行FCM分析。使用豌豆作为标准参考，并一式三份进行测量。

图 3.桑属不同细胞型的中期平板和估计染色体数。 (A) 二倍体 V1 (2n = 2x = 28)，(B) 三倍体 AR12 (2n = 3x = 42)，(C) 四倍体 M. laevigata L. ( 2n = 4x = 28)，(D)六倍体 M.Serrata Roxb 。 ( 2n = 6x = 84)，和 (E)十倍体 M. nigra L.（ 2n = 22x = 308 ）。比例尺 = 5 µm。

图 4.使用流式细胞术分析确认不同的桑树细胞类型。 (A )豌豆参考、 (B – C) 二倍体、(D – E)三倍体和 (F) 四倍体的碘丙啶 (PI-A) 荧光强度直方图。 (G) 研究的材料列表、基因组大小[以兆碱基对 ( Mbp ) 和象形图 ( pg ) 为单位]，以及预测的倍性水平。 (H)参考豌豆的二倍体 (2x)、三倍体 (3x)、四倍体 (4x)、六倍体(6x) 和十倍体(22x)的 PI 荧光强度（计数与 PI-A）的直方图。 (I)二倍体 (2x)、三倍体 (3x)、四倍体 (4x)、六倍体(6x) 和十倍体的 S散点图（PI-W 与 PI-A） (22x) 原子核，显示它们在荧光方面均匀分布，并代表对应于 2C、3C、4C、6C 和 22C 原子核的一系列明确定义的区域。

数据分析

1.捕获中期板图像（使用自动测量比例尺）并在Apple Inc. Keynote （版本 10）中准备演示文稿（核形态图）。
2.基因组大小 ( Mbp ) 根据 Lysak 和 Dolezel (1998) 的公式计算，其中 1 pg等于 980 Mbp (Dolezel 等人，2003)。最后，使用豌豆的标准参考来计算所研究材料的基因组大小。桑树种质的 DNA 含量范围为 0.85（二倍体）至 8.67 pg （十倍体），变异系数为 3.21（< 5%；图 4H ）。 floreada.io ( https://floreada.io/flow-cytometry-software ) 在线工具用于生成用于 FCM 分析的直方图和s散点图。

笔记

1.在步骤 B5 中，每 30 分钟更换一次 3EtOH:1GAA 溶液，以漂白叶绿素。
2.在步骤 B6 中，必须孵育至少两天，并以 12 小时的间隔将样品重新悬浮在新鲜制备的冰冷 3EtOH:1GAA 溶液中。
3.建议在黑暗中于37 °C下进行酶处理（果胶酶、纤维素酶和果胶酶） 4 小时，以进行较高倍性水平（2n = 3x、4x、6x 和 22x）的核型分析。对于一般细胞学分析和染色体研究，仅用果胶酶在 37 °C下处理 6小时是最佳的。

食谱

1.PDB
试剂最终浓度数量
PDB饱和10克
水分子_不适用95毫升
全部的不适用100毫升

2.70%乙醇
试剂最终浓度数量
乙醇（绝对）70%70毫升
水分子_不适用30毫升
全部的不适用100毫升

3.0.002M总部
试剂最终浓度数量
总部0.002米0.073克
水蒸气_ _不适用250毫升
全部的不适用250毫升

4.45% GAA
试剂最终浓度数量
GAA45%45毫升
水蒸气_ _不适用55毫升
全部的不适用100毫升

5.氯化钾 ( KCl )
试剂最终浓度数量
氯化钾1M7.5克
水蒸气_ _不适用100毫升
全部的不适用100毫升

6.乙醇 (3 ) :GAA (1)
试剂最终浓度数量
乙醇3 部分75毫升
GAA1 份25毫升
全部的不适用100毫升

7.酶鸡尾酒
试剂最终浓度数量
氯化钾75毫米7.5毫升
纤维素酶2%2.0克
果胶酶2.5%2.5克
果胶酶1%1.0克
乙二胺四乙酸 (0.5 M)7.5毫米1.5毫升
水蒸气_ _不适用91毫升
全部的不适用100毫升

8.1%乙酰地衣碱
试剂最终浓度数量
GAA45%45毫升
奥塞因1%1.0克
水蒸气_ _不适用55毫升
全部的不适用100毫升

致谢

印度班加罗尔印度政府纺织部中央丝绸委员会 (CSB) 的资助 (PIG 06004 SI) 。 Sreya Antony 女士感谢 CSB 提供的初级研究奖学金。我们感谢印度班加罗尔 ICAR-国家农业昆虫资源局前局长Chandish R. Ballal博士的持续鼓励和支持。我们感谢Auxochromofours Solutions Pvt.的 Shreyas M. Burji 先生。有限公司、印度班加罗尔国家生物科学中心 (NCBS) 团队提供流式细胞仪设施， CSGRC-Hosur 的C. Ventakeshappa先生提供技术支持。我们要感谢印度瓦拉纳西贝拿勒斯印度教大学植物学系的Subhankar Biswas对视频编辑提出的建设性建议。我们也感谢三位专家评审员提出的建设性建议/意见。
该协议基于研究论文（ Gnanesh 等人。 2023）。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

参考

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