材料和试剂
1.15 mL Falcon 管（Corning，目录号：430791 或同等产品）
2.50 mL Falcon 管（Corning，目录号：352070 或同等产品）
3.U 形底 96 孔板（Corning ，目录号： 353227）
4.硅胶母模（辅助材料中提供 CAD 设计）
5.Channelrhodopsin-2 ( CHR2)-YFP+ 人类 PSC-运动神经元（+推荐原代或 PSC-星形胶质细胞） ( Paredes-Redondo 等。 , 2021 ;哈雷等， 2022 ）。 Lieberam和 Lin 小组对相关细胞的请求须经与生成它们的机构签订的材料转让协议的批准。
6.人类 PSC-肌原性祖细胞( Paredes-Redondo 等。 , 2021 ;哈雷等， 2022 ）。 Lieberam和 Lin 小组对相关细胞的请求须经与生成它们的机构签订的材料转让协议的批准。
7.聚二甲基硅氧烷 (PDMS)（道康宁公司，Sylgard-184，目录号： 4019862）；室温避光保存 (RT)
8.NOA-73（Norland 产品，目录号： NOA73）； RT避光保存
9.Triton X-100（ Thermo Fisher ，目录号： 85111）
10.生长因子降低（GFR）基质胶（Corning ，目录号： 356238）；储存在-20°C
11.Lipidure （ Amsbio ，目录号： CM5206）；在室温下于黑暗中将 0.5% 溶液储存在 100% 乙醇中
12.TrypLE （Gibco ，目录号： 12605010）；储存在 4 °C
13.Accutase （Gibco ，目录号： A1110501）；储存在 4 °C
14.DNase-I（罗氏，目录号： 10104159001 ）；储存在 4 °C
15.来自牛血浆的纤维蛋白原（Sigma ，目录号： F8630）；储备溶液 24 mg/mL 0.9% NaCl；储存在-80°C
16.来自牛血浆的凝血酶（Sigma ，目录号： 9002-04-4）；储存在-80°C
17.牛血清白蛋白 (BSA) 级分 V（Roche ，目录号： 10735078001），溶解在 D-PBS（ Gibco ，目录号： 14190250 ）中，得到 5% 储备液，然后无菌过滤。储存在 4 °C
18.1 M CaCl 2溶液（Sigma ，目录号： 10043-52-4）；储存在室温

19.1,000 ×抗氧化剂补充剂（Sigma ，目录号： A1345）；储存在 4 °C
20.DMEM/F-12（Gibco ，目录号： 11320033）
21.高级 DMEM/F-12（Gibco ，目录号： 12634028）
22.Neurobrew-21（美天宜 Biotec ，目录号： 130-093-566）
23.骨骼肌细胞生长培养基（图 4 中的 M2）（ PromoCell ，目录号： C-23060）
24.N2 补充剂（Gibco ，目录号： 17502001）
25.L-谷氨酰胺（Gibco ，目录号： 25030149）
26.青霉素/链霉素（Gibco ，目录号： 15140122）
27.β-巯基乙醇（Gibco ，目录号： 21985023）
28.胰岛素-转铁蛋白-硒（Gibco ，目录号： 41400045）
29.GDNF（原液 100 µg/mL； PeproTech ，目录号： 450-10）
30.BDNF（原液 100 µg/mL； PeproTech ，目录号： 450-02）
31.小鼠 IgM 抗 Titin（DSHB，克隆：9D10）；将单个等分试样储存在 -80 °C
32.小鼠 IgG2a 抗 TUBB3（ R&D Systems ，目录号： MAB1195，克隆：Tuj1）；将单个等分试样储存在 -80 °C
33.大鼠 IgG 抗AChR （DSHB，克隆：MAB35）；将单个等分试样储存在 -80 °C
34.小鼠 IgG1 抗 SV2A（DSHB，克隆：SV2）；将单个等分试样储存在 -80 °C
35.山羊抗小鼠 IgM 405 AlexaFluor （Abcam ，目录号： ab175662）；将单个等分试样储存在 -80 °C
36.山羊抗小鼠 IgG2a 488 AlexaFluor （ Thermo Fisher ，目录号： A-21131）；将单个等分试样储存在 -80 °C
37.山羊抗大鼠 IgG 555（ Thermo Fisher ，目录号： A-21434）；将单个等分试样储存在 -80 °C
38.山羊抗小鼠 IgG1 647 AlexaFluor （ Thermo Fisher ，目录号： A-21240）；将单个等分试样储存在 -80 °C
39.Vectashield抗淬灭封固剂（Vector Laboratories ，目录号： H-1900-10）
40.ADFNB 培养基 (M1)（参见食谱）
41.骨骼肌二次分化培养基（M3）（见食谱）
42.运动神经元培养基（M4）；可选（见食谱）
43.0.1% PBT（见配方）

设备

1.钝钳（Millipore，目录号： XX6200006P）
2.真空室（ Thermo Scientific/Nalgene ，目录号： 5305-0609 或同等产品）
3.真空泵（Welch ，型号： 2522Z-02 或同等产品）
4.用于 PDMS 固化的烘箱（粘合剂，型号： VD23 或同等产品）
5.UV 交联剂（ Vilber-Lourmat ，型号： BLX-254 或同等产品）
6.组织培养罩（ Thermo Scientific，型号： HeraSafe KS 或同等产品）
7.立体显微镜（Olympus，型号：SZX10 或同等产品）
8.血细胞计数器（Neubauer ，目录号： 10360141 或等效物）
9.带转子 A-4-81 和多孔板桶的离心机（Eppendorf，型号：5810R）
10.35 毫米塑料底盘（ Ibidi ，目录号： 81156）
11.15 厘米组织培养皿（ Thermo Scientific，目录号：353025 或同等产品）
12.10 厘米培养皿（康宁，目录号：430591 或同等产品）
13.多通道移液器（ Thermo Fisher ，目录号： 4661050N 或同等产品）
14.组织培养箱（ Thermo Scientific，型号： HeraCell 150i 或同等产品）
15.用于夹带的定制 LED 刺激器( Wefelmeyer 等。 , 2015 年)
16.470 nm LED 光源（Thorlabs，型号：M470F3）
17.LED 驱动器（Thorlabs，型号：DC2200）
18.细胞刮刀（Falcon/VWR，目录号： 734-0385 或等效物）

软件

1.CellSens （奥林巴斯）
2.Matlab R2021A（ Mathworks ）
3.PIVLab 2.53 （ Thielicke，2014 年）
4.IMARIS 9.1.2（牛津仪器）

程序

A.分隔微设备的准备（图 1，视频 1）

图 1. 在 35 mm 组织培养皿中制造分隔聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 微器件阵列。 A.示意图显示了通过在硅主模具上固化 PDMS 并使用紫外线固化聚合物 NOA-73 将阵列粘附到 35 毫米组织培养皿上来生成微器件阵列的步骤。 B.图片显示 35 毫米组织培养皿中的最终微器件阵列。

视频 1. 分隔微器件的制备

1.通过移液 1 分钟，将 2 克 PDMS 基 10:1 与固化剂混合在 50 mL Falcon 管中，并均匀涂抹在硅主模具上。避免在混合过程中引入气泡。
2.在 4.7 L 真空室中以 800 psi 脱气 20 分钟。
3.在烤箱中以 80°C 固化2 小时。
4.使用钝钳小心地剥离 PDMS 晶圆，并将其放入无菌的 15 cm 2组织培养皿微通道中，一面朝下，以防止碎片在其中积聚。
5.使用手术刀将晶圆切割成所需的阵列（2 × 3 或 3 × 3 设备阵列适用于 35 毫米盘）。
6.将 0.5 μL的 UV 固化聚合物 NOA-73 应用到塑料底 35 mm 盘上，并使用细胞刮刀均匀涂抹。在盘子的一侧标记最终传播的方向，因为肌纤维沿着与聚合物脊相同的方向排列得更好。
7.紫外线交联剂中以 55 J/cm 2部分紫外线固化 10 秒。
注意：部分固化对于增加树脂的粘度同时仍保持粘合性很重要。如果 UV 曝光时间太短，树脂将填充微槽。如果太长，PDMS 将不会粘附在盘子上。
8.将 2 x 3 或 3 x 3 阵列转移到 35 mm 盘上，确保隔间的长轴遵循 NOA-73 传播的方向。
9.2对设备进行完全紫外线固化，每侧 1 分钟。
10.在紫外线灯下紫外线消毒 20 分钟。
11.基质胶涂在盘子上。
12.在放置在组织培养罩中的立体显微镜下，使用细吸管从每个大隔间中去除气泡。
13.在 800 psi 的真空室中脱气微通道 2 小时。
14.立即使用或用封口膜密封培养皿，并在 4 °C下储存长达两周。

B.生成神经球体

该协议旨在与多个人类 PSC 分化协议一起使用。用于本研究的人类 PSC-运动神经元分化方案来自 Zhang 及其同事( Du 等。 , 2015 )以及( Machado _ 等。 , 2019 ) 。星形胶质细胞 (AC) 源自小鼠 ESC，如（ Machado 等。 , 2019 ) 。其他用于生成人类 PSC 运动神经元和星形胶质细胞的值得注意的方案包括( Julia 等。 , 2017 ;运河等。 , 2018 ;费尔南多普勒等。 , 2018 年）。对于用于这些实验的协议，请遵循( Harley 等。 , 2022 ) 。查阅原始协议以确定分离和重新接种运动神经元/星形胶质细胞的最佳点。
1.要生成非粘附的 96 孔板神经球体，请将 100 μ L的 0.5%脂质溶解在 100% 乙醇绝对溶液中，添加到 U 型底 96 孔板的每个孔中。
2.将盘子放在组织培养罩的通风口附近，盖子半开，晾干一夜。
3.第二天，分别使用TrypLE或accutase将运动神经元和星形胶质细胞分离成单个细胞。对于运动神经元解离，在协议中选择一个允许活细胞分选的阶段（ Harley 等。 , 2022 )并重新转化为不同的文化格式；如果运动神经元过于成熟并具有较大的轴突投射，则解离将导致细胞死亡。星形胶质细胞解离可能需要更长时间的孵育（ 5-20 分钟）和添加 DNase-I 以防止细胞聚集。
4.血球计对细胞进行计数，并在脂质板的每个孔中放置 15,000 个运动神经元和 5,000 个星形胶质细胞。计算完整板所需的数量并使用多通道移液器。板到 ADFNB 介质中。 [可选]：将 ADFNB 培养基 50:50 与运动神经元培养基结合。我们已经成功地将两种培养基条件用于人类 PSC 运动神经元球体的形成。
5.× g )的速度短暂旋转板2 分钟。
6.48 小时后，应形成大小和细胞类型组成均一的神经球体。检查边缘是否定义明确，整体形态是否为圆形（图 2）。

图 2。差 (A) 和优质 (B) 运动神经元 (MN)/星形胶质细胞 (AC) 球体的示例。比例尺 = 50微米。

C.将神经球体电镀到分隔的微型设备中（图 3）

1.解冻 GFR基质胶、纤维蛋白原和凝血酶。将金属管架、金属块和 35 mm 盘子放在冰上冷却。
2.制作含有 160 μL纤维蛋白原、40 μL GFR基质胶和 0.5 μL CaCl 2 （1 M 库存）的水凝胶混合物，然后放在冰上。
3.使用多通道移液器将神经球体从 U 型底部 96 孔脂质板转移到含有 5 mL ADFNB 介质的 10 厘米盘中。上下移液几次以移出球体，但不要太用力，因为它有破坏球体的风险。
4.旋转板并将 1 mL 介质中的所有球体转移到 15 mL Falcon 管中。
5.去除 950 μL的介质并添加 50 μL的水凝胶混合物，因此所有神经球体都在 100 μL的 50:50 介质到水凝胶中。
6.将这些球体转移到预冷的 35 mm 盘中，并留在冷金属块上以防止水凝胶聚合。
7.从 35 毫米培养皿中的分隔微装置中取出 GFR基质胶（从步骤 A 开始）。将吸气器直接应用于 PDMS 阵列，以从腔室中去除介质。
8.将 500 μL的 ADFNB 介质添加到 35 mm 盘的边缘，以防止干燥。确保这不会渗透到分隔的微设备阵列中。
9.在无菌罩显微镜下，使用精细的移液器尖端将三个神经球体转移到微器件阵列的每个外腔。
10.完成整个阵列后，在 RT 休息 5 分钟。
11.在每个腔室中添加额外的水凝胶混合物，以确保 PDMS 阵列上方有一个水凝胶半月板（这确保添加凝血酶不会干扰神经球体）。
12.在分隔的 PDMS 阵列中添加约 30 μL的凝血酶，以将纤维蛋白原转化为纤维蛋白并启动聚合。不要直接添加到腔室；只需在角落处涂抹即可。这样做相对较快，因为凝血酶会迅速聚合水凝胶。
13.在 RT 休息 5 分钟。
14.现在，小心地将 2 mL 的 ADFNB 介质添加到盘子中，然后放入培养箱中。

D.将生肌祖细胞电镀到分隔的微型设备中（图 3）

图 3. 示意图概述了将人类多能干细胞 (PSC)-神经球体和人类 PSC-肌源性祖细胞接种到分隔的微型设备中的不同步骤。 MN：运动神经元； AC：星形胶质细胞； MPCs：肌源性祖细胞； NMJ：神经肌肉接头。

该协议旨在与多个人类 PSC-肌原性分化协议一起使用。用于这项研究的那个来自Pourquie及其同事（ Chal 等。 , 2016 ) ，尽管通过强制表达 PAX7 对人类 PSC 进行正向编程也获得了类似的结果，如Rao中所述等。 ( 2018 ) 和切斯伯勒等。 ( 2022 ) 。在肌管融合发生之前，当细胞处于等效的祖细胞/成肌细胞阶段时，应重新接种细胞。
1.电镀神经球体后，等待 24 小时，然后再电镀生肌祖细胞。在此期间，运动轴突将通过微通道生长到中央隔间。
2.解冻 GFR基质胶、纤维蛋白原和凝血酶。将金属管架和金属块放在冰上冷却。
3.使含有 160 μL纤维蛋白原、40 μL GFR基质胶和 0.5 μL CaCl 2的水凝胶混合（1M 库存）并置于冰上。
4.使用TrypLE或accutase将生肌祖细胞分离成单个细胞。
5.μL的浓度重悬。
6.将生肌祖细胞悬浮液与水凝胶按 50:50 的比例混合，使细胞现在的浓度为 10,000 个细胞/ μL ，并放在冰上。
7.从 35 毫米盘的边缘取出介质，其中包含镀在微设备阵列外隔间的神经球体。
8.将 500 μL的骨骼肌生长培养基添加到 35 mm 盘的边缘，以防止隔间中的神经球体干燥。确保介质不会溢出到盘子中心的微型设备阵列上。
9.在无菌罩显微镜下，使用精细的移液器尖端从每个微型设备的空中央腔室中去除残留介质。
10.现在将 ±1 μL的肌源性祖细胞/水凝胶悬浮液转移到每个中央室。
11.静置 5 分钟。
12.加满额外的水凝胶混合物，在腔室上方形成半月板，再静置 5 分钟。
13.在分隔的 PDMS 阵列中小心地添加 ±30 μL的凝血酶。不要直接添加到腔室；只需在角落处涂抹即可。这样做相对较快，因为凝血酶会迅速聚合水凝胶。
14.再等 5 分钟。
15.现在，小心地将 2 mL 的骨骼肌细胞生长培养基添加到盘子中，然后放入培养箱中。
16.电镀生肌祖细胞后等待 24 小时，然后将骨骼肌细胞生长培养基更改为骨骼肌二次分化培养基，以诱导在中央室形成 3D 肌纤维片。

E.神经肌肉共培养物的维护和光遗传学夹带（可选）（图 4）

图 4. 光遗传学夹带增强了人多能干细胞 (PSC) 衍生的神经肌肉回路中的神经肌肉接头 (NMJ) 形成和肌纤维收缩性。 A.显示野生型人 PSC 神经肌肉共培养物的光遗传学夹带的示意图。 B.非夹带和夹带共培养物中光遗传学诱发的肌纤维收缩的粒子图像测速分析（比例尺 = 200 μm ）。 C。非夹带和夹带共培养物中光遗传学诱发的峰值肌纤维收缩速度的量化，n = 6。D. TUBB3、SV2 和AChR以及非夹带和夹带共培养中的SV2/ AChR (NMJ) 共定位通道的免疫荧光染色文化（比例尺 = 50微米）。非夹带和夹带条件下轴突生长和 NMJ 数量的量化，n = 6。误差条代表 SEM，未配对的非参数 t 检验用于确定统计显着性。 **p < 0.01，***p < 0.001。

该协议的光遗传学夹带部分专为包含运动神经元的神经肌肉共培养而设计，该运动神经元带有光遗传学致动器。在我们的研究中，我们使用通过 PiggyBac 转座系统稳定整合到人类 PSC 系中的 CHR2-YFP （ Harley等人， 2022 年）。此外，本节依赖于放置在组织培养箱中的 LED 刺激器的使用。在我们的工作中，我们使用了定制的刺激器（ Machado et al., 2019 ) ，尽管商业版本也广泛可用。虽然光遗传学夹带对于产生功能性神经肌肉回路不是必不可少的，但它确实显着改善了回路形成和收缩性，并提供了一个有趣的范例来研究未来研究中突触形成的活动依赖性。
1.2-3天更新一次骨骼肌二次分化培养基。 [可选]：在此阶段开始将骨骼肌二次分化培养基与运动神经元培养基以 50:50 的比例混合。
2.在电镀成肌祖细胞后四天，运动轴突应该已经开始通过微通道生长到中央肌肉隔室中。
3.在光遗传学夹带之前，将 1：1，000 抗氧化剂补充剂添加到 35 毫米培养皿中。
4.放置在孵化器中的 LED 刺激器顶部，并在 40% LED 强度下以 20 Hz 刺激 1 小时。
5.刺激后，彻底改变介质以去除光刺激引起的有毒自由基。
6.如此重复五天。
注意：夹带的长度取决于实验条件。我们注意到，当使用促进肌纤维收缩的药物治疗时，五天的牵引会导致过多的脱离，因此使用了更短的牵引时间( Paredes-Redondo et al. , 2021 ) 。

F.光遗传学运动神经元诱发的肌纤维收缩的记录和粒子图像测速 (PIV) 分析（图 4A – 4D 、5、6）

光遗传学诱发的肌纤维收缩的粒子图像测速 (PIV) 分析。 A.使用PIVLab 的PIV 分析步骤 Matlab插件： 1.加载图像作为时间分辨序列； 2.设置PIV设置； 3. 将图像校准到参考和时间步长； 4.应用向量验证； 5. 提取速度测量值。 B.光遗传学诱发的肌纤维收缩的 PIV 分析，使用和不使用AChR阻滞剂 d-筒箭毒碱 (DTC) 进行治疗。

图 6. 神经肌肉共培养物可用于模拟肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和杜氏肌营养不良症 (DMD) 相关的神经肌肉疾病表型。 A。与 CRISPR 校正对照 (CORR-R3381X) 相比，神经肌肉共培养物中含有来自 DMD 患者的 DMD-R3381X PSC 肌纤维的光遗传学诱发肌纤维收缩。 B. 与野生型对照相比，神经肌肉共培养物中含有来自 ALS 患者的 TDP-43 M337V PSC运动神经元的光遗传学诱发肌纤维收缩。

为了简要测试神经肌肉回路在培养过程中是否正常工作，使用带有荧光灯的 Olympus X73 显微镜对运动神经元进行光遗传学刺激，只需打开和关闭荧光快门，并观察相关的肌纤维收缩。然而，为了进行更受控的分析，Thorlabs LED 刺激器用于通过光纤光导提供精确的光遗传学刺激，光强度测量为 0.2 mW /mm 2 ( Paredes-Redondo 等。 , 2021 ) ，这足以触发表达 CHR2 的神经元中的动作电位。
1.将光纤与 470 nm LED 光导耦合 > 1 厘米置于 35 毫米盘下方，刚好超出显微镜内部光束的框架。
2.将 LED 驱动器上的 LED 强度设置为 100%，将刺激间隔设置为 500毫秒。
3.CellSens软件以每秒 20 帧 (FPS) 的速度录制 5 秒的视频；在录制过程中手动触发 LED 刺激器。
4.将视频记录导出为 TIFF 图像序列。
5.下载并安装PIVLab Matlab插件。
6.将图像加载为时间解析序列 (A + B)、(B + C) 和 (C + D)。
7.PIV 算法中选择FTT ，第 1 遍中的审讯区域= 64 像素和步长= 32，第 2、3 和 4遍的审讯区域为32像素。
8.将图像校准为具有已知尺寸图案的参考图像（例如，使用相同显微镜和设置拍摄的血细胞计数室图像）并将时间校准设置为像素之间的间隔，对于 20 FPS 记录为 50毫秒.
9.单击：分析 > 分析！
10.对于后处理，将 8 应用于Standard deviation filter并应用于所有帧。
11.使用速度幅度 (m/s) 参数将所有帧的结果导出为文本 (ASCII) 图表作为区域平均值，并绘制感兴趣区域以进行提取（在这种情况下为中央肌纤维室）。
12.最后，将速度幅度值乘以 10 6得出以μm /s为单位的速度幅度。
13.通过对齐收缩峰来组合相同条件的多个记录。

G.轴突生长和 NMJ 数量/形态的免疫组织化学和分析（图 4E、7）

图 7. 轴突生长和神经肌肉接头 (NMJ) 数量和形态的免疫细胞化学分析。 A. IMARIS 软件中用于分析 SV2 和AChR对象的共定位以推断 NMJ 数量和形态的步骤。 B. Titin、TUBB3、SV2 和AChR的代表性免疫荧光图像以及 SV2 和AChR的合成图像和共定位通道（比例尺 = 50 μm ）。

1.收缩分析后，在 PBS 中清洗神经肌肉共培养物，并在 4% PFA、15% 蔗糖溶液中固定 20 分钟。
2.PBS洗涤3次；然后，在 RT 处将 3% BSA、0.1% Triton-X-100 和 10% DMSO 阻断 1 小时。
3.在封闭溶液中加入一抗（Titin 1:20、TUBB3 1:500、SV2 1:200 和AChR 1:100）并在 4 ℃下放置过夜摄氏度。
4.在 0.1% PBT 中清洗三次，并在 0.1% PBT、10% DMSO 中在 4°C 下孵育二级抗体（1:1,000 稀释度）过夜。
5.PBS洗涤3次；然后，使用 18 mm 盖玻片和vectashield抗淬灭封固剂进行封固。要安装样品，请在阵列边缘添加 3 – 4 滴安装介质，倾斜培养皿，使介质流过隔间，然后从一侧开始将盖玻片缓慢滴到阵列上。
6.使用共聚焦显微镜在 40 μm Z 堆栈上以 2 μm间隔拍摄图像。
7.使用 IMARIS 图像分析软件，为每个通道创建一个表面。
8.使用共定位 ( Coloc ) 插件通过自动阈值计算工具为 SV2 和AChR通道生成共定位通道。
9.为此共定位通道创建一个表面。
10.现在，导出每个通道的对象数据，以及与形态相关的数据，例如面积和体积。
11.使用来自共定位通道的对象编号和平均面积/体积数据来推断 NMJ 编号和形态。
12.使用来自 TUBB3 通道的总面积/体积数据来推断轴突生长。

笔记

由于这些共培养物的复杂和多谱系组成，通常在收缩性、轴突生长和 NMJ 形成方面存在合理程度的实验间变异性。因此，每次生成共培养物时，都应注意包括所有适当的控制组。还应考虑对实验之间的数据进行归一化以比较多个数据集。我们建议每个实验中的每个条件至少执行四次技术复制，并且实验至少重复三次以确保再现性。推荐的统计测试：肌纤维收缩的 PIV 测量，采用Sidak多重比较测试的双向方差分析； NMJ 数量和形态，采用 Tukey 或Dunnet多重比较检验的单向方差分析。

食谱

1.ADFNB 培养基 (M1)
试剂终浓度数量（50 毫升）
高级 DMEM/F-121份23.25 毫升
神经基础1份23.25 毫升
Neurobrew-211 ×1毫升
N2补充剂1 ×0.5 毫升
L-谷氨酰胺2毫米0.5 毫升
青霉素/链霉素1 ×0.5 毫升
β-巯基乙醇1 ×50微升
BSA（5% 库存）0.1%1毫升

2.骨骼肌二次分化培养基（M3）
试剂终浓度数量（50 毫升）
DMEM/F-121份48.4 毫升
N2补充剂1 ×0.5 毫升
胰岛素-转铁蛋白-硒1 ×0.5 毫升
青霉素/链霉素1 ×0.1 毫升
L-谷氨酰胺2毫米0.5 毫升

3.运动神经元培养基 (M4)（可选）
试剂终浓度数量（50 毫升）
DMEM/F-121份23.75 毫升
神经基础1份23.75 毫升
Neurobrew-211 ×1毫升
N2补充剂1 ×0.5 毫升
L-谷氨酰胺2毫米0.5 毫升
青霉素/链霉素1 ×0.5 毫升
GDNF10 纳克/毫升5微升
神经营养因子10 纳克/毫升5微升

4.0.1% PBT
试剂终浓度数量（500 毫升）
PBS1份500 毫升
海卫 X-1000.1%在 PBS 中稀释的 5 mL 10% 库存

致谢

这项研究部分由Wellcome Trust“细胞疗法和再生医学”博士生奖学金 108874/Z/15/Z 资助； QMUL- Blizard博士生奖学金和 QMUL-Life Sciences Initiative 授予 AP-R。医学研究委员会向 IL 授予 MR/N025865/1；和皇家学会赠款 RG130417、 Newlife慈善赠款 SG/14-15/14、Action Duchenne 赠款 AD1801Y、Duchenne 父项目赠款 19.017 和 Barts 慈善赠款 MGU0426 给 Y.-YL 作者承认英国癌症研究中心卓越奖授予 Barts癌症中心拨款 C16420/A18066 和医学研究委员会中心拨款 MR/N026063/1。出于开放获取的目的，作者已将 CC BY 公共版权许可应用于由此提交产生的任何作者接受的手稿版本。该协议源自原始研究论文 ( Paredes-Redondo et al., 2021 )。

利益争夺

* Y.-YL是从辉瑞公司获得的一项研究资助的首席研究员。

伦理

*对于 DMD 患者来源的细胞，知情同意是根据 Hammersmith 和夏洛特皇后医院和切尔西医院（REC 参考号 06/Q0406/33）和国家研究伦理服务委员会 London-Stanmore（REC 参考号 13/LO/ 1826；IRAS 项目 ID：141100）。
* 对于来自 ALS 患者的细胞，知情同意书是根据国王学院 NHS 基金会信托基金（Chris Shaw 教授 - 道德规范编号：10/S1103/10；信托研发注册编号：KCH12-047）批准的适当道德规范获得的。
* IL 已获得英国干细胞银行指导委员会（编号 SCS11-06）的批准，可以进口人类 H9 ESC。

参考

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补充资料

用于制造硅母模的掩模：
Harley_etal_MBI 223_DF.gds
Harley_etal_MBI 218_no frame (BF)。全球数据系统