材料和试剂
1.细胞培养皿（3.5 和 6 厘米）（JET BIOFILT，目录号：CD000035，TCD-010-060） 2.50 mL 离心管（Corning，目录号：430828） 3.15 mL 离心管（Corning，目录号：430790） 4.1.5 mL 管（JET BIOFILT，目录号：CFT000015） 5.聚偏二氟乙烯膜（PVDF）（Bio-Rad，目录号：1620177） 6.细胞玻璃盖玻片（直径：12 毫米，厚度：0.13 – 0.17 毫米）（ Fisherbrand ，目录号：FIS12-545-80 ） 7.新生 Sprague- Dawley (SD) 大鼠 [产后 1 – 2 天 (P1 – P2)] 8.蒸馏水 9.75% 乙醇 10.磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（ Gibco ，目录号：10010023） 11.聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）（Sigma-Aldrich，目录号：P1274） 12.0.25% 胰蛋白酶-EDTA（ Gibco ，目录号： 25200072） 13.胎牛血清（FBS）（康宁，目录号：35-076-CV） 14.DMEM/F12（ Gibco ，目录号：11330057） 15.阿糖胞苷（ Ara -C）（Sigma-Aldrich，目录号：C1768 ） 16.重组人调蛋白β-1 （ PeproTech ，目录号：100-03） 17.毛喉素（Sigma-Aldrich，目录号：F6886） 18.4%多聚甲醛（PFA）（ Biosharp ，目录号：BL539A） 19.二甲基亚砜（DMSO），适用于细胞培养（ Beyotime ，目录号：ST038） 20.二丁酰腺苷 3',5'-环磷酸 ( dbcAMP )（Sigma-Aldrich，目录号：D0627） 21.Triton X-100（ Sigma-Aldrich ，目录号：V900502） 22.Tween-20（ Sigma-Aldrich，目录号：P1379） 23.鬼笔环肽（ Abcam ，目录号：ab176759） 24.RIPA裂解缓冲液（FUDE Biological Technology，目录号：FD009） 25.R a bbit 单克隆 (EP1039Y) 抗p 75（ Abcam ，目录号：ab52987） 26.兔抗 Krox20（Novus Biologicals ，目录号：13491-1-AP） 27.小鼠单克隆抗 c-Jun（BD Biosciences，目录号：610326） 28.小鼠单克隆 (9-9-3) 抗 Sox2（ Abcam ，目录号：ab79351） 29.Alexa Fluor®488山羊抗小鼠IgG （H+L）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A11001） 30.Alexa Fluor ® 568 山羊抗兔 IgG （H+L）（Thermo Fisher Scientific，目录号： A11011） 31.4'，6-二脒基-2'-苯基吲哚（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D8417） 32.青霉素 - 链霉素（ Gibco ，目录号：15140-122） 33.Omni-ECL TM光化学发光试剂盒（ EpiZyme ，目录号： SQ201） 34.10% 十二烷基硫酸钠盐-聚丙烯酰胺凝胶（ EpiZyme ，目录号：PG112） 35.5% 脱脂牛奶（ Solarbio ，目录号：D8340） 36.Tris缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：93318） 37.辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联二抗（Invitrogen，目录号：31430、31460） 38.1,000× Ara -C（10 mM蒸馏水，参见配方） 39.1,000× dbcAMP （1,000 mM在 DMSO 中，参见食谱） 40.30毫米毛喉素原液（参见食谱） 41.大鼠施万细胞的完全生长培养基（见食谱） 42.10% FBS（见食谱） 43.3% FBS（见食谱） 44.1% FBS（见食谱） 45.1毫米 dbcAMP （参见食谱） 46.0.1% Triton X-100（见配方） 47.5% 明胶（见食谱） 48.PBST（见食谱） 49.阻塞缓冲区（参见食谱）设备
1.移液器（ Thermo Fisher Scientific ， 10、200和1,000 μL ） 2.CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号： Heracell 150i) 3.手术剪刀和镊子（深圳 RWD，目录号：S14014 和 F12029-09 ） 4.弹簧剪刀（深圳 RWD，目录号： S11001） 5.超细镊子（深圳 RWD，目录号：F13002） 6.体视显微镜（江南新奇，型号：SZ6060） 7.离心机（ Eppendorf ，型号：Micro21) 8.相差显微镜（蔡司，型号： Primovert ） 9.荧光显微镜（蔡司，型号： Axio Imager A2）

软件
1.ImageJ （版本 1.8.0， https://imagej.en.softonic.com/ ）

程序
A.新生大鼠原代雪旺细胞培养物的制备
1.准备培养板：用 1 mL 的 PLL 溶液（0.1 mg/mL）涂上 3.5 厘米细胞培养皿。在 37°C 的CO 2培养箱中孵育过夜。注意：此时CO 2的百分比并不重要。这一步只是为了增加细胞培养皿的粘附力。 2.第二天，取出 PLL 溶液，用蒸馏水彻底冲洗盘子表面，并在使用前风干。将 1.5 mL 的冷 PBS 移入每个盘子中，然后将它们放在冰上。 3.准备文化媒体和解决方案： (1) 细胞增殖用培养基A（雪旺氏细胞增殖培养基）：DMEM/F12 含3% FBS，3 μM 毛喉素、10 ng /mL调蛋白β-1 和 100 mg/mL 青霉素-链霉素。 (2) 细胞饥饿培养基 B：含有 1% FBS 和 100 mg/mL 青霉素-链霉素的 DMEM/F12。 (3) 用于雪旺细胞分化的培养基 C：含有 1% FBS、100 mg/mL 青霉素-链霉素和 1 mM的 DMEM/F12 数据库营地。 (4) 雪旺细胞去分化培养基 D：含有 1% FBS 和 100 mg/mL 青霉素-链霉素的 DMEM/F12。注意：媒体应在使用前新鲜制作。
B.大鼠脊神经原代雪旺细胞的培养
注：这部分参考了以前的研究（温等人，2017）。 1.准备手术设备（见图1）。

图1。本协议中使用的手术设备
2.组织采集：将新生大鼠置于冰上麻醉2-3分钟，用75%乙醇消毒，用手术剪和镊子断头，将头部放入采集袋中，采集坐骨神经和脊神经用超细镊子。 3.组织消化：用 1 mL PBS 准备一个 1.5 mL 管，并在冰上冷藏。将这些神经转移到 1.5 mL 管中，并用弹簧剪刀将它们切成 1 毫米长的小块；然后，将 1 mL 的预热 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 添加到管中。盖上管子并在 37°C 的 CO 2培养箱中孵育 30 分钟，每 10 分钟间歇性振动一次。 4.离心收集细胞：加入100 μL FBS 停止消化，然后使用 1 mL 移液器将细胞样品轻轻研磨 30 次，以制成单细胞悬浮液。然后，在室温下以100 x g离心细胞悬浮液5 分钟，并弃去上清液。在 DMEM/F12 的 200 μL 10% FBS中重悬细胞沉淀，将细胞悬浮液种植在 PLL 涂层的 3.5 cm 培养皿中间，并在CO 2培养箱中培养细胞 1 – 2 小时以确保细胞附着.在培养皿中加入 1 mL 的 10% FBS，培养细胞 24 小时。注意：此时的细胞悬液是雪旺细胞和成纤维细胞的混合物（见图2A ）。 5.μM的 DMEM/F12 替换培养基 Ara -C（添加 1 μL的 10 mM 每 1 mL 介质的Ara -C 库存溶液）以消除成纤维细胞。 48 小时后，将培养基替换为大鼠雪旺细胞的培养基 A。一只大鼠应获得约 1 × 10 4 个雪旺细胞。当扩增后 100% 汇合时，每个培养皿的雪旺细胞数量应约为 1 × 10 5 – 2 × 10 5 （参见图 2B ）。 6.细胞传代：当培养达到 90%汇合时，用 1 mL PBS 洗涤细胞，弃去 PBS 洗涤液，并在细胞培养皿中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，室温放置 2 分钟。在相差显微镜下观察细胞，同时轻轻摇动培养皿。当细胞开始从培养皿中掉落时，加入1 mL 10% FBS停止消化，将细胞收集于1.5 mL管中，室温100 ×g离心5 min，弃上清，轻轻重悬1 mL 大鼠雪旺氏细胞完全生长培养基中的细胞。 – 1:4的比例传代以扩增，第三代细胞用于进一步实验（参见图 2C ）。

图 2。大鼠雪旺氏细胞的纯化和扩增。 (A) 解剖后 24 小时的细胞；培养物应由雪旺氏细胞和成纤维细胞组成。雪旺细胞具有细长的纺锤形形态，而成纤维细胞非常扁平。 (B) 第 3 天，纯化的雪旺细胞汇合。 (C) 在完全生长培养基中扩增两天并在存在毛喉素和调蛋白β-1 的情况下在完全生长培养基中常规传代到第三代后，培养物中充满雪旺细胞（> 95% 汇合），具有它们特有的双极纺锤形细胞体。
C.雪旺细胞的分化和去分化（图3）
1.种子和饥饿：在 3.5 厘米培养皿中接种 5,000 个雪旺细胞（覆盖玻璃盖玻片，用于免疫荧光分析）或在培养基 A 中在 6 厘米培养皿中接种 1 × 10 5 个雪旺细胞（用于蛋白质印迹分析）以允许快速扩增的细胞群。一天后，取出完整的生长培养基，并在一夜之间用等体积的培养基 B 迅速更换，以适应促有丝分裂刺激的缺乏。注意：含有毛喉素的雪旺细胞完全生长培养基（培养基 A）会诱导雪旺细胞获得分化表型，10% FBS 会诱导雪旺细胞增殖而不是分化。 2.CO 2培养箱中培养细胞72小时。在相差显微镜下观察dbcAMP分化的雪旺细胞的培养物，以在应用去分化处理之前确认预期的形态变化。注意：大约 6 小时后，您可以开始看到大鼠雪旺细胞的形态变化。建议从一开始就包括不含毛喉素和dbcAMP 的培养物作为对照。为了长时间保持雪旺细胞分化，只需使用新的分化条件培养基进行培养基更换即可。 3.去分化：72 小时后，Schwann 细胞响应dbcAMP处理而分化。要诱导去分化，只需将培养基替换为培养基 D，然后将细胞在CO 2培养箱中培养24 小时即可。在dbcAMP退出后的第二天或根据实验设计的需要继续收集或分析培养物。注意： dbcAMP诱导的分化雪旺细胞在暴露于毛喉素和调蛋白β-1等生长因子时不能去分化。因此，建议在整个分化和去分化测定中使用不含毛喉素和heregulin β-1 的培养基。去除dbcAMP后大约 6 小时，近一半的大鼠雪旺氏细胞恢复到双极或三极形状。您可以添加 A 药物或在去分化试验前进行病毒转染。

图 3. 大鼠雪旺细胞的分化和去分化系统。 Schwann 细胞在培养基 A 中扩增数天，之后将第三代细胞以适当的密度重新接种并在培养基 B 中饥饿过夜。第二天，细胞用 1 mM dbcAMP ，可诱导形态学变化和分化标志物的上调，可通过相差显微镜观察、免疫荧光或蛋白质印迹法进行检查。 72 小时后，只需将培养基替换为培养基 D 即可诱导雪旺细胞去分化。 Undiff : 未分化； diff：差异化； De-diff：去分化。

数据分析
A.相差显微镜(图 4A)
1.要识别雪旺细胞的表型，请在相差显微镜下观察它们的形态。 Schwann 细胞用dbcAMP处理以获得分化的表型，其形态从细长的纺锤状形状转变为扁平形状；简单的dbcAMP去除可以将分化的雪旺细胞逆转为细长的双极形态。
B.免疫荧光（图 4B）
1.细胞固定：在室温下用 4% PFA 固定细胞 30 分钟。 2.透化和封闭：用 0.1% Triton X-100（参见配方 8）穿透细胞30 分钟，并与 5% 明胶（参见配方 9）在室温下孵育 1 小时。 3.初级抗体：在 5% 凝胶溶液中制备 1：200 稀释的小鼠抗 c-Jun 和 1：100 的兔抗 Krox20 溶液。在 4°C 下用初级抗体孵育细胞过夜。 4.在 PBST（参见配方 10）二抗中制备 Alexa Fluor ® 488 山羊抗小鼠IgG (H+L) 或 Alexa Fluor ® 568 山羊抗兔IgG (H+L) 1:400 稀释液。用相应的二抗室温孵育细胞2h，用PBST洗涤细胞2次，然后用1μg/mL DAPI室温孵育细胞5min染色细胞核。
C.蛋白质印迹法（图 4C、4D）
1.细胞裂解：将 100 μL的 RIPA裂解缓冲液添加到细胞培养皿中，吹气，并将裂解物收集到 1.5 mL 管中。 2.蛋白电泳：制备10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，每孔吸取10 μg蛋白，电泳参数如下：80 V，300 mA，1.5 h。电泳完成后，小心取出凝胶并将蛋白质转移到 PVDF 膜上。 3.一抗和二抗的孵育：室温下用封闭液封闭2小时后，制备1:800稀释的小鼠抗Sox2和1:500的兔抗p75封闭液溶液，一抗孵育膜抗体在 4 °C 过夜，并在室温下孵育辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的二抗2 小时。 4.TM光化学发光试剂盒可视化膜并使用ImageJ计算蛋白质数量。
图 4. 大鼠雪旺细胞表型的鉴定。 (A)在显微镜下观察用鬼笔环肽染色的细胞形态和细胞骨架。 (B) c-Jun（表示未成熟或去分化的雪旺细胞）和 Krox20（表示成熟或分化的雪旺细胞）的免疫荧光。 (C, D) Sox2 和 p75 的蛋白质印迹分析和数据统计（表示未成熟或去分化的雪旺细胞）。 Undiff : 未分化； diff：差异化； De-diff：去分化。

食谱
1.1,000×阿拉-C 将 4.86 mg Ara -C 溶解在 2 mL 蒸馏水中，制成 1,000 × 10 mM的储备溶液，并通过过滤对溶液进行灭菌。储存于 -20℃ 。
2.1,000× dbcAMP 将 50 mg 的dbcAMP溶解在 101.756 μL的蒸馏 DMSO 中，制成 1,000 × 1,000 mM的库存溶液，并储存在-20 °C。
3.30毫米毛喉素原液将 10 mg毛喉素溶解在 812 μL蒸馏DMSO中，制备 30 mM 毛喉素原液。储存在-20°C。
4.大鼠施万细胞完全培养基 48.5 mL 的 DMEM/F12 包含 1.5 mL 的 FBS，3 μM 毛喉素、10 ng /mL调蛋白- β-1 和 100 mg/mL 青霉素-链霉素。
5.10% 胎牛血清 45 mL DMEM/F12 含有 5 mL FBS，辅以 1%青霉素-链霉素。
6.3% 胎牛血清 48.5 mL DMEM/F12 含有 1.5 mL FBS，辅以 1% 青霉素-链霉素。
7.1% 胎牛血清 49.5 mL DMEM/F12 含有 0.5 mL FBS，辅以 1%青霉素-链霉素。
8.1毫米 dbcAMP 将 1 μL的1,000× dbcAMP （1,000 mM ）添加到 1 mL 的 1% FBS 中。
9.0.1% 海卫 X-100 将 1 mL 的 Triton X-100 稀释到 1,000 mL 的 PBS 中。
10.5% 明胶将 0.5 克明胶溶解在 10 mL 的 PBS 中。在缓冲液中加入 300 μL的 Triton X-100 (0.3%)。
11.PBST 将 1 mL 的 Tween-20 添加到 1,000 mL 的 PBS 中。在室温下储存。
12.阻塞缓冲区含 0.5% Tween-20 的Tris缓冲盐水中的 5% 脱脂牛奶

致谢
该协议改编自之前发表的论文(Zou et al., 2022)和 (Wen et al., 2017)。感谢贾松教授郭（南方医科大学，中国广州）。

伦理
所有涉及动物的程序都是在暨南大学（中国广州）动物护理和使用委员会的批准下根据动物伦理治疗指南进行的。

参考
Arthur- Farraj , P.、 Wanek , K.、 Hantke , J.、Davis, CM、 Jayakar , A.、Parkinson, DB、 Mirsky , R. 和Jessen , KR (2011)。小鼠雪旺细胞需要 NRG1 和环状 AMP 才能形成髓鞘。胶质细胞59(5)：720-733。 Cristobal, CD 和 Lee, HK (2022)。髓鞘胶质细胞的发育：概述。胶质细胞70(12)：2237-2259。 Jessen , KR 和Mirsky , R. (2019)。雪旺细胞对神经损伤反应的成功与失败。前细胞神经科学13：33。 Nocera , G. 和 Jacob, C. (2020)。雪旺细胞可塑性参与损伤后周围神经修复的机制。细胞分子生命科学77(20): 3977-3989。 Wen, J.、Tan, D.、Li, L. 和Guo , J. (2017)。从新生大鼠脊髓神经中分离和纯化雪旺氏细胞。生物协议7(20)：e2588。 Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Hamasaki , H., Sanbe , A., Kusakawa , S., Nakamura, A., Tsumura, H., Maeda, M., Nemoto , N., Kawahara, K., Torii, T. 和Tanoue , A. (2011)。非典型鸟嘌呤-核苷酸交换因子 dock7 负向调节雪旺细胞分化和髓鞘形成。 J Neurosci 31(35)：12579-12592。 Zou , Y., Zhang, J., Liu, J., Xu , J., Fu, L., Ma, X., Xu , Y., Xu , S., Wang, X. and Guo , J. ( 2022 年）。 SIRT6 在周围神经损伤后沃勒变性过程中通过靶向 c-Jun 负向调节雪旺细胞去分化。摩尔神经生物学59(1)：429-444。