材料和试剂
1.0.70 μ m过滤器 2.2 毫升注射器 3.28号针 4.Falcon 锥形离心管，15 mL（Corning，目录号：352095） 5.微量离心管，1.5 mL（Sigma Aldrich，目录号：HS4323） 6.C57BL/6J 小鼠，CD45.2 +供体（杰克逊实验室，品系#：000664） 7.B6.SJL 小鼠，CD45.1 +同类受体（杰克逊实验室，品系#：002014） 8.Matrigel基质基底膜（Corning，目录号：354234） 9.CellStripper解离溶液（Corning，目录号：25-056-CI） 10.胰蛋白酶-EDTA，0.05%（ Gibco ，目录号：25300062） 11.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，目录号：21-040） 12.RPMI 1640 培养基（ Gibco ，目录号：11-875-093） 13.胎牛血清 (FBS)，热灭活（ Gibco ，目录号：10-082-147） 14.10 cm 组织培养处理板（Corning，目录号：CLS430167） 15.台盼蓝溶液（ Gibco ，目录号：15250061） 16.Lewis 肺癌细胞（ATCC，目录号：CRL-1642）注意：例如，我们移植了 Lewis 肺癌细胞；有关更多信息，请参阅程序部分 B。请利用先前描述的生物协议手稿进行 C57BL/6J CD45.2 +供体小鼠的 BMDM 分化和培养： Zanoni等人。 (2012)，哈格和穆尔蒂(2021)。

设备
1.台式离心机（例如， Kendro Sorval传说 RT) 2.微量离心机（例如， Eppendorf冷藏微量离心机5415R） 3.°C水浴（例如，Thermo Scientific PRECISION 水浴） 4.°C和 5% CO 2的培养箱（例如，Thermo Scientific HERACell 150i CO 2培养箱） 5.层流罩（例如，The Baker Company， SterilGARD II 级生物安全柜） 6.细胞提升器（VWR，目录号：76036-006） 7.数显卡尺（VWR，目录号：62379-531）

程序
A.准备
1.预热 RPMI 1640 培养基、PBS、FBS、胰蛋白酶-EDTA 和CellStripper解离溶液在水浴中设置为 37 摄氏度。 2.在冰上解冻Matrigel基质基底膜。提示： Matrigel在室温下会过早凝固，因此在使用前必须小心确保它保持液态。 3.制作清洗介质：RPMI 1640 介质 + 5% FBS 。 4.制作注射液：PBS + 5% FBS。
B.肿瘤细胞系采集
注意：大多数小鼠肿瘤细胞系可能适用于该模型，但这应该通过使用B6.SJL 受体小鼠的优化研究来预先确定。注射当天，肿瘤细胞应在 10 cm 组织培养板中并处于对数生长期（约 5.0 × 10 6 – 7.0 × 10 6 ）。虽然每次注射 5.0 × 10 5 个肿瘤细胞是我们推荐的基线，但应根据细胞系的体内增殖率和所需的肿瘤生长时间来优化这个数字。 1.用 10 mL 的 PBS 清洗板两次，每次清洗后吸出 PBS。 2.将 3 mL 胰蛋白酶-EDTA 添加到每个板中，并放置在培养箱中 3-5 分钟。 3.将细胞转移到新鲜的 Falcon 管中。 4.用 5 mL 的洗涤介质清洗板两次，并将洗涤液添加到 Falcon 管中。 5.× g离心 5 分钟并吸出上清液。 6.用 10 mL 洗涤液重悬细胞沉淀。 7.重复步骤 B5 和 B6。 8.μ m过滤器将细胞悬浮液过滤到新鲜的 Falcon 管中。 9.使用细胞计数器或其他标准方法对台盼蓝溶液中的细胞进行计数。 10.× g离心 5 分钟并吸出上清液。 11.在 Falcon 管中将细胞重悬至 4 × 10 6 个细胞/mL，并将肿瘤细胞置于冰上。提示：肿瘤细胞收集可以与 BMDM 收集（C 部分）同时进行，以提高效率并减少肿瘤细胞在冰上保存的时间。
C.骨髓来源的巨噬细胞 (BMDM) 收集
注意：BMDM 需要来自 C57BL/6J CD45.2 +供体小鼠。注射前 BMDM 极化的长度应根据极化方法和实验研究（即 M1 与 M2 极化、小分子抑制剂治疗或转基因操作）进行优化。例如：我们使用了来自 C57BL/6J CD45.2 +供体小鼠的 BMDM 转基因模型，这些小鼠用 IL-4 极化 24 小时（ Noe等人，2021）。在注射当天，BMDM 应具有高活力 (>90%)，由台盼蓝排除法确定，每次注射需要2.0 × 10 5 BMDM。 1.在层流罩中，用 10 mL 的 PBS 清洗板两次，每次清洗后吸出 PBS。 2.添加 3 mL 的CellStripper 将解离溶液添加到每个板中，然后放入培养箱中 3-5 分钟。 3.用细胞升降器轻轻提起 BMDM，并将细胞转移到 Falcon 管中。提示：避免积极刮擦 BMDM 或使用胰蛋白酶代替细胞剥离器，因为这会导致 BMDM 活力降低。 4.用 5 mL 的洗涤介质清洗板两次，并将洗涤液添加到 Falcon 管中。 5.× g离心 5 分钟并吸出上清液。 6.用 10 mL 洗涤液重悬细胞沉淀。 7.重复步骤 C5 和 C6。 8.μ m过滤器将细胞悬浮液过滤到新鲜的 Falcon 管中。 9.使用细胞计数器或其他标准方法对台盼蓝中的细胞进行计数。 10.× g离心 5 分钟并吸出上清液。 11.在 Falcon 管中将细胞重悬至 1.6 × 10 6 个细胞/mL，并将 BMDM 置于冰上。
D.肿瘤-BMDM 混合物
注意：应事先进行有限的优化研究以确定首选的肿瘤细胞：BMDM比率。作为基线，我们发现 2.5:1 的比例可提供有意义的数据（Liu 等人，2020 年； Noe等人，2021 年），但结果可能因致瘤潜力、免疫原性和其他实验条件而异。每个 2 mL 管可容纳 3 次肿瘤注射（1.5 mL 注射 + 0.5 mL 斜液；应事先确定肿瘤注射所需的体积）。为获得最佳效果，应在注射前立即执行以下步骤。目前，我们描述了一种利用皮下注射的异位模型。在某些癌症亚型中，根据使用的是原位模型还是异位模型，会出现不同的治疗反应（ Erstad等人，2018 年）。我们预计这种混合模型可以适应原位方法，但这可能需要事先进行彻底的优化。

每 2 mL微量离心管：3 次进样（500 μ L / 次）+ 500 μ L额外体积： 1.混合肿瘤细胞悬浮液，等分 500 μ L到新鲜的微量离心管中，并置于冰上。 2.混合 BMDM 悬浮液，等分 500 μ L到同一个微量离心管中，混合均匀，然后置于冰上。 3.在注射前，将 1 mL基质胶等分到微量离心管中，混合均匀，然后置于冰上。 4.将 500 μ L混合物吸入 2 mL 注射器中，并放置 28 号针头。提示：同样， Matrigel会在室温下过早凝固。可能需要在绘制混合物之前在冰上预冷注射器，并在两次注射之间将注射器放在冰上。 5.将 500 μ L皮下注射到B6.SJL受体小鼠的侧面。提示：可以在注射前剃除侧腹，以增加注射或后续测量期间的可见度。注射后，将针头留在原位 1-3秒，以防止从插入部位泄漏。应注意任何明显的泄漏，这可能代表注射失败。 6.使用新的注射器，对每个顺序鼠标重复步骤 D4 和 D5。
E.下游分析
注意：注射后，可以进行多种实验操作和/或下游分析。小分子抑制剂或生物制剂的作用可以通过在预定时间点施用这些药物来检验。一旦达到肿瘤终点，就可以通过先前描述的方案获取脾脏、血液和肿瘤，使用流式细胞仪进行免疫表型分析（ Almeida 等人，2021 年）。至少应测量肿瘤生长和终点重量以确定肿瘤发生的总体变化，如下所述。 1.监测小鼠的肿瘤生长情况，以表明注射成功。 2.一旦肿瘤明显（大约第 5-7 天），每 2-3 天用外部卡尺测量一次肿瘤的长度和宽度。 3.使用以下公式记录长度和宽度以计算肿瘤体积：（长度×宽度2 ）/ 2。 4.一旦达到肿瘤终点，对小鼠实施安乐死、切除肿瘤并测量体重（图 1）。 5.如果需要，继续进行下游分析。

图 1. 肿瘤混合模型增强了肿瘤的生长。注射 Lewis 肺癌 (LLC) 细胞加 M2 极化骨髓衍生巨噬细胞 (BMDM)（上图）或单独的 LLC 细胞（下图）后 16 天，小鼠肿瘤的大体解剖图。大小差异代表每个队列中肿瘤大小的可变性。请参考Noe等人。 (2021) 对肿瘤生长曲线和终点肿瘤重量进行更全面的分析。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院 (NIH)博士前奖学金 F30CA232550（给 JTN）、NIH 研究资助 R01CA186661（给 RAM）、NIH 研究资助 GB130096P3（给 RAM）和 NIH 项目资助 P20GM135004（给 JY 和 RAM）的支持.该协议源自原始研究论文（ Noe等人，2021 年；DOI：10.1126/sciadv.abi860）。

利益争夺
作者声明没有竞争利益。

伦理
动物在特定的无病原体条件下饲养，并根据实验室动物护理评估和认证协会国际指南进行处理。路易斯维尔大学的机构动物护理和使用委员会批准了这些实验。

参考
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