材料与试剂
1.纸巾
2.具有 C57BL/6J 背景的雄性或雌性小鼠由从杰克逊实验室购买的繁殖对产生，或具有 129S2/SvPasCrl 背景由从查尔斯河购买的繁殖对产生。它们在恒温 (22 ± 1 °C) 和恒湿 (40%–60%) 下出生和饲养，光照时间为 12/12 小时：黑暗周期 [开灯时间：7:00–19:00，时间(ZT) 0–12；熄灯：19:00–7:00，ZT 12–24]，可随意获取食物和水。在植入脑电图和肌电图 (EMG) 电极后，动物被单独饲养在定制的笼中（见设备）。
3.（可选）超轻延长线（长度约 50 厘米，Cooner 电线，目录号： CW8183）用于在 EEG/EMG 记录期间减少青春期小鼠的电缆重量；然而，这对成年小鼠来说不是必需的。
4.皮质酮 ELISA 试剂盒（Enzo，目录号：ADI-900-097，储存温度：4 °C ）
5.Microvette ® CB 300 肝素锂（ Sarstedt Inc.，目录号：16.443.100 ）
6.水凝胶（ClearH 2 O，目录号：70-01-5022）
7.70% 乙醇

设备

1.睡眠剥夺系统（ViewPoint Life Sciences, Inc., Lyon, France），由剥夺室（PVC 圆筒，高度：46 cm，宽度：30 cm，重量：5 Kg）组成，底部有摇床，控制框，以及一台带有控制程序 Shaker Driver 的计算机（图 1A，B）。可以在https://youtu.be/LNTc7c5yFZM中找到来自供应商的说明设置及其使用的视频。
2.定制的家笼（图 1C）是通过将两个标准鼠笼粘在一起制成的（没有盖子，尺寸为 28 cm × 17.5 cm × 12.5 cm）。顶部做了一个大开口（约22×11厘米）供延长线/录音线穿过，底部侧面钻了一个小孔，用于进水。普通的老鼠食物颗粒连同被褥一起放在笼子里。
3.Eppendorf 离心机 5424（Eppendorf，德国汉堡）。

图 1 。自动睡眠剥夺系统和定制的家庭笼。 A.具有同步 EEG/EMG 记录的自动睡眠剥夺系统示意图。 B.睡眠剥夺室。 C. _定制的家笼。

软件
1.Shaker Driver v1.9.4 ( ViewPoint Life Sciences)（图 2）
2.标准数据处理和统计软件：Excel、Prism（GraphPad；8或更高版本）等。

程序

电极植入手术、EEG/EMG 重新编码和数据处理的过程已在我们之前的研究中详细描述(Eban-Rothschild 等。 , 2016;李某人等。 , 2018;李某人等。 , 2020;卞等。 , 2022;李某人等。 , 2022) ，因此不会成为本协议的重点。 SD 系统最多可容纳四只小鼠同时进行 EEG/EMG 记录，使用定制的分隔器（纸板、 Makrolon 塑料或其他材料）防止记录电缆缠结（图 1B）。

1.在产后第 21 天 (P) 断奶小鼠幼崽，并将它们随机分配到睡眠剥夺 (SD) 或控制(Ctrl) 组。
2.将用于 EEG/EMG 记录的电极植入P28–P30 （Bian 等。 , 2022) 。
3.手术后，将动物单独安置在定制的家笼中（图 1C）。
4.在脑电图/肌电图记录前至少一天，通过将线连接到鼠标耳机，使动物习惯于超轻延长线至少 24 小时。将延长线的另一端固定在笼子上方。允许足够长的延长线，以便动物自由移动，但避免在笼子里留下太多的线，以防止动物咬它。小鼠将在整个实验期间保持连接。
5.家庭笼中自发睡眠/觉醒周期的基线记录（P36，第 0 天）。
a.将延长线连接到主脑电图/肌电图电缆和录音设置。
b.在 7:00 (ZT 0) 开始录制，并在第二天早上 7:00 (ZT 24) 停止录制。
6.在摇床驱动程序中设置 SD 和 Ctrl 协议（图 2 和视频 1）。
a.在刺激设计器中，将高级别持续时间（毫秒）设置为 15，将总持续时间（毫秒）设置为 500，并将延迟（毫秒）设置为 0。通过单击“测试”按钮测试计算机、控制箱和剥夺室之间的通信在摇床驱动程序中。当您在 Stimulation Designer 中编程时，它会产生一个脉冲，平台应该相应地摇晃。
b.为 SD 和 Ctrl 协议设置脉冲的传送顺序。
i.对于 SD 协议，在序列设计器中将协议持续时间（小时）设置为 4，选中“使用随机数的刺激”，并将每个序列的刺激数设置为 2 到 8。选中“在 2 个序列之间使用随机时间（分钟） )”并将时间从 0.2 设置为 0.8。这将生成一系列随机的 2-8 个脉冲（持续时间为 15 毫秒），每随机 0.2-0.8 分钟以 2 Hz 的频率传送，总持续时间为 4 小时。
ii.对于 Ctrl 协议，在序列设计器中将协议持续时间（小时）设置为 4，取消选中“使用随机数的刺激”，并将每个序列的刺激数设置为 5。取消选中“在 2 个序列之间使用随机时间（分钟）”并将时间设置为 0.5。这将生成一列五个脉冲（持续时间为 15 毫秒），每 0.5 分钟以 2 赫兹的频率传送，总持续时间为 4 小时。

图 2. Shaker Driver 软件界面

为 SD 和 Ctrl 协议设置摇床驱动程序

7.执行 Ctrl/SD 协议（P37–P41，第 1–5 天）
a.将床上用品放在平台上。也可以添加其他材料/物体（例如，碎纸、雀巢或纸管）作为环境丰容物，因为它们有助于防止动物痛苦。在平台上放置一些食物颗粒和水凝胶（见注释），以便动物可以随意获取食物和水。
b.在 9:00（ZT 2）将 SD 动物转移到剥夺室。无需事先适应或习惯腔室。房间的新颖环境也有助于保持动物清醒。将每只动物放在由纸板分隔器隔开的每个隔间中，并允许延长线从设备顶部穿过（图 1A、B 和视频 2）。在 Shaker Driver 中启动 SD 程序。 4 小时（ZT 2–6）后，程序将停止，或者可以通过单击“停止”按钮手动终止。

视频 2. SD 会话期间的编程平台摇动

c.对于 Ctrl 动物，将它们转移到剥夺室，并在 19:00（ZT 12）开始 Ctrl 协议，并在 23:00（ZT 16）停止。
d.在 SD 或 Ctrl 会话之后，立即将动物送回他们的笼子。
e.丢弃床上用品、食物颗粒和水凝胶。用 70% 乙醇清洁设备。
f.对 Ctrl/SD 协议的剩余天数重复步骤 a–e。
g.EEG/EMG 记录在第 3 天从 7:00（ZT 0）到第二天早上 7:00（ZT 24）连续进行。也可以在Ctrl/SD的五天中的其他日子进行（见注释）。
8.在 Ctrl/SD（P42，第 6 天）后的一天，记录家庭笼中的 24 小时 EEG/EMG 信号。
9.要检查可能由 SD 或 Ctrl 协议引起的应激反应，请通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量血浆皮质酮水平：
a.使用没有脑电图/肌电图记录的不同动物群，并使它们执行第 6 步和第 7 步。在第 1 天和第 5 天，在 Ctrl/SD 会话之后，立即使用异氟醚麻醉动物并使用毛细管收集少量血液(~100 μL) 从眶后窦进入经肝素处理的微量管 (Sarstedt Inc., 16.443.100)。动物应该从至少一次采血中恢复过来。在同一个 ZT 上没有任何操作的情况下，从天真的动物中收集无摇控制样本。
b.通过在 1,000 下离心（Eppendorf，Centrifuge 5424）从全血样本中分离血浆 × g和室温 15 分钟。将上清液（血浆）转移到干净的试管中，避免沉淀物中的血细胞受到污染。
c.根据制造商的说明，使用皮质酮 ELISA 试剂盒（Enzo，ADI-900-097）测量血浆样品中的皮质酮水平。

数据分析

1.EEG/EMG 数据的处理和量化在我们之前的研究中有所描述（Eban-Rothschild 等。 , 2016;李某人等人， 2018 年；李某人等。 , 2020;卞等。 , 2022;李某人等。 , 2022) ，并且在不同的脑电图/肌电图系统中会发生变化——因此，这里没有描述它的特征。清醒状态、NREM 和 REM 是根据以下标准定义的： NREM：与清醒相比，大幅值、增量（0.25-4 赫兹）-EEG 中的主导振荡，以及减少的 EMG 活动； REM：高频（4-9 Hz 为主）和相对较小且均匀的 EEG 振幅，通常与平坦的 EMG（肌肉无力）相关。在 SleepSign (Kissei Comtec Co.) (Eban-Rothschild 等人， 2016 年）或自定义 MATLAB 脚本中的 5 秒（SB Li 等人， 2018 年；李某人等人， 2020 年；卞等。 , 2022;李某人等。 , 2022)被算作一个状态。
2.计算每小时处于唤醒、NREM 和 REM 状态的时间百分比，并将其与 ZT 作图以评估 SD 的影响。执行重复测量双向方差分析（RM 2 路方差分析），然后进行 Bonferroni 的多重比较以检查组之间的差异。代表性数据可以在我们之前研究的扩展数据图 1d-f 中找到（Bian 等。 , 2022) 。
3.计算睡眠架构的参数，例如整个 4 小时 SD 会话中每个状态的总时间、每个状态的总回合数、平均回合长度、接下来 6 小时的睡眠反弹（ Bian 等人， 2022），以及与 Ctrl 协议相比，SD 协议导致的 NREM 和 REM 睡眠减少（图 3A）。其他参数也可以从 EEG 中计算出来，例如每个状态的功率谱，在 SD 之前或之后。代表性数据可以在我们之前研究的扩展数据图 1g–m 中找到（Bian 等人， 2022）。
4.SD 后一天（ P42，第 6天）或随后几天的睡眠记录可用于评估睡眠结构的任何长期变化，方法是将其与基线记录或 Ctrl 动物进行比较。
5.未接受摇晃或在第 1 天或第 5 天 SD 会议后立即测量的血浆皮质酮测量值没有显着差异，证实 SD 协议不会引起显着的急性应激。这些结果可以在我们之前研究的扩展数据图 1n 中找到（Bian 等。 , 2022) 。第 5 天的皮质酮水平在 Ctrl 和 SD 组之间也没有显着差异（图 3B）。

图3。代表性数据。 A.在 4 小时 Ctrl/SD 期间，相对于同一 ZT 期间各自的基线睡眠，NREM 或 REM 睡眠量减少。 Ctrl 协议在暗相开始时立即开始并持续 4 小时 (ZT 12–16)，SD 协议在青春期小鼠 (P35–P42) 的早期光相开始 (ZT 2–6) 中执行。 N = 4 只小鼠在 Ctrl 中； SD 中有 9 只小鼠。韦尔奇 t 检验，ΔNREM， t = 10.63， df = 5.13， P = 0.0001； ΔREM， t = 8.74， df = 10.99， P = 0.000003。 B.与 Ctrl 协议相比，五天的 SD 不会引起明显的压力。 N = 7 只小鼠在 Ctrl 中； SD 中有 10 只小鼠。韦尔奇t检验， t = 0.3331， df = 14.14， P = 0.74。数据显示为平均值±SEM * P < 0.05； ** P < 0.01； *** P < 0.001； ns，不重要。 SD 值是从Bian发表的数据中提取的等。 (2022) 。

笔记

1.该系统有力地剥夺了动物的睡眠，并且一次最多可容纳四只小鼠，并通过使用分隔器进行脑电图记录。
2.SD协议中的随机性有助于减少对摇晃的习惯，从而防止睡眠，而Ctrl协议中的非随机设计恰恰相反，即尽可能减少对睡眠的干扰。事实上，在 Ctrl 会话期间，我们发现一些小鼠可以保持少量睡眠，这与早期黑暗时间 (ZT 12-16) 的自发睡眠没有显着差异。
3.我们建议避免使用相同的动物进行皮质酮测量和脑电图/行为测试，因为重复采血后可能会产生混杂效应和身体状况不佳。
4.本协议中报告的皮质酮测量不检查治疗期间的急性/瞬态压力。如果这是研究的一个问题，则应添加额外的压力控制或更多的压力测量时间点。
5.由于对青春期小鼠进行操作的年龄窗口较短，我们使用了至少 24 小时来使动物适应录音电缆。然而，在进行年龄敏感性较低的实验时，强烈建议使用更长的习惯时间。我们分别比较了习惯化 24 小时（1 天）和 5 天（5 天）后青春期小鼠的脑电图记录，发现整体睡眠/觉醒模式和每种状态的总时间在 1 组之间没有显着差异d 和 5d（补充图 1A 和1B ）。然而，唤醒和 NREM 发作的平均回合长度确实随着习惯化时间的增加而增加，尽管只有暗相 NREM 类别的差异具有统计学意义（补充图 1C ）。这些结果表明，1 天的习惯足以恢复正常的睡眠/觉醒周期，尽管动物可能会经历轻微的睡眠碎片，这可能会随着习惯的延长而得到改善。
6.剥夺室配有一个装在圆筒上的水瓶。不过水瓶在摇晃过程中漏水问题严重，所以我们没有使用；反而，我们只是把水凝胶放在了房间的地板上。
7.ViewPoint 还提供了一个 SleepScore 软件，据供应商称，该软件可以实时检测警觉状态和 NREM 和 REM 睡眠的特定剥夺 ( https://www.viewpoint.fr/en/p/software/sleepscore )。但是，我们尚未测试该软件的性能。

致谢

这项工作得到了人类前沿科学计划奖学金 LT000338/2017-L (W.-JB)、大脑与行为研究基金会 NARSAD 青年研究员资助 29952 (W.-JB) 和美国国立卫生研究院资助 R01 MH102638 (LdL) 的支持， R01 MH087592（低密度脂蛋白），R01 MH116470（低密度脂蛋白）。使用此处描述的协议得出的数据最近已发布（Bian等人，2022 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

所有实验方案均经斯坦福大学动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。

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