材料与试剂
1. 显微镜载玻片（Corning，目录号：CLS294775X25）
2. 显微镜载玻片盖玻片（Globe Scientific，目录号：1404-10）
3. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Sigma-Aldrich，目录号：806552）
4. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
5. 10% 正常山羊血清（Cell Signaling，目录号：5425）
6. 乙醇，200标准（Thermo Scientific，目录号：T038181000）
7. 异氟醚（Covetrus，目录号：11695-6777-2）
8. 林格溶液（Fisher Scientific，目录号：S25512）
9. 异戊烷（Alfa Aesar，目录号：19387，CAS 号：78-78-4）
10. Tissue-Tek OCT 化合物（Sakura Finetek，目录号：4583）
11. PAP笔（Biotium，目录号：22006）
12. ProLong TM Gold Antifade Mountant（Invitrogen，目录号：P36931）
13. 一抗（表 1）

表1. 用于肌纤维分型的一抗

14. 荧光标记的二抗（表 2）

表2. 用于肌纤维分型的二抗

15. 山羊血清（Invitrogen，目录号：31872）
16. 二甲基亚砜（DMSO）（Fisher Scientific，目录号：D1319）
17. 泼尼松粉（Sigma-Aldrich，目录号：P6254）
18. 1 mL 带针头胰岛素注射器（BD，目录号：329424）
19. 透化试剂： PBS 中的 1% (v/v) Triton X-100
20. 封闭缓冲液：PBS 中的 10% (v/v) 山羊血清
21. 泼尼松原液 (5 mg/mL)：1 mL DMSO 中的 5 mg 泼尼松粉末
22. 生理溶液：无菌0.9%生理盐水（Cytiva Z1379）
23. 车辆库存：1 mL DMSO。

设备

A. 握力和跑步机检测

1. 带有用于小鼠的单个传感器的握力计（最大容量为 1 千克），带有标准拉杆（Chatillon Instruments，数字测力计，目录号：DFIS-2）
2. 带有刺激组件的开放式跑步机、约 10% 的上坡坡度、单独的鼠标通道、调节速度的驱动电机（3-100 m/min 范围）以及具有易抓握纹理的运动带（Columbus Instruments，目录号：Exer3/6）

B. 胫骨前肌力频分析

1. 手术剪（Fine Science Tools，目录号： 14060-10）
2. 鼠标处理钳（Fine Science Tools，目录号： 11036-20）
3. 体重秤（Ohaus，目录号：80000022）
4. 用于小鼠的 3 合 1 整个动物系统的原位装置设置（Aurora Scientific，目录号：1300A）
5. Ohaus Pioneer 精密天平（Fisher Scientific，目录号：01-922-178）
6. 数显卡尺（Thermo Fisher，目录号：14-648-17）
7. 异氟醚蒸发器（SurgiVet Classic T3，目录号 VCT302）和感应室（Patterson Scientific，目录号：07-8917760）
8. 手术缝合线（Ethicon，目录号：K871）

C. 肌纤维分型

1. Leica 低温切片机（Leica Biosystems，目录号：CM1510S）
2. 加湿容器（Thomas Scientific，目录号：1219D68）
3. Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜（Nikon Instruments，目录号：Ti-E）

D. MRI 扫描以确定瘦体重比

1. EchoMRI 全身成分分析仪（EchoMRI，目录号：100H）
2. 小鼠专用样品管包含 20 至 40 克体重（EchoMRI，休斯顿，德克萨斯州）
3. 标准内部校准管（菜籽油）（EchoMRI，德克萨斯州休斯顿）

软件

1. 内置软件EchoMRI version 140320。当水化率>85%时进行数据分析
2. ImageJ（斐济， https://imagej.nih.gov/ji ）
3. ASI 611A 动态肌肉分析 v5.300
4. ASI 610A 动态肌肉控制 v5.500
程序

此处提供的协议和示例数据来自C57BL/6 背景的野生型 (WT) 雄性小鼠（JAX 应变 #000664）。每个队列使用的动物数量应根据适合研究范围的适当功率分析来决定。有关测试小鼠的年龄和性别的注意事项，请参阅末尾的注释。

A. 握力和跑步机性能的量化

1. 握力
a. 在握力测定之前记录每只小鼠的体重。
b. 要记录老鼠的力量，请抓住它的尾巴，让老鼠用前肢抓住握力计的横杆，然后将动物从金属网格上拉开。确保以恒定、轻柔的动作拉动，使鼠标与工作表面保持平行（图 1 ）。
c. 每只鼠标重复三次握力测量。让鼠标在拉动之间休息一分钟并记录最高数字。
d. 将握力标准化为体重。

图 1. 体内使用握力计评估小鼠肌肉力量

笔记：
• 检查小鼠的脚趾，以确保在测试前它们没有可见的伤口。
• 拉动鼠标之前，请确保鼠标能很好地抓住横杆；否则，这会导致错误的低值。
• 确保鼠标只用前臂握住杆，并且身体与工作台面平行。
2. 跑步机试验
a. 将每只老鼠放在单独的跑步机车道上。每条车道都配备了一个冲击网格，可提供足部冲击。电网中的冲击电流通常设置在最低级别1（图2 ）。
b. 传送带以 3 m/min 的速度启动，每分钟逐渐增加 1 m/min 的速度（1 m/min 2加速度）。如果需要分析重量归一化的功或功率，请将跑步机带向上倾斜（通常为 10° ）。
c. 监控每只鼠标以确保它们正在运行（图 2 ）。停止跑步的老鼠通过移动的跑步机皮带被推到冲击网格。疲惫的迹象（例如，在电击网格上 30 秒没有成功地再次开始跑步）被定义为跑步机检测终点。
d. 记录距离 (m) 和总时间 (s) 直到筋疲力尽。
e. 将跑步机检测性能分析为耗尽时间或耗尽距离。如果使用倾斜，则可以使用先前报告的公式计算重量归一化功和/或功率（ Castro 和 Kuang，2017 年）：
做功（J）=体重（kg） ×重力（9.81m/sec2） ×垂直速度（m/sec ×以弧度表示的角度） ×时间（s）
功率（W）=功（J）/时间（s）
如果使用，应调整计算以考虑加速度或变化的速度。

图 2. 跑步机对小鼠肌肉耐力和疲劳度的体内评价

笔记：
• 该测试是一种强迫运动形式，需要厌恶刺激以保持动物运行。我们使用电击作为厌恶刺激，并密切确保动物不会受到过度电击，因为它会影响下游检测。
• 如果在同一天检测握力和跑步机，请在跑步机检测之前进行抓地力检测，以避免疲劳可能产生的影响。让老鼠在抓地力和跑步机检测之间在笼子里自由行走 30 分钟。
• 还要确保实验以盲目的方式进行。
• 在基线（注射前）和治疗后（最后一次泼尼松剂量后 24 小时）测量握力和跑步机性能。
• 对于这两种测定，在队列和时间点上保持操作员相关变量（例如，操作员、仪器、房间条件、一天中的时间）不变。
• 避免在跑步机检测后立即收集组织。
• 建议在最后一次跑步机检测后至少 24 小时收集组织。

B. 用于肌肉力量的量化

1. 在麻醉诱导室内用 1.5% 异氟醚麻醉小鼠约 2-5分钟。麻醉系统由一个感应室、一个透明塑料盒组成，一次将一只小鼠限制在一个与氧气流相连的封闭空间内，设置为每分钟最大 0.5 L，以及异氟醚气体，设置为 1.5%（图 3 ）。

图 3. 麻醉诱导室

2. 将鼠标仰卧在原位仪器设置 (Aurora) 的检测平台上。在整个过程中，通过提供 1.5% 异氟醚的鼻锥为动物提供麻醉维持。
3. 将 70% 乙醇喷洒到您打算对其进行实验的特定后肢（右或左）。
4. 在脚踝附近做一个小切口，去除后肢皮肤，露出胫骨前 (TA) 肌肉，确保肌腱和肌肉不受损。
5. 通过在肌肉和骨骼之间滑动钳子，将 TA 肌肉从胫骨上分离出来。
6. 使用手术缝合线，将远端肌腱固定到力探头上。
7. 轻轻切断肌腱并将肌肉与胫骨分开。 TA 肌肉应连接到远端的力探头和近端的膝盖区域。
8. 在将鼠标保持在平台上的同时，用专用夹子挡住膝盖。
9. 调整平台以确保探头与膝盖对齐。
10. 将两个电探头放入腿部，一个在 TA 的远端，另一个在靠近坐骨神经的膝盖下（图 4 ）。

图 4. 肌肉力量的体内定量

11. 运行测试脉冲以将肌肉张力调整到平衡点。平衡点是初始休息点的肌肉张力，在施加测试电脉冲后肌肉会恢复到该位置。用数字卡尺 (L 0 ) 记录平衡时的肌肉长度（以毫米为单位）。
12. 通过破伤风刺激以增加的频率（即从 25 到 200 赫兹，间隔为 25 赫兹）运行力频率测试。在刺激回合之间暂停 5 分钟。记录每个等长收缩 (P 0 )的力 (以 N 为单位) 。
13. 重复程序 (B3–B12) 并测试对侧 TA 肌肉。
14. 进行安乐死，并用精确的刻度收集和记录每块 TA 肌肉。
15. 的比力 (N/mm 2 ) 计算为 (P 0 N)/[(肌肉质量 mg/1.06 mg/mm 3 )/L f mm]。 1.06 mg/mm 3是哺乳动物的肌肉密度。大号f = 大号0 × 0.6，其中 0.6 是 TA 肌肉中的肌肉与纤维长度比( Burkholder 等。 , 1994 ) .比力通常转换为并报告为 N/cm 2单位。
笔记：
• 执行此测试时避免延误。
• 通过添加林格溶液来保持肌肉水分。
• 确保在评估过程中正确固定电极。

C. 用于肌肉质量的定量

1. 胫骨前肌 (TA)
a. 在力实验之后，立即对小鼠进行颈椎脱位。
b. 将鼠标置于仰卧位置，并将所有四肢固定在解剖垫上。
c. 从力实验中使用的 TA 肌肉的远端肌腱中取出手术缝合线。
d. 用钳子握住远端肌腱。测量长度（肌肉长度将用于力的计算），然后切除近侧膝盖区域的 TA 肌肉（图5 ）。确保仅切除 TA 而不是与 TA 相邻的伸肌指长肌。
e. 称量胫骨，精确到 0.1 毫克。

图 5. 小鼠胫骨肌的分离

2. 腓肠肌 (GA) 和比目鱼肌
a. 识别 GA 并轻轻移除覆盖它的筋膜。
b. 切断远端 GA 肌腱并插入镊子（图 6 ）。
c. 用钳子从远端到近端来回摩擦以打开间隙。
d. 一旦有开口，就尽可能靠近脚切断肌腱。
e. 用钳子提起肌腱并尽可能靠近膝盖切割肌腱。
f. 识别比目鱼肌（在深粉红色的 GA 下方），然后使用细钳握住其末端之一并用剪刀将其剪下。
g. 用镊子夹住自由端，然后切开另一端。
h. 将切除的 GA 和比目鱼肌称重到最接近的 0.1 毫克。

图 6. GA 肌肉的收获

3. 股四头肌 (QD)
a. 识别 QD 并移除筋膜。
b. 切到离膝盖最近的地方。用镊子夹住自由端并朝近端切割，使剪刀向下和向前（图 7 ）。
c. 到达近端后，切除肌肉。
d. 称量 QD，精确到 0.1 mg。

图 7. 小鼠 QD 肌肉的分离

4. 肌肉质量的计算
将肌肉质量计算为单个肌肉的肌肉重量超过体重和/或胫骨长度。

D. 用于肌纤维分型

1. 样品制备
a. 肌纤维分型可以在任何肌肉组织中进行。为肌肉量称重肌肉后，即可为肌纤维分型做准备。
b. 小心地将组织放在注射器柱塞上，并用 OCT 化合物覆盖。
c. 立即将组织浸入装满异戊烷的金属杯中，并在液氮中冷却 30-40 秒，以快速冷冻组织。
d. 将冷冻组织储存在-80 °C以备将来使用。
e. 要对冷冻组织进行切片，请使用低温切片机切割 10 μ m 的横截面。
f. 使用刷子拾取切片并将它们放在显微镜载玻片上。
g. 将带有适当部分的幻灯片存放在 -80 °C以备将来使用。
2. 免疫染色
a. 将载玻片解冻至室温 30 分钟。
b. 使用 PAP 笔，在组织周围绘制一个周边以创建疏水屏障。
c. 将幻灯片放在加湿室中，并添加足够的透化试剂以覆盖组织（通常每节 200 μ L）。
d. 在 37°C 下孵育 30 分钟，然后在室温下孵育 10 分钟。
e. × PBS轻轻清洗载玻片一次。
f. 添加新准备的阻塞缓冲区以覆盖该部分。在室温下孵育 1 小时。
g. × PBS中清洗载玻片一次。
h. 在阻塞缓冲液中为主要抗体（见表 1）准备适当的稀释液： BA-F8 、 SC-71和BF-F3 ，并覆盖在切片上。 SC-71、BF-F3 和BA-F8抗体分别用于染色 IIA 型、IIB 型和 I 型肌纤维。
i. 在冰箱 (4 °C) 中孵育过夜。
j. 用 1× PBS 轻轻清洗切片一次，以去除未结合的一抗。
k. 覆盖在封闭缓冲液中稀释的二级抗体（见表 2）中的部分：山羊抗小鼠 IgG2b Alexa Fluor TM 647、山羊抗小鼠 IgG1、Alexa Fluor TM 488 和山羊抗小鼠 IgM、Alexa Fluor TM 594。
l. 在黑暗中室温孵育 1 小时。
m. × PBS中轻轻清洗切片 3 次。
n. TM Gold Antifade Mountant封固载玻片。
o. 如果需要，将幻灯片存放在 4°C 下，避光以备将来成像。幻灯片可以保存大约一个月用于成像。
p. 通过使用尼康显微镜在至少五个连续切片中拍摄图像来量化肌纤维类型（图 8 ），并量化为总计数肌纤维的百分比。进行所有对治疗不知情的分析。

图 8. TA 切片免疫组织化学染色的代表性图像。 1 型纤维染成品红色，2A 型染成绿色，2X 型未染色，2B 型染成红色。蓝色核染色（原始放大倍数，20 ×

E. 肌纤维横截面积 (CSA)

肌纤维 CSA 和肌纤维分型的样品制备是相同的（样品制备见 D1 部分）。
1. 免疫荧光
a. 将载玻片解冻至室温 30 分钟。
b. 使用 PAP 笔，在组织周围绘制一个周边以创建疏水屏障。
c. 将载玻片置于加湿室中并加入足量的透化试剂以覆盖组织（通常为 200 每节μ L ）。
d. 在 37°C 下孵育 30 分钟，然后在室温下孵育 10 分钟。
e. × PBS轻轻清洗载玻片一次。
f. 添加新准备的阻塞缓冲区以覆盖该部分。在室温下孵育 1 小时。
g. × PBS中清洗载玻片一次。
h. 在阻断缓冲液中制备抗 (α)-层粘连蛋白抗体 (见表 1) 并覆盖在切片上。在冰箱 (4 °C) 中孵育过夜。
i. × PBS轻轻清洗切片一次，以去除未结合的一抗。
j. 稀释山羊抗兔 IgG (H+L) Alexa Fluor T M 488 （见表 2）在封闭缓冲液中，室温避光孵育 1 小时。
k. × PBS中轻轻清洗切片 3 次。
l. ProLong TM Gold Antifade Mountant封固载玻片。
m. 如果需要，将幻灯片存放在 4°C 下，避光以备将来成像。幻灯片可以保存大约一个月用于成像。
2. CSA定量
a. Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜使用 10 ×和 20 × （短程）物镜进行成像（图 9 ）。
b. 使用 ImageJ 软件对每只小鼠的每个组织 >400 个肌纤维进行 CSA 定量。
c. 对于线性校准，使用线选择工具在已知距离的两个点（例如比例尺）之间绘制一条线。
d. 使用命令 Analyze → Set scale将线长从像素转换为度量单位 ( m) 。
e. 通过区域选择工具（多边形）手动勾勒出肌纤维周长（图 9 ）。图像边缘或变形/改变形状 (*)（图 9 ）的肌纤维被排除在计数之外，以消除伪影的存在。
f. 使用命令分析→测量在数据窗口中显示面积测量。

图 9 。 TA 切片的代表性免疫荧光图像。抗(α)-层粘连蛋白（绿色）染色（原始放大倍数，20×）； (*) 表示具有变形形状的代表性肌纤维。

注意：肌纤维 CSA 定量协议也可用于苏木精和曙红染色切片。

F. 瘦体重定量

1. 打开桌面上的 EchoMRI 程序。
2. 实验完成后，创建一个文件夹以自动保存原始数据。
3. 将固体校准支架（用于鼠标）放入 MRI 中，并通过插入校准支架进行系统测试。该过程大约需要 4 分钟才能完成。该系统使用标准内部校准管（菜籽油）进行校准。
4. 从机器上取下校准架。
5. 用尾巴抓住老鼠，将其放在大小合适的支架上，然后滑动可调节的屏障以尽量减少移动区域。一定程度的移动性很好，不会影响测量（图 10 ）。

图 10. 使用 EchoMRI 的身体成分分析

6. 记录读数并以 20 秒的间隔重复扫描。
7. 从管架上取下啮齿动物，然后用刷子/纸巾擦去任何尿液/粪便或粗碎物，然后再处理下一只动物。
8. 当水化率 > 85% 时，使用内置软件 EchoMRI 版本 140320 分析数据。
笔记：
• 如果金属耳标用于鼠标识别，请使用不会影响动物、机器或 EchoMRI 测量的非磁性耳标。
• 完成所有测量后，清洗管架并对所有部件进行消毒。不同菌株、物种和主要研究人员的动物之间必须进行消毒清洗，以防止啮齿动物病原体的潜在交叉污染。

G. 特定方案糖皮质激素治疗中肌肉功能、瘦肌肉和肌肉质量以及肌纤维分型的量化

下面显示的数据（图 11 ）显示了我们在肌肉功能、瘦肉和肌肉质量以及肌纤维分型方面的协议实施示例。在这里，我们展示了强的松（一种常用的糖皮质激素）给药时间的影响；提供的数据改编自Quattrocelli等人。 ( 2022 ) 。
1. 糖皮质激素方案
a. 注射前，记录每只小鼠的体重。
b. 准备 50 μ L（最终体积）生理溶液和适当体积的泼尼松原液至最终剂量为 1 mg/kg [例如，4 μ L的 5 μ g/ μ L 原液（总计 20 μ g）用于20 克鼠标]。
c. 对于车辆，混合相应体积的车辆库存和无菌生理溶液。
d. 每剂量使用一次性胰岛素注射器，加载适当的解决方案。确保没有空气进入。
e. 暴露小鼠腹部并进行腹腔注射。
f. 间歇给药的频率：每周一次的方案包括每周 1次泼尼松剂量（第 1 天），然后是 6次载体剂量（第 2-6 天）。它通过每周一次的载体注射来控制。
g. 给药时间：在光照阶段开始时（ZT0；开灯）或在黑暗阶段开始时（ZT14；熄灯）进行注射。在单次脉冲或慢性治疗中最后一次注射后 24 小时进行实验。
h. 按照该方案进行总共 12 周的慢性治疗。所有体内、离体和尸检分析均在对治疗组不知情的情况下进行。

图 11. 亮相与暗相间歇性泼尼松治疗对肌肉生物能学的影响。在使用每周一次的间歇性强的松进行为期 12 周的治疗后显示结果，剂量仅限于 ZT0（亮相）与 ZT14（暗相）。在野生型 (WT) 小鼠中，与等时性载体对照 ZT0 而不是 ZT14 相比，泼尼松改善了 (A) 跑步机性能，(B) 握力测试，(C) 肌肉重量，(D) 瘦体重，(E) 肌肉力量和 (F) 肌纤维区域。然而，(G) 胫骨前肌中肌纤维类型的分布没有变化。瘦体重、握力、肌纤维横截面积 (CSA) 和肌纤维分型数据改编自 Quattrocelli 等人。 (2022)。 * = p < 0.05，** = p < 0.01，*** = p < 0.001； 1 向方差分析 + Sidak（AD、FG）、2 向方差分析（E 中的曲线）。

笔记

1. 在这里，我们使用 1 mg/kg 泼尼松剂量来成功区分 WT 小鼠品系中每周一次的日间给药与每周一次的夜间给药不同的影响。应测试其他糖皮质激素、剂量和间歇间隔，以评估与此处讨论的分析和趋势的差异/相似性。
2. 为期 12 周的治疗可以稳定不同方案的特定变化，并额外考虑开始和终点的年龄。
3. 在这里，我们报告了 4 个月大小鼠开始时与糖皮质激素治疗相关的方法和数据。这个起始年龄适合为期 12 周的疗程。事实上，经过处理的小鼠在开始时为 4 个月大，在终点时大约为 7 个月大。不同年龄的分析会产生不同的结果，因此在进行这些测试时应考虑分析年龄。
4. 将性别视为生物变量，生物性别几乎影响肌肉生理学的每一个虚拟参数及其对药物治疗的反应，包括糖皮质激素间歇性（ Salamone 等， 2022 ）。因此，建议对雄性和雌性小鼠进行足够强大的队列分析，以及按性别汇总和分类的数据报告。

致谢

该协议改编自我们之前在Quattrocelli等人发表的工作。 ( 2022 ) 。这项工作得到了 AG078174、HL158531、DK121875 和 DK130908（NIH）、启动基金（CCHMC）、受托人奖（CCHMC）、心脏研究所转化基金（CCHMC）和 CuSTOM 试点赠款（CCHMC）的支持。

利益争夺

MQ 被列为西北大学提交的与间歇性糖皮质激素使用相关的专利申请（PCT/US2019/068618）的共同发明人。所有其他作者声明他们没有竞争利益。

伦理

根据美国兽医协会的规定，并根据辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物护理和使用委员会 (#2020-0008) 完全批准的方案，将小鼠安置在无病原体设施中。

参考

Burkholder, TJ、Fingado, B.、Baron, S. 和 Lieber, RL (1994)。小鼠后肢肌纤维类型和大小与肌肉结构特性之间的关系。 J Morphol 221(2)：177-190。
Castro, B. 和 Kuang, S. (2017)。跑步机疲劳试验和全肢握力试验对小鼠肌肉性能的评价。生物协议7(8)：e2237。
Kalyani, RR、Corriere, M. 和 Ferrucci, L. (2014)。与年龄和疾病相关的肌肉流失：糖尿病、肥胖和其他疾病的影响。柳叶刀糖尿病内分泌学2(10)：819-829。
Lovering, RM, Porter, NC 和 Bloch, RJ (2005)。肌营养不良症：从基因到治疗。物理学85(12)：1372-1388。
Quattrocelli, M.、Wintzinger, M.、Miz, K.、Levine, DC、Peek, CB、Bass, J. 和 McNally, EM (2022)。间歇性糖皮质激素药物引起的肌肉线粒体重塑需要完整的生物钟和肌肉 PGC1alpha。科学进阶8(7)：eabm1189。
Reichmann, H. 和 Pette, D. (1984)。小鼠和兔胫骨前肌 IIA 和 IIB 纤维中的磷酸甘油氧化酶和琥珀酸脱氢酶活性。组织化学80(5)：429-433。
Salamone, IM、Quattrocelli, M.、Barefield, DY、Page, PG、Tahtah, I.、Hadhazy, M.、Tomar, G. 和 McNally, EM (2022)。间歇性糖皮质激素治疗通过性二态机制增强骨骼肌性能。 J 临床投资132(6)。
Takeshita, H., Yamamoto, K., Nozato, S., Inagaki, T., Tsuchimochi, H., Shirai, M., Yamamoto, R., Imaizumi, Y., Hongyo, K., Yokoyama, S.,等。 (2017)。改良的前肢握力测试可检测雄性小鼠骨骼肌功能与衰老相关的生理衰退。科学报告7：42323。
Talbot, J. 和 Maves, L.（2016 年）。骨骼肌纤维类型：利用肌肉发育生物学的见解来剖析肌肉疾病易感性和抵抗力的目标。 Wiley Interdiscip Rev Dev Biol 5(4): 518-534。