材料与试剂

1. 1.5 mL Eppendorf 管（ Eppendorf ，目录号： 022363204 )
2. 免疫印迹 PVDF 膜（Bio-Rad，目录号：1620177）
3. Tris-HCl（pH 6.8）（ Sigma-Aldrich，目录号： T5941 ）
4. 十二烷基硫酸钠（ Sigma-Aldrich，目录号： L3771 ）
5. 甘油（ Sigma-Aldrich，目录号： G5516）
6. β-巯基乙醇（ Sigma-Aldrich，目录号： M3148）
7. EDTA （ Sigma-Aldrich，目录号： E9884）
8. 溴酚蓝（ Sigma-Aldrich，目录号： B8026）
9. NuPAGE TM LDS 样品缓冲液（4×）（Thermo Fisher Scientific，目录号：NP0007）
10. NuPAGE TM 3%–8%，Novex TM tris-acetate 1.5 mm 迷你蛋白凝胶，10 孔（Thermo Fisher Scientific，目录号：EA0378BOX）
11. NuPAGE TM三乙酸 SDS 电泳缓冲液（20×）（Thermo Fisher Scientific，目录号：LA0041）
12. 如前所述制备 IRS 蛋白（Cao等人， 2017 年；Peng 等。 , 2022) 。为了确定 IRS 乙酰化对其与 IR b结合的影响，IRS1 和 IRS2 蛋白被乙酰转移酶 P300 蛋白乙酰化。在乙酰化测定中，将 2 μg IRS1 或 IRS2 添加到含有 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、5% 甘油、0.1 mM EDTA、50 mM KCl、1 mM 二硫苏糖醇 (DTT)、1 mM PMSF 的反应中10 mM 丁酸钠、0.2 μg乙酰辅酶 A 和 0.2 μg P300（活性基序）。将样品在 30 °C下孵育1 小时。在另一个乙酰化测定组中，未添加乙酰辅酶 A，但它用作阳性对照。
13. 重组人IRβ 蛋白（Creative Biomart ，目录号： INSR-5093H)
14. 抗 IRβ（Cell Signaling Technology，目录号：3020）；稀释度：1:500
15. 蛋白质梯（Thermo Fisher Scientific，目录号：26634）
16. Tris （ Sigma-Aldrich，目录号： T1503）
17. 甘氨酸（ Sigma-Aldrich，目录号： G8898）
18. 甲醇（ Sigma-Aldrich，目录号： 34860）
19. NaCl （ Sigma-Aldrich，目录号： 9888）
20. Tween-20 （ Sigma-Aldrich，目录号： P1379）
21. 脱脂奶粉（Bio-Rad，目录号：1706404XTU）
22. DTT （ Sigma-Aldrich，目录号： D0632）
23. KH 2 PO 4 （ Sigma-Aldrich，目录号： P5655）
24. Na 2 HPO 4 （ Sigma-Aldrich，目录号： S9763）
25. 盐酸胍（ Sigma-Aldrich，目录号： G3272）
26. ECL 试剂盒（Pierce TM ECL 西印迹基板）（Thermo Fisher Scientific，目录号：32106）
27. 加载缓冲区（见食谱）
28. 湿转移缓冲液（见配方）
29. 变性和复性缓冲液（见表 1）（见配方）
30. 蛋白质结合缓冲液（见配方）
31. PBST 缓冲液（参见配方）

设备

1. 迷你凝胶罐（Thermo Fisher Scientific，目录号：A25977）
2. PowerPac ™ 基本电源（Bio- Rad ，目录号： 1645050 ）
3. ChemiDoc XRS+ 凝胶成像系统（Bio-Rad）
4. 微型反式印迹电泳转移池（Bio-Rad，目录号： 1703930 ）

程序

A. 使蛋白质样品变性

1. 准备 4× 加载缓冲区。
2. 混合上样缓冲液 (4×) 和 NuPAGE TM LDS 样品缓冲液 (4×)。
3. 将混合物应用于1.5 mL Eppendorf 管中小鼠IRS1 (0.2 – 0.4 μg/μL)和 IRS2 (0.2 – 0.5 μg/μL) （最终 1×）的纯化蛋白，在 95 °C下保持 10 分钟，然后之后马上冰上。
笔记：
a. NuPAGE TM LDS 样品缓冲液（最终 1 × ）的混合物可用作阴性对照。
b. 加热过程中要注意防止样品因管盖打开而挥发。在加载样品之前，通过完成短暂的旋转来收集盖子上的水蒸气。

B. 通过电泳分离蛋白质样品

将变性的 IRS1 和 IRS2 蛋白质样品与蛋白质梯一起加载到 Novex TM迷你蛋白质凝胶上。在浓缩胶中以 80 V 运行，然后在分离胶中转为 120 – 150 V ，直到您的目标蛋白迁移到分离胶的中间。
笔记：
a. 对于 1.5 mm 10 孔凝胶，样品体积不应> 50 μ L。在我们的实验中，我们加载了 5-10 μg IRS1 (180 kD)蛋白质和5-12 μg IRS2 (185 kD )蛋白质。
b. 当蛋白样品上胶后，将电泳槽转移至4℃的冰箱中摄氏度。
c. 基于蛋白质梯的迁移，可以估计目标蛋白质在凝胶中的位置。

C. 将蛋白质转移到膜上

1. 膜制备：首先将 PVDF 膜在甲醇中预润湿 20 秒，然后放入超纯水中快速冲洗一次，然后在超纯水中静置 5 分钟，最后在湿转缓冲液中（至少 15 分钟）。
2. 电泳完成后，用纯水清洗电泳板，将凝胶放在吸水纸上，小心地将预湿的 PVDF 膜放在凝胶上，将第二张吸水纸放在 PVDF 膜上，并放置海绵支撑垫。
3. 在此测定中，我们使用湿转 [100 V/凝胶，2 小时（对于 1.5 mm 凝胶），室温 (RT)] 或 10 mA/凝胶，在 4 °C 下过夜。
警告：
a. 预制凝胶盒中打开和取出凝胶，请参阅“ NuPAGE 技术指南”，网址为https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/EA0375PK2 。
b. 确保转移三明治中没有气泡。

D. 膜上蛋白质的变性/复性

1. 转移完成后，将膜从三明治中取出，用超纯水冲洗两次。
2. 表1 所示，在变性和复性缓冲液（新鲜制备）中孵育膜，浓度从高浓度到低浓度的胍-HCl。最后，在不含胍-HCl的变性和复性缓冲液中孵育膜，在 4 °C过夜。

表 1 。含不同浓度盐酸胍的变性和复性缓冲液

注意：完全复性膜上的蛋白质对于随后的蛋白质-蛋白质结合测定至关重要。

E. 在室温下用 PBST 缓冲液中的 5% 牛奶封闭膜 1 小时

F. 用重组人 IRβ 蛋白孵育膜

1. 封闭后，用 PBST 缓冲液洗膜 3 次，每次 5 分钟。
2. 加入3-10 μg IRβ，并在 4 °C下与膜一起孵育过夜。

G. 检测膜上与 IRS1/2 结合的 IRβ

1. 用 PBST 缓冲液清洗未结合的 IRβ 3 次，每次 10 分钟。
2. 在 3% 牛奶 PBST 中与抗 IRβ（1:250 稀释）一起孵育，在 4 °C下过夜。
3. 用 PBST 缓冲液洗膜 3 次，每次 10 分钟。
4. 在室温下用二抗（1:5,000 稀释）孵育膜 1 小时。
5. 用 PBST 缓冲液洗膜 3 次，每次 10 分钟。
6. 用 PBS 冲洗膜 5 分钟。

H. 按照说明书使用化学发光ECL试剂盒显影

简而言之，通过将检测试剂 1 和 2 按 1:1 的体积混合来制备化学发光底物试剂。用化学发光底物孵育印迹 2 分钟。从底物上取下印迹并将其放入 ChemiDoc XRS+ 凝胶成像系统中以获取图像。
注意：使用足够的体积以确保印迹完全被化学发光底物润湿并且不会变干 (0.1 mL/cm 2 )。

食谱

1. 加载缓冲区
50 mM Tris-HCl (pH 6.8 )
2%十二烷基硫酸钠
10% 甘油
1% β-巯基乙醇
12.5 毫米乙二胺四乙酸
0.02%溴酚蓝
°C ）下储存长达六个月。

2. 湿转缓冲液
25 毫米三
192 毫米甘氨酸
20% 甲醇
缓冲液应新鲜制备。

3. 变性和复性缓冲液
100 毫米氯化钠
20 毫米 Tris (pH 7.6)
10% 甘油
0.1% 吐温 20
2%脱脂奶粉
1 毫米数字地面电视
这应该是新鲜准备的。

4. 蛋白结合缓冲液
100 毫米氯化钠
20 毫米 Tris (pH 7.6)
0.5 毫米乙二胺四乙酸
10% 甘油
0.1% 吐温 20
2%脱脂奶粉
1 毫米数字地面电视
该解决方案应新鲜配制。

5. PBST缓冲液
4 毫米 KH 2 PO 4
16 毫米钠2 HPO 4
115 毫米氯化钠 (pH 值 7.4)
0.05% 吐温 20
准备 10× PBST 并在室温下储存长达三个月。使用前稀释至 1×。

致谢

这项工作部分得到了 NIH 的资助：R01DK107641 和 R01DK120309。该协议是从以前的出版物(Wu 等。 , 2007) 。

利益争夺

我们声明没有竞争利益。

参考

Cao, J.、Peng, J.、An, H.、He, Q.、Boronina, T.、Guo, S.、White, MF、Cole, PA 和 He, L.（2017 年）。内毒素血症介导的乙酰转移酶 P300 激活会损害肥胖症中的胰岛素信号传导。 Nat Commun 8(1): 131。
Cheatham, B. 和 Kahn, CR (1995)。胰岛素作用和胰岛素信号网络。 Endocr 修订版16(2)：117-142。
Kaido, M.、Inoue, Y.、Takeda, Y.、Sugiyama, K.、Takeda, A.、Mori, M.、Tamai, A.、Meshi, T.、Okuno, T. 和 Mise, K.（ 2007）。下调编码运动蛋白相互作用蛋白的 NbNACa1 基因可减少本塞姆氏烟草中雀麦花叶病毒的细胞间运动。 Mol 植物微生物相互作用20(6)：671-681。
Machado-Neto, JA、Fenerich, BA、Rodrigues Alves、APN、Fernandes, JC、Scopim-Ribeiro, R.、Coelho-Silva, JL 和 Traina, F.（2018 年）。正常和恶性造血中的胰岛素底物受体 (IRS) 蛋白。诊所73（增刊 1）：e566s。
Peng, J. 和 He, L. (2018)。 IRS 调节胰岛素信号的翻译后修饰。 J Mol Endocrinol 60(1)：R1-R8。
Peng, J., Ramatchandirin, B., Wang, Y., Pearah, A., Namachivayam, K., Wolf, RM, Steele, K., MohanKumar, K., Yu, L., Guo, S., White , MF, Maheshwari, A. 和 He, L. (2022)。 P300 乙酰转移酶抑制剂 C646 促进胰岛素受体蛋白底物的膜转位以及与胰岛素受体的相互作用。生物化学杂志298(3)：101621。
Sweet, LJ, Morrison, BD 和 Pessin, JE (1987)。从纯化的人胎盘 alpha 2 beta 2 异四聚体胰岛素受体复合物中分离功能性 alpha beta 异二聚体。胰岛素结合异质性的结构基础。生物化学杂志262(15)：6939-6942。
White, MF、Livingston, JN、Backer, JM、Lauris, V.、Dull, TJ、Ullrich, A. 和 Kahn, CR (1988)。酪氨酸 960 处胰岛素受体的突变会抑制信号传递，但不会影响其酪氨酸激酶活性。单元格54(5)：641-649。
Wu, Y., Li, Q. 和 Chen, XZ (2007)。通过 Far western 印迹法检测蛋白质-蛋白质相互作用。 Nat Protoc 2(12)：3278-3284。
Yip, CC 和 Ottensmeyer, P. (2003)。胰岛素及其受体的三维结构相互作用。生物化学杂志278(30)：27329-27332。