材料和试剂

1.5 mL Eppendorf 管
96 孔微孔板，平底，透明（Greiner Bio-One，目录号：655101）
Multiplate TM 96 孔 PCR 板，薄型，透明（Bio-Rad，目录号：MLL9601）
感兴趣的细胞系和适当的培养基/培养试剂
用于 C 环阳性对照/标准曲线 DNA 来源的 ALT 阳性细胞系 [例如，U2OS（ATCC，目录号：HTB-96）、Saos-2（ATCC，目录号：HTB-85）]
用于 C 环阴性对照 DNA 来源的端粒酶阳性细胞系 [例如，HeLa（ATCC，目录号：CCL-2）、HCT116（ATCC，目录号：CCL-247）]
Tris 碱基（Fisher Scientific，目录号：BP152）
氯化钾（ KCl ）（Fisher Scientific，目录号：BP366）
六水氯化镁（MgCl 2 ·6H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：M35）
NP-40（也称为 IGEPAL® CA -630）（Sigma-Aldrich，目录号：I3021）
吐温 20（也称为聚山梨酯 20）（Fisher Scientific，目录号：BP337）
去离子、无核酸酶的 H 2 O [使用 Q-Gard® 2 纯化柱（Sigma-Aldrich，目录号：QGARD00D2）纯化]
蛋白酶（7.5 AU）（QIAGEN，目录号：19155）
QuantiFluor ® ONE dsDNA 系统（Promega，目录号：E4871）
Φ29 DNA聚合酶【包括10 × Φ29反应缓冲液和20 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）；新英格兰生物实验室，目录号：M0269）
dNTP 组（每个 dNTP 100 mM）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：R0181）
UltraPure TM二硫苏糖醇（Invitrogen，目录号：15508013）
iQ TM SYBR ® Green Supermix （Bio-Rad，目录号：1708880）
C 环引物（人和小鼠）
正向：5' - CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3 '
反向：5' - GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3 '
36B4 引物（人）
正向：5' - CAGCAAGT GGGAAGGTGTAATCC-3 '
反向：5' - CCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3 '
36B4 引物（小鼠）
正向：5' - ACTAATCCCGCCAAAGCAACC-3 '
反向：5' - GTAGCGGTTTTGCTTTTTCATCCT-3 '
快速 C 环制备 (QCP) 裂解缓冲液 (1 × )（参见配方）
1 M Tris-HCl，pH 8.5（参见配方）
Φ29 DNA 聚合酶预混液 (2.16 × )（见食谱）

设备

酶标仪（Promega GloMax® Explorer 多模式酶标仪；目录号：GM3500 ）
RCA 热循环仪（ MJ Mini TM个人热循环；Bio-Rad，目录号：PTC1148）
用于 qPCR 的热循环仪 [Bio-Rad C1000 Touch TM热循环仪底盘（Bio-Rad，目录号：1841100）配备用于实时 PCR 的 CFX96 光学反应模块（Bio-Rad，目录号：1845097）]

软件

用于 CFX 实时 PCR 仪器的 CFX Maestro 软件（Bio-Rad； https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-maestro-software-for-cfx-real-time-pcr-instruments ?ID=OKZP7E15 )
微软 Excel 2019 (v16.0)

程序

以下协议针对 2 × 10 5 个细胞进行了优化；然而，我们已经成功地使用此协议来分离和量化具有多达 5 × 10 5 个细胞的 C 环。如果调整细胞数量，所有体积都应适当缩放。我们已经成功地量化了 ALT 阳性人类中的 C 环丰度（Robinson et al., 2021)和小鼠(Robinson 等人，2020 年）从不同的 2D 和 3D 培养条件以及经过一系列遗传和药理学操作的细胞中分离出来的细胞。因此，在我们手中，这代表了在不同体外条件下进行 C 环定量的通用协议。因此，此处不包括有关细胞系和培养条件的具体细节，除非注明为实验对照。
注意：建立的 ALT 和端粒酶阳性细胞系（见材料和试剂）应与感兴趣的细胞系平行培养。这些用作标准曲线生成 (ALT) 的 DNA 来源，以及用于 RCA 和 C 环定量的阳性 (ALT) 和阴性（端粒酶）对照。根据我们的经验，当同时分离所有 DNA（包括对照）时，结果最好。这样做可以防止 DNA 在储存过程中降解，或者在实验之间共享的样品（例如，阳性和阴性对照）反复冻融循环。

使用快速 C 环制备 (QCP) 从培养细胞中分离 DNA

在 1.5 mL Eppendorf 管中预热 1 × QCP 裂解缓冲液（参见配方 1），加热块或水浴设置为 56 摄氏度。当 QCP 裂解缓冲液为每个实验新鲜制作时，可获得最佳结果。所需的 QCP 裂解缓冲液体积 = 50 μL × （样本数 + 2）（包括过量以解决移液错误或蒸发损失）。
如果冻干，将蛋白酶 (7.5 AU) 重悬于 7 mL 去离子、无核酸酶的 H 2 O 中。彻底混合并置于冰上直至使用。如果之前重新悬浮，请从 -20 °C存储中取出并在冰上缓慢解冻。
注意：QIAGEN 蛋白酶优于其他蛋白酶，因为它可以在 65 °C下热灭活。
从培养板中释放细胞（例如，胰蛋白酶消化，来自 3D 培养的非酶消化）或从冷冻储存中取出细胞并置于冰上。在这个阶段，样品应该是细胞沉淀而不是悬浮液。
μL蛋白酶与 50 μL QCP 裂解缓冲液）将蛋白酶添加到预热的 QCP 裂解缓冲液中。通过涡旋彻底混合并通过微量离心收集。这应该在细胞重新悬浮之前立即完成。
将每个细胞颗粒重新悬浮在 50 μL的 QCP 裂解缓冲液中，辅以蛋白酶。以 2,000 rpm 的速度涡旋混合15 秒。悬浮液是粘性的，可能需要通过上下移液器进行额外混合。小心不要在重新悬浮过程中引入气泡。
注意：与纯环状 DNA 相比，与基因组 DNA 混合的 C 环（即在全细胞裂解物中）在某种程度上受到剪切力的保护。虽然通过涡流混合样品是可以接受的并在整个协议中使用，但重复涡流会导致小但可观的 C 圆损失（每 15 秒涡流 <1%）。如果在定量过程中产量似乎较低，则可以调整涡流速度或频率以最大限度地减少 C 环损失。
°C下在热块上孵育细胞悬浮液1 小时。样品应每 15-20 分钟涡旋混合15秒。
将热块的温度提高到 70 °C ，孵育 20 分钟以使蛋白酶失活。在此步骤中不需要混合样品。
让样品在工作台上缓慢冷却至室温。冷却后，以 2,000 rpm 的速度涡旋混合15 秒，并通过微量离心收集任何蒸发的液体。
样品可立即用于 DNA 定量和 RCA。否则，在干冰上快速冷冻并储存在 -80 °C 。

总细胞 DNA 的定量

根据制造商的说明，对QuantiFluor ® ONE Lambda DNA (400 ng/ μL )（来自QuantiFluor ® ONE dsDNA 系统）进行连续稀释以生成 dsDNA 标准品。最终 DNA 浓度为：400、200、50、12.5、3.1、0.8 和 0.2 ng/ μL 。
在 96 孔微孔板中，将 200 μL QuantiFluor ® ONE dsDNA染料转移到将包含标准品、实验样品或空白（即背景荧光）的每个孔中。每个标准品、样品和空白应一式两份进行分析。
使用 P2 移液器，将步骤 B1 中制备的每个实验样品或 dsDNA 标准的 1 μL转移到相应的孔中。对于空白孔，添加 1 μL的 1 × TE 缓冲液。
使用摇板器彻底混合板，或使用多通道移液器吸取每个孔中的内容物。如果使用移液器，请勿吸取每个孔的全部体积，并缓慢弹出以避免引入气泡，气泡会干扰荧光检测。
在室温下孵育板 5 分钟，避光。
使用读板器测量荧光。如果使用GloMax ®系统，请选择预加载的协议“ QuantiFluor ONE dsDNA 系统”。否则，请使用以下激发和发射参数：分别为 504 和 531 nm。
要计算每个实验样品的 DNA 浓度，首先从每个标准和样品中减去空白荧光。使用 dsDNA 标准的这些校正值生成荧光强度与 DNA 浓度的标准曲线（即 x 轴上的 DNA 浓度和 y 轴上的荧光）。使用标准曲线方程确定每个样本的 DNA 浓度（图 1）。

图 1. QuantiFluor ® ONE Lambda DNA 的代表性标准曲线。标准曲线方程（左上）用于使用测量的吸光度计算实验样品中的 DNA 丰度。一式两份分析每个 DNA 浓度并绘制图表。

染色体外 DNA 的滚环扩增 (RCA)

配制Φ29 DNA 聚合酶预混液（参见配方 3），如果不立即使用，将等分试样储存在 -20 °C 。我们在初次冷冻后使用了长达一个月的冷冻主混合物，对 RCA 效率没有明显影响。
如果解冻 QCP 样品，请放在冰上缓慢解冻。解冻后，以 2,000 rpm 的速度涡旋混合15 秒，然后通过微量离心收集。在设置 RCA 反应时将样品和预混液保存在冰上。
对于使用 QCP 分离的样品（包括 ALT 阳性和 ALT 阴性对照），在两个 0.2 mL PCR 管中添加 1 μL至 9 μL的 10 mM Tris，pH 7.6。根据每个样品的浓度，它们可能会在 10 mM Tris，pH 7.6 中稀释，以避免移液小体积。但是，每个反应中 QCP 缓冲液的总量必须相同，且不应超过 1 μL 。
将每个反应的 9.25 μL Φ29主混合物（加上过量，即足以进行两个额外反应）等分到 Eppendorf 管中。
°C存储中取出Φ29 DNA 聚合酶，并放在冰上或便携式冷却块中。每次反应（加上过量）添加 0.75 μL聚合酶到含有主混合物的管中，以生成最终反应混合物。轻轻轻弹试管并置于冰上进行混合。
注意：相对于模板使用过量聚合酶以确保环状 DNA 的线性扩增（而不是对数，这可能会混淆比较分析）。如果其他聚合酶（例如， DNA 聚合酶 I 的Klenow片段）具有与Φ29聚合酶一样的持续合成能力和链置换能力，则可以使用它们。
重复步骤 C4，分装到新的 Eppendorf 管中。每次反应向该管中加入 0.75 μL Milli-Q H 2 O。这作为Φ29缺陷反应的最终反应混合物，对每个样品进行。
注意：可以通过对每个样品并行运行Φ29缺陷 RCA 反应来校正样品特定背景。这对于 qPCR 的 C 环定量很重要，因为 PCR 期间的变性能够检测线性端粒 DNA。此外，包含Φ29缺陷对照对于 ALT 活性较低或未知的样品特别有用，因为这些样品可能表现出相对较高的背景信号。
将 10 μL的最终反应混合物（含Φ29和Φ29不足）添加到包含每个 QCP 样品的一个管中。通过轻轻涡旋（<1,500 rpm）混合 5 秒。
根据以下热曲线在热循环仪中孵育试管：
30 °C 4 – 8 小时 (RCA)。
注意：增加放大时间会增加灵敏度，但会降低线性度。如果已知或预计绝对 C 环丰度很高，则 4 小时足以进行扩增。如果 C 环丰度较低或未知，则应将孵育时间增加至 8 小时以最大限度地提高灵敏度。反应不应延长超过 8 小时，因为此时放大变得非线性。
70 °C 20 分钟（ Φ29失活）。
4 °C 。
通常，我们执行 RCA 8 小时，并允许在一夜之间运行。样品在 4 °C下稳定，直到第二天早上方便收集。
通常，我们立即使用 RCA 反应进行 C 环定量。然而，反应也可以在 -20 °C下储存长达两周或在 -80 °C下储存长达一个月而不会出现明显的 DNA 损失。

使用 qPCR 测定 C 环丰度

将 SYBR ® Green Supermix和引物从 -20 °C冰上储存解冻。避光保护 SYBR ® Green Supermix 。
每个样本将用于量化 C 环丰度以及单拷贝基因核糖体蛋白侧茎亚基 P0（也称为 36B4；参见材料和试剂）的丰度。单拷贝基因丰度提供了总 DNA 含量的度量，可用于标准化 C 环丰度并进行比较分析（参见数据分析）。因此，所有后续步骤都应说明将测量两个目标的事实（例如，制作足够的预混液）。
通过 QCP 稀释从 ALT 阳性细胞系（例如 U2OS、Saos-2）分离的 DNA，以获得用于生成标准曲线的样本。例如，对于 3.2 ng/ μL的起始 DNA 浓度，对包含 3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 和 0.1 ng/ μL DNA 的最终稀释系列执行五次两倍连续稀释。为说明端粒 DNA 和 36B4 之间 PCR 效率的差异，每个样本将针对每个靶标一式两份进行分析。将稀释的样品放在冰上，直到准备好加载 PCR 板。
注意：在稀释和生成标准曲线之前不需要 RCA。
根据表 1 中概述的配方组装 qPCR 主混合物。除了含有Φ29和缺乏Φ29的 RCA 反应外，还包括无模板控制（使用 H 2 O 代替模板 DNA）来解释 PCR 的 DNA 污染试剂。此无模板控制的C t值应至少比标准曲线上最低浓度的C t值大四个循环。

表 1. qPCR 主混合物的配方。
试剂终浓度体积 ( μL )
2 × SYBR ® Green超级混合液 1 × 12.5
正向底漆 (10 m M) 500纳米 1.25
反向底漆 (10 m M) 500纳米 1.25
RNase-free H 2 O - 6个

使用 B 部分中计算的浓度，将每个 RCA 样品在 10 mM Tris，pH 7.6 中稀释至 0.5 ng/ μL。
注意：qPCR 受 Φ29 聚合酶和 RCA 的无机焦磷酸副产物的抑制。为避免 qPCR 抑制，限制添加到每个 qPCR 反应的 RCA 反应或用焦磷酸酶预处理每个 RCA 样品。鉴于 qPCR 的灵敏度，通常最好将添加的未稀释 RCA 反应的数量限制在 qPCR 反应体积的 <5%。
将 4 μL （即 2 ng）模板 DNA（含Φ29或缺失Φ29 ）或无 RNase H 2 O（用于无模板对照）添加到 96 孔 PCR 板的预先指定的孔中。每个样品应一式三份进行分析。
2 O 的每个孔中加入 21 μL的 qPCR 预混液。通过轻轻涡旋板 5 秒进行混合，并通过离心收集体积。
根据以下热曲线在实时热循环仪中孵育板：
95 °C 15 分钟
95 °C 15 秒
54 °C 2 分钟
72 °C 1 分钟
重复步骤 b – d 34 次

数据分析

要构建端粒 DNA 和单拷贝基因标准曲线，请在 Microsoft Excel 中为六个标准 DNA 浓度的每个副本绘制 C t （y 轴）与 DNA 浓度（x 轴；对数刻度）。通过将最佳拟合线拟合到数据来绘制标准曲线（图 2）。标准曲线应具有良好的线性（ R 2 > 0.98， p < 0.05）。
此外，CFX Maestro 软件可用于绘制标准曲线以计算 qPCR 效率，它描述了在每个 PCR 循环中产生了多少目标扩增子。要在 CFX Maestro 软件中构建标准曲线，请在板设置（设置→板设置→查看/编辑板).此外，手动输入每个标准孔中的 DNA 浓度。标准曲线以及计算出的效率现在将出现在“定量”选项卡下。对于 C 环丰度 (CCA) 定量，效率应接近 100% (± 5%)。
单拷贝基因的所有 C t值，以确定任何异常高或低的值，这可能分别表示意外的拷贝数丢失或增加。继发于拷贝数改变的差异可能会使 CCA 的定量评估和 ALT 状态的分配复杂化，并且需要用另一个单拷贝基因重复 qPCR。

图 2. Saos-2 DNA 的代表性标准曲线。使用端粒特异性 qPCR 引物获得C t值。标准曲线方程（左下）用于使用样品特异性 Ct值计算实验样品中的 DNA 丰度¬，并对单拷贝基因进行重复。一式两份分析每个 DNA 浓度并绘制图表。

qPCR 获得的C t值，使用适当的标准曲线方程确定每个复制的相对端粒含量（TC）和相对单拷贝含量（SC）。该计算将提供总 TC（即染色体和染色体外）而不是具体的 C 环含量。
计算每个样本的平均值 (μ) TC 和 SC 以及标准偏差 (σ)。使用这些值根据以下内容计算每个样本的变异系数 (CV)：

CV=σ/μ

Φ29 ）的 CV应小于 15%，而 TC（ Φ29不足）和 SC 的 CV 应小于 10%。
通过将平均 TC 除以同一样本的平均 SC 来计算标准化端粒含量 (NTC)。 NTC 的 CV 估计为给定样本的 TC 及其匹配 SC 的 CV 之和。
根据以下计算每个样本中的共同国家评估：

CCA=〖NTC〗_Φ29-〖NTC〗_(No Φ29)

计算每个实验条件的平均 NTC。使用这些平均值和步骤 4 中计算的 NTC CV 为 CCA 构建误差条，如下所示：

Upper error=(μ_Φ29+〖CV〗_Φ29 )-(μ_(No Φ29)-〖CV〗_(No Φ29) )= (μ_Φ29-μ_(No Φ29) )+(〖CV〗_Φ29+〖CV〗_(No Φ29) )
Lower error=(μ_Φ29-〖CV〗_Φ29 )-(μ_(No Φ29)+〖CV〗_(No Φ29) )= (μ_Φ29-μ_(No Φ29) )-(〖CV〗_Φ29+〖CV〗_(No Φ29) )

在条形图上绘制每个条件的 CCA 平均值（第 5 步）和误差（第 6 步）。如果比较组，请使用适当的统计检验来比较均值（即，两种均值的学生 t 检验，两种以上均值的方差分析，或非参数等价物）。
为每个实验组分配 TMM 标识。一个组被认为是 ALT 阳性，如果 ( i ) 它的 CCA 平均值是 >1% 的 ALT 阳性对照； (ii) 它的 CCA 下误差是非负的。

食谱

快速 C 环制备 (QCP) 裂解缓冲液 (1 × )
库存试剂终浓度体积（每 100 毫升）
1 M Tris-HCl，pH 8.5 10毫米 1毫升
5 百万氯化钾 50毫米 1毫升
1 百万氯化镁2 2毫米 200微升_
NP-40 0.5%（体积比） 500微升
吐温20 0.5%（体积比） 500微升
Milli-Q H 2 O - 96.8 毫升

1 M Tris-HCl，pH 8.5
对于 100 mL，将 12.11 g Tris 碱溶解在 80 mL Milli-Q H 2 O中。
通过在连续搅拌下滴加浓 HCl 将 pH 值调节至 8.5。
2 O将体积调至 100 mL。

Φ29 DNA聚合酶预混液（2.16×）
库存试剂终浓度体积（每 925 μL ）
10 × Φ29反应缓冲液 2.16 × 200微升
20 毫克/毫升牛血清白蛋白 432微克/毫升 20微升
吐温 20（10% v/v，在 H 2 O 中） 0.216% (体积/体积) 20微升
100 毫米dATP 2.16毫米 20微升
100 毫米dGTP 2.16毫米 20微升
100 毫米 dTTP 2.16毫米 20微升
100 毫米dCTP 2.16毫米 20微升
1 M 二硫苏糖醇 8.65 毫米 8微升
Milli-Q H 2 O - 597微升

致谢

我们感谢原始研究论文的所有作者（M. Miyagi、JA Scarborough、JG Scott 和 DJ Taylor），该研究论文源自该协议（Robinson 等人，2021 年）感谢他们对这项工作的贡献，包括该协议的设计和实施。我们还感谢Schiemann实验室的成员在起草和批判性地评价这份手稿方面提供的帮助。美国国立卫生研究院向 WPS (CA236273) 和 NJR (F30 CA213892) 提供了资金支持。凯斯综合癌症中心的研究创新基金慷慨地为 WPS 提供了额外的支持，该基金得到凯斯综合癌症中心委员会和凯斯综合癌症中心之友的支持。

利益争夺

作者声明他们没有竞争利益。

参考

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