材料和试剂
1. MMI MembraneSlides TM （MMI GmbH，目录号：50102）
2. MMI I solationCaps透明，0.5 mL（MMI GmbH，目录号：50204 ）
3. 磷脂酶 A2（Sigma-Aldrich，目录号： P6534）
4. 脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号： V900388）
5. PBS（TBD Science，目录号：PB2004Y）
6. EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
7. NaCl （Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
8. DNase （Sigma-Aldrich，目录号： 11284932001 ）
9. RNase （Sigma-Aldrich，目录号： 10109134001 ）
10. OCT 化合物（SAKURA，目录号：4583）
11. 4％多聚甲醛（BOSTER Biological Technology，目录号：AR1068）
12. 蔗糖（ Sigma-Aldrich，目录号：V900116）
13. 脱脂溶液（见食谱）
14. DNase-RNase溶液（参见配方）
15. 3.4 M NaCl溶液（参见配方）
16. 30% 蔗糖溶液（见食谱）

设备

1. 激光显微切割系统（MMI、 cellcut plus）
2. 冷冻切片机（徕卡，型号：CM1950）
3. 振荡器( tcsysb , THZ-C)
4. 手术刀（BELEVOR MEDICAL，目录号：03.0030.01）

程序

A. 获取天然冷冻皮肤组织切片

1. 用冷 PBS 冲洗皮肤组织 3 次。
2. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定组织 24 小时。
3. 在 4°C 下用 10 mL 的 30% 蔗糖溶液进行脱水，直到组织沉入底部。
4. 冷冻在-80°C，然后包埋皮肤组织。在嵌入模具的凹槽中涂上一层 OCT 化合物，然后将组织切片放入凹槽中。填充嵌入剂（ OCT 化合物）并将样品放在冰箱上，直到嵌入剂固化。
5. 切割 20 μm 厚的天然皮肤组织部分。将MembraneSlides TM （ MMI标志朝上）靠近切片，切片会粘在上面。翻转MembraneSlides TM ，用手指在切片下方相应位置轻轻按压，样品将完全粘附在MembraneSlides TM上。
6. 在 MMI MembraneSlides TM上安装切片并储存在-20°C。

B. 获得脱细胞冷冻皮肤组织切片

1. 用含有 0.1% EDTA 的冷 PBS 冲洗皮肤组织 3 次。
2. 在 37°C 的振动筛中用 25 mL 的脱脂溶液（参见食谱）处理组织 4 小时来进行脱脂，直到组织部分变成牡蛎白色。
3. 用手术刀的背面轻轻刮擦皮肤表面，去除表皮。
4. 用 3.4 M NaCl （参见食谱）冲洗脱细胞真皮支架1 小时。
5. 在 37°C 下用DNase-RNase溶液（参见食谱）清洗样品1 小时。
6. 用冷 PBS 冲洗皮肤组织 3 次。
7. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定组织 24 小时。
8. 在 4°C 的 15 mL 离心管中用 10 mL 的 30% 蔗糖溶液进行脱水，直到组织沉入底部。
9. 按照步骤 A2 冷冻并包埋皮肤组织。
10. 如步骤 A3 所示，切割脱细胞皮肤组织的 20 μm 厚部分。
11. 在 MMI MembraneSlides TM上安装切片并将载玻片储存在 -20 °C。

C. 激光捕获显微切割(LCM)

1. 打开LCM系统。安装MembraneSlides和I so lationCaps透明。
2. 切换到 4 ×物镜并开始载玻片扫描和导航。
3. 切换到 10 ×目标进行后续解剖。
4. 设置激光位置指示器。点击按钮发射激光，检查激光位置是否与绿色十字相匹配。如果没有，点击“ CellCut ”——“Laser”——“Set Laser Position”，点击激光发射的位置。
5. 校准激光参数。选择徒手工具，在幻灯片上没有组织的空白区域画一条长线，然后剪切。调整“切割速度”、“激光聚焦”和“激光功率”，使切割线清晰、精确。
6. 移动到目标位置，画出切割线，开始切割。适当提高切割速度、切割功率和切割次数，以获得最佳切割效率。
7. 在手动模式下拿起样品。单击收集按钮将切口附加到 EP 管盖上，并检查组织是否已成功收集。如果不是，请重复收集或尝试调整 EP 管的位置，甚至重新切割。
8. 重复步骤 C6 和 C7，依次分离天然切片上的角质层、棘粒细胞、基底层、表层真皮和深层真皮，脱细胞切片上的基底膜。
9. 检查整个切片以确保切割和收集目标区域。
10. 标记样品并将其储存在-20°C 以供后续 MS 分析。

笔记

1. 为了在切割时获得更清晰的组织结构视图，可以对切片进行苏木精- 伊红染色。
2. LCM 系统允许同时切割多达 3-4 个切片的相同结构，并使用组功能收集具有多个管的多个结构。
3. 当样品难以被 EP 管盖解剖或收集时，首先检查物镜放大倍数是否正确。然后，优化激光参数，例如增加激光功率或减慢切割速度，并重复切割。最后，将 EP 管盖的位置移动到粘附样品较少的区域或更换新的收集管。
4. 切割圆不能太小，否则组织很容易被激光弹开。另外，切割线不能太长，否则组织在收集过程中会破裂。
5. F或激光参数校准，首先将“切割速度”和“激光功率”降低到较低值（如 5 μm /s 和 5%）并切割。然后，改变“激光焦点”，直到切割线变得清晰和宽敞。最后，降低“激光功率”以获得细线并再次更改“激光焦点”以找到最细的线。校准后，将“切割速度”增加到一个较高的值（如 70 μm /s）并相应地增加“激光功率”以获得快速和精确的切割线。为获得最佳切割效率，请根据不同的组织位置和厚度更改“切割速度”和“激光功率”。
6. 从外到内连续切割天然皮肤组织切片的角质层、颗粒层-棘层、基底层、表层真皮和深层真皮的过程。视频6 显示了切割脱细胞皮肤组织切片的基底膜的过程。

角质层的分离

层-棘层的分离

视频 3. 基底层的隔离

视频 4. 真皮浅层的分离

视频 5. 真皮深层分离

视频 6. 基底膜分离

食谱

1. 脱脂液
a. 将 10g脱氧胆酸钠粉末溶解在 1L 去离子水中。
b. 脱脂处理前将磷脂酶 A2 添加到上述溶液中，使最终浓度为 2,000 U/L。

2. DNase-RNase溶液
将 1 mg DNase粉末和 0.5 mg RNase粉末溶解在 100 mL 的 PBS 缓冲液中。

3. 3.4 M氯化钠溶液
a. 溶解 198.9 克NaCl粉末。
b. 溶解后，加去离子水定容至 1 L。

4. 30% 蔗糖溶液
a. 用 800 mL 去离子水溶解 300 克NaCl粉末。
b. 溶解后，加去离子水定容至 1 L。

致谢

这项工作得到了北京市科学技术委员会 (Z191100006619011)、首都健康促进与研究基金 (2020-2-4016)、CAMS 医学科学创新基金 (CIFMS 2020-I2M-C&T-B-048) 和国家科技重大专项（2021YFA1301603）。
该协议改编自 Li 等人。 (2022)。

利益争夺

作者声明，他们没有已知的可能影响本文报告的工作的竞争经济利益或个人关系。

伦理

作者声明在伦理方面没有冲突。

参考

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