材料与试剂
1.无菌棉
2.无菌 10 cm 培养皿（Eppendorf，目录号：EP0030702115）
3.无菌 1.5 mL 微量离心管（Eppendorf，目录号：0030121872）
4.50 mL 锥形离心管（Eppendorf，目录号：0030122178）
5.大鼠幼崽或小鼠幼崽（0 – 2 天大）
6.蒸馏水
7.70% 乙醇 (HIMEDIA, catalog number: MB228) (v/v) 双蒸水
8.马血清（Gibco，目录号：16050122）
9.胰蛋白酶 0.25% 溶液 1 ×不含酚红 (HIMEDIA, catalog number: TCL006)
10.完整培养基：Dulbecco 改良鹰培养基 (DMEM)（HIMEDIA，目录号：AL007A），辅以 10% 胎牛血清（FBS）（HIMEDIA，目录号：RM-10432）和 1 × 抗生素-抗真菌混合物（Gibco ，目录编号：15640-055）（见食谱）
11.磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，1×（参见食谱）
12.含 D-葡萄糖 (PBSG) 的磷酸盐缓冲盐水缓冲液 (1 × )（参见食谱）
13.消化混合物（DM）（见食谱）

设备

1.无菌手术剪刀（Harvard Apparatus，目录号：ST2 72-8438）
2.镊子（Harvard Apparatus，目录号：ST2 72-8949）
3.刀片（哈佛仪器，目录号：ST2 72-8366）
4.组织培养层流罩（垂直流）（Thermo Scientific，型号：1338）
5.涡旋混合器（ Tarsons的 SPINIX ，3020）
6.摇床培养箱（Thermo，型号：MAXQ 4450）
7.CO 2培养箱（保持在 37 °C 和 5% CO 2 ）

程序
A.心脏组织采集
1.用不冷不热的蒸馏水清洗每只小鼠/大鼠幼崽，然后用 70% 乙醇轻轻使用无菌吸水棉球。
笔记：
a.此步骤对于去除因环境暴露引起的任何污物或污染物很重要，这样做是为了避免细胞培养后期阶段的任何污染。
b.所需幼崽的数量应根据计划的实验来决定。
2.麻醉幼崽，然后在无菌解剖罩中用一把无菌剪刀将它们斩首。
注意：幼崽应该是 0 – 2 天大的 (P0 – P2)，因为活细胞的产量会随着幼崽的长大而减少。幼崽的扑杀应该一只一只地进行。使用前后务必用 70% 乙醇擦拭剪刀。
3.将动物保持在仰卧位，允许进入动物的头部、颈部和胸部区域。在颈部区域做一个水平切口，然后垂直切口，在一把无菌剪刀的帮助下切开胸肋（切口呈 T 形）。
注意：在胸腔内进行垂直切割，直到露出心脏。用手指从动物所在的地方轻轻按压，直到心脏突出。
4.在无菌剪刀的帮助下切出心脏，并迅速将切下的心脏放入冰冷的无菌 PBSG 中。
注意：将心脏置于冰冷的 PBSG 中是必不可少的，因为它会降低心脏的新陈代谢率，从而减轻心脏的压力。
5.清洗心脏后，将它们转移到另一个含有组织培养层流罩中新鲜、冰冷的 PBSG 的培养皿中。在无菌钳的帮助下，尝试挤出心脏内多余的血液，一旦血液停止渗出就停止挤压。
注意：去除在切除过程中附着在心脏上的任何其他器官/组织的部分，如肺、隔膜和任何血块。此外，请确保移除由心房和大血管组成的心脏顶部。

B.消化心脏组织

1.在无菌手术刀片的帮助下，将一颗心脏切成 4 –5 块（每块应该在 1 毫米3左右）。将碎片收集到装有冰冷 DM 的无菌 1.5 mL 微离心管中（每只大鼠心脏或两只小鼠心脏约 130 μL ）。
笔记：
a.尽量不要制作非常小的碎片，因为在几轮消化后用微量移液器收集细胞时可能很难避免服用它们。
b.一个1.5 mL microcentrifuge tube最多可容纳 3 个大鼠心脏和 5-6个小鼠心脏。 DM 的体积应根据每个管中的心脏数量进行调整。
c.切割心脏碎片时不应包括压碎或研磨，因为它可能导致细胞死亡。
2.通过将含有 DM 和心脏块的微量离心管放入摇床培养箱中开始消化，每个消化周期应保持在 37°C 并设置为 250 rpm 7 分钟。
3.× 的速度旋转不超过 10 秒 g在台式离心机中，让心脏块沉淀在管底部。丢弃上清液。
注意：第一个消化循环的上清液被丢弃，因为它包含部分 ECM、RBC 和其他碎片。
4.将新鲜的 DM 添加到组织培养层流罩中的这些管中，并短暂涡旋，然后将它们放回摇床培养箱中，并在相同的最佳条件下保持 7 分钟。
注意：应避免长时间消化或涡旋，因为压力过大会导致细胞损伤和死亡。
5.× 的速度旋转管子少于 10 秒 g在台式离心机中。在组织培养层流罩内，从含有预热马血清（37°C）的 50 mL 锥形离心管中的微离心管中收集上清液。将含有马血清的试管与细胞一起保存在 37 °C 和 5% CO 2饱和度的培养箱中，直到下一个消化周期完成。在同一管中收集每次消化的上清液。
注意：为避免污染，应为从该步骤开始收集的细胞保持完全无菌的环境。保持50 mL 锥形离心管的螺帽部分打开（未完全关闭）以允许曝气。
6.继续消化过程（加入DM，在振荡培养箱中放置7分钟，涡旋离心，收集马血清上清液于50 mL锥形离心管中，置于CO 2 培养箱中）直至心脏块完全消化。完全消化小鼠/大鼠心脏组织大约需要 9 – 10 个循环。
笔记：
a.在每个消化周期后用于收集消化细胞的 50 mL 锥形离心管中的马血清量应约为所有消化后收集的上清液总量的两倍。
b.中存在的酶在收集消化细胞后被马血清中和。这对于防止过度消化很重要，否则细胞可能会受损。
c.在整个过程中应保持无菌条件。消化的次数可能会增加以获得更高的细胞产量，但较长的消化可能会导致细胞受损，从而降低成纤维细胞的总产量。

C.细胞电镀
1.将细胞和马血清混合成接近均质的混合物，然后将细胞接种到涂有聚 L-赖氨酸的 10 厘米培养皿中（参见支持协议，了解在接种成纤维细胞之前涂敷细胞培养皿）。在 CO 2培养箱中孵育这些培养皿 1 小时，使成纤维细胞附着。
笔记：
a.使用的菜肴数量将根据实验使用的大鼠/小鼠幼崽的数量而定。一个 10 厘米的培养板可分别容纳来自大鼠和小鼠幼崽的大约 4-5颗和 9-10颗心脏的成纤维细胞。预期产量约为每只大鼠心脏 2 × 10 5 个细胞和每只小鼠心脏约 1 × 10 5 个细胞。
b.心脏成纤维细胞和心肌细胞的不同附着特性，成纤维细胞附着在板上。在聚-L-赖氨酸存在的情况下，心脏成纤维细胞在心肌细胞（1 小时内）之前附着在培养皿上。心肌细胞在这段短时间内很难粘附在培养皿的涂层表面，因此可以很容易地与上清液一起清洗和收集。如果孵育时间增加，将心脏成纤维细胞与心肌细胞分离可能具有挑战性，因为心肌细胞也会粘附在 10 厘米培养板的涂层表面。因此，两种细胞类型的不同附着特性已证明有利于心脏成纤维细胞的特异性分离。
2.1小时后，去除含有未附着心肌细胞的上清液。心肌细胞可以与血清一起丢弃或通过离心收集，如果需要，可以进一步重新悬浮在新鲜培养基中用于实验。
3.通过向每个板中添加培养基（大约 2 mL) 并在将其收集回来之前轻轻旋转。收集的培养基可以添加到离心前最后一步收集的血清上清液中。
注意：培养基洗涤用于洗涤仍然存在于板表面的任何剩余心肌细胞，并获得成纤维细胞的纯培养物。
4.向每个板中添加 10 mL 新鲜的完整培养基，并保存在37 °C 和 5% CO 2饱和水平的 CO 2培养箱中。

D.成纤维细胞的繁殖和接种
1.从播种细胞的培养皿中丢弃培养基。
注意：使用锯齿移液器和移液器辅助装置取出用过的介质后，将盘子保持在倾斜位置以排出并收集剩余的介质。
2.× PBS（每盘 4 mL）清洗细胞（附着在板表面）。轻轻旋转 PBS 并按照与上一步中使用过的介质相同的方式将其丢弃。
注意：正确洗涤细胞和去除用过的培养基很重要，因为完全培养基中存在的血清可能会阻碍胰蛋白酶的活性。血清含有抑制胰蛋白酶活性的蛋白酶抑制剂。
3.将 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1 × ) 添加到每个含有原代心脏成纤维细胞的 10 cm 培养皿中，并轻轻旋转培养皿，使溶液覆盖所有细胞。
注意：将装有胰蛋白酶-EDTA 的培养皿放在 CO 2培养箱中以激活胰蛋白酶的活性一到两分钟，同时不断检查细胞是否脱离（轻轻敲击可以帮助细胞从底部脱离）。
4.胰蛋白酶化细胞中加入 4 mL 的完整介质，使每道菜中的总体积为 5 mL（1 mL 胰蛋白酶-EDTA + 4 mL 完整介质）。
注意：添加培养基是因为它含有有助于防止细胞过度胰蛋白酶化的血清。如果胰蛋白酶活性未被抑制，长时间的胰蛋白酶消化可能会导致细胞损伤。
5.在室温下在离心机中以100 x g旋转5 分钟。
注意：培养皿中的培养基 + 胰蛋白酶溶液可用于通过在培养皿中上下移液数次来冲洗细胞表面的细胞。此步骤将有助于从培养皿表面分离最大数量的细胞。
6.离心后，弃去上清液，用新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀。
注意：确保将细胞重新悬浮到接近均匀的混合物中，以便可以为实验适当地进行播种。
7.然后可以根据设计实验的要求将重悬的细胞接种在适当标记的组织培养皿或其他板中（在接种成纤维细胞之前，请参阅“支持协议”以涂覆细胞培养皿）。
注意：原代新生儿心脏成纤维细胞最多可进行两次胰蛋白酶消化和传代培养。

支持方案：用聚 L-赖氨酸包被组织培养板，使心脏成纤维细胞有效附着在培养皿表面

材料与试剂

1.10 cm 组织培养板（Eppendorf，目录号：EP0030702115）
2.0.22 μm注射器过滤器 ( Whatman TM Uniflo 25 注射器过滤器，Merck，目录号：WHA9913-2502）
3.0.45 µm PVDF 膜（GE Healthcare，目录号：10600023）
4.聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P8920）
5.胰蛋白酶 0.25% 溶液 1 ×不含酚红（HIMEDIA，目录号：TCL006）
6.II 型胶原酶 (Gibco 胶原酶，II 型，粉末，目录号：17101015)
7.DMEM，高葡萄糖（HIMEDIA，目录号：AL007A）
8.胎牛血清 (FBS)（Gibco，目录号：RM-10432）
9.100 ×抗生素-抗真菌溶液（Gibco，目录号：15640-055）
10.甲醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
11.Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：9002-93-1）
12.牛血清白蛋白（HIMEDIA，目录号：MB-083）
13.吐温 20（Sigma-Aldrich， catalog number: P1379）
14.Fluoromount （Sigma-Aldrich，目录号：F4680）
15.2 × Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad，目录号：161-0737）
16.β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
17.脱脂奶粉（HIMEDIA，目录号：GRM-1254）
18.Clarity Western ECL 底物（Bio-Rad，目录号：1705061）
19.RNAiso Plus 试剂（TAKARA，目录号：9108）
20.PrimeScript 1 st Strand cDNA合成试剂盒（TAKARA，目录号：RR014B）
21.SYBR-Green PCR 主混合物（Bio-Rad，目录号：1725124）
22.TGF-β1（Sigma，目录号：T7039）
23.氯化钾
24.氯化钠
25.KH 2 PO 4
26.Na 2 HPO 4
27.双蒸水(DDW)
28.盐酸
29.葡萄糖（ Qualigens ，目录号：15405）
30.抗体（表 1）
31.消化混合物（见食谱）
32.含有 10% FBS 和抗生素-抗真菌混合物的 DMEM（完全培养基）（见食谱）
33.0. 01% (w/v) 聚-L-赖氨酸（见配方）
34.磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，1×（参见食谱）
35.磷酸盐缓冲盐水 - 葡萄糖 (PBSG)，1×（参见食谱）
36.磷酸盐缓冲盐水-Tween-20 (PBST)，1×（参见食谱）
37.Tris 缓冲盐水 Tween-20 (TBST)，1×（参见食谱）
38.转移缓冲液（参见配方）

表 1. 研究中使用的抗体列表
S. 号抗体公司目录 n哦。
应用
1个抗肌动蛋白，α-平滑肌抗体，小鼠单克隆抗体西格玛A5228蛋白质印迹 (1:1,000)，
免疫荧光 (1:500)
2个纤连蛋白 (EP5) 小鼠单克隆抗体圣诞老人sc-8422蛋白质印迹 (1:1,000)，
免疫荧光 (1:250)
3个COL1A1 (C-18) 山羊多克隆抗体圣诞老人sc-8784蛋白质印迹 (1:1,000)，
免疫荧光 (1:250)
4个COL3A1 (B-10) 小鼠单克隆抗体圣诞老人sc-271249蛋白质印迹 (1:1,000)，
免疫荧光 (1:250)
5个多发性硬化症 mAB到 β 肌动蛋白艾博康ab8226蛋白质印迹 (1:2,000)

设备

1.- 20 °C 冰箱
2.共焦激光扫描显微镜（LSM 880，Zeiss，美国）
3.ChemiDoc成像系统，Bio-Rad（版本 2.2.0.08）
4.QuantStudio 6 Flex，Life Technologies

程序

聚-L-赖氨酸是一种有效的试剂，可促进细胞和 ECM 与涂层固体表面的粘附。
聚阳离子聚-L-赖氨酸分子被强烈吸附到固体表面上。细胞上的阴离子位点识别这些分子上暴露的聚阳离子位点，因此增强细胞对涂层组织培养板表面的附着，形成单层细胞（Mazia 等人，1975 年； Macieira - Coelho和Avrameas , 1972 ) 。对于成纤维细胞的播种，组织培养器皿的涂层是通过用 0.01% 的聚-L-赖氨酸工作溶液短暂覆盖表面来完成的。

组织培养板涂层

1.从市售的 0.1% 多聚赖氨酸库存溶液中制备无菌 0.01% 工作溶液（在去离子水中）。
2.用 0.01% 聚-L-赖氨酸覆盖整个表面，涂上 10 厘米的组织培养皿。
注意：5 mL 的聚 L-赖氨酸工作溶液足以覆盖 10 厘米培养板的表面。
3.在保持在 37 °C 和 5% CO 2饱和水平的 CO 2培养箱中将板孵育半小时。
笔记：
a.从培养箱中取出盘子，去除多余的聚-L-赖氨酸溶液。
b.从盘子里收集任何多余的溶液。避免用移液器吸头在涂层表面上留下任何划痕。
4.在无菌组织培养罩内的室温下，将板在紫外线下打开 30 分钟。
注意：避免过度干燥涂层板，因为它可能会因涂层破坏而损害心脏成纤维细胞的附着。
5.在完成消化步骤后，这些板现在可以用于播种心脏成纤维细胞。

方法

免疫荧光协议：
如前所述，用原代新生大鼠心脏成纤维细胞进行免疫荧光实验（ Maity 等。 , 2020 ) 。使用 3.7% 甲醛在室温下固定细胞 10 分钟，并使用 0.2% Triton X-100 在室温下透化 5 分钟。在每个步骤之前，用 1 × PBS 对细胞进行三次洗涤，每次 3 分钟。在室温下使用 PBST 缓冲液中的 5% BSA 封闭细胞 1 小时。一抗在 PBST 中的 1% BSA 中制备，并与细胞在 4°C 下孵育过夜。用1 × PBS洗涤细胞三次，每次3分钟后，将它们与在PBST中的1％BSA中制备的二抗在室温下孵育1小时。使用 Hoechst 33258 (1:2,000) 对细胞核染色 10 分钟。使用Fluoromount水性封片剂将盖玻片封片在干净的载玻片上，并使用共聚焦显微镜进行成像。所使用的抗体已列于表 1 中。

蛋白质印迹：
如前所述，对原代新生大鼠心脏成纤维细胞进行蛋白质印迹（ Maity 等。 , 2020 ) 。简而言之，使用补充有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的 RIPA 缓冲液制备总蛋白裂解物。通过将裂解物与 2 × 含 5% β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液。将制备的样品在 95 °C 下加热5 分钟，并在 80 V 的 10% SDS-PAGE 凝胶上解析。PVDF 膜 (0.45 µm) 用于通过转移缓冲液在 20 V 下通过过夜湿转转移蛋白质。转移后使用 5% 脱脂牛奶在 TBST 中室温封闭 1 小时。用 TBST 洗涤封闭的膜后，将其与一抗（在 TBST 中的 5% BSA 中制备）在 4 °C 下孵育过夜，然后在室温下与二抗（在 TBST 中的 1% 脱脂牛奶中制备）孵育 1 小时温度。使用西方 ECL 试剂在化学发光成像仪中观察结合到 PVDF 膜上的抗体。所使用的抗体已列于表 1 中。

实时聚合酶链反应：
如前所述进行qRT -PCR 分析（ Maity 等。 , 2020 ) 。 RNAiso Plus 试剂用于按照制造商的方案从细胞中分离总 RNA。确认分离 RNA 的纯度和完整性，并使用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒使用 1 μg RNA完成 cDNA 合成。在实时 PCR 机器中使用 SYBR-Green PCR 预混液进行 RT-PCR。研究中使用的引物列于表 2。

表 2. 研究中使用的引物列表
S. 号姓名序列 (5 ′ -3 ′ )
1个α-SMA 正向GGAGATGGCGTGACTCACAA公司
2个α-SMA 反向CGCTCAGCAGTAGTCACGAA公司
3个FN1 前锋CCACCACCTGGTCTGGAG
4个FN1 反向GGGTGTGGAAGGGTAACCAG
5个Col1a 前锋CAATGGCACGGCTGTGTGCG
6个Col1a 反转CACTCGCCCTCCCGTCTTTGG公司
7Col3a 前锋TGGCACAGCAGTCCAACGTA公司
8个Col3a 反转AAGGACAGATCCTGAGTCACAGA公司
9肌动蛋白前向CACTGTCGAGTCGCGTCC
10肌动蛋白逆转TCATCCATGGCGAACTGGTG

TGF- β1治疗：
从细胞中去除用过的培养基，并用 PBS 洗涤；将无血清 DMEM 中的 10 ng/mL TGF-β1 添加到细胞中，然后在 37 °C 和 5% CO 2饱和度下孵育 24 小时。处理完成后，根据计划的实验收获细胞用于裂解物制备（蛋白质印迹分析）或 RNA 分离（ qRT -PCR 分析）。处理过的细胞也可以使用 4% 甲醛固定用于免疫荧光实验。

评论：
所有主要器官都有常驻成纤维细胞，这是结缔组织中最广泛存在的活性细胞（ Kendall 和 Feghali-Bostwick，2014 年）。它们在器官的正常运作中起着至关重要的作用。成纤维细胞对于调节影响不同器官细胞位点特异性分化的基因表达至关重要（ Rinn 等， 2006 ）。已证明成纤维细胞与不同细胞类型的相互作用在各种器官（包括肺、皮肤和胃肠道）的模式化中起着重要作用。成纤维细胞表达特定基因，这有助于为不同器官中的细胞提供身份，因此可用于研究器官特异性功能和器官发生过程（ Rinn 等， 2006 ）。纤维化是 ECM 蛋白（包括胶原蛋白）的过量产生以形成疤痕组织，是所有纤维化相关疾病的潜在过程。疤痕组织的产生对于封闭开放性伤口很重要。然而，如果不加管制，它可能成为许多疾病的基础，例如特发性肺纤维化、系统性硬化症、肾纤维化、肝硬化和心脏纤维化（张和张，2020 ）。除了纤维化，成纤维细胞也被证明在炎症和癌症进展中发挥作用。在一项已发表的研究中，已发现成纤维细胞维持炎症，最终导致类风湿性关节炎并支持肿瘤块的生长（ Mizoguchi 等。 , 2018 ;温克勒等人， 2020 年）。
在健康的心脏中，成纤维细胞可以再生功能性组织。已知它们参与伤口愈合、炎症、细胞增殖、ECM 沉积和最终重塑（ desJardins-Park 等。 , 2018 年）。心脏成纤维细胞在维持稳态和正常心脏功能以及涉及心脏重塑的病理状况（如高血压和心肌梗塞）中发挥重要作用。成纤维细胞参与的功能包括 ECM 蛋白的产生和沉积、与其他细胞类型（包括肌细胞）的相互作用和通讯，以及与内皮细胞和其他成纤维细胞的细胞间信号传导。这些相互作用已被证明可以调节细胞的电生理特性、细胞因子和生长因子的分泌以及血管生成。已经进行了几项研究来阐明成纤维细胞在所有这些过程中的作用，除了血管生成（ Souders 等。 , 2009 ) .心肌成纤维细胞通过分泌 ECM 形成支架，心肌细胞嵌入其中以创建健康心脏的 3D 结构。这导致心肌细胞和心脏成纤维细胞相互密集包装，使得难以分别研究每种细胞类型。因此，当它们在体外处于三维排列时，获取有关这些细胞的信息变得困难。
二维细胞培养已被证明是研究概念分子生物学的一种非常熟练的方法。虽然培养的永生化细胞系可以维持多次传代，但它们不能准确代表体外条件。因此，它们不是研究细胞生理和病理生理方面的最佳模型。因此，能够在体外二维培养中分别培养心脏成纤维细胞和心肌细胞以单独研究它们的功能至关重要。关于这些细胞的大部分已知信息，包括它们在心脏中的功能和形态以及它们在刺激时的行为，都可以通过在二维原代组织培养中进行实验来实现。在本研究中，培养的原代心脏成纤维细胞被证明比永生化细胞系具有更好的生物学相关性。受到刺激后，培养的这些细胞在体外反映出各种分子变化（ Landry等人，2021 年）。因此，这些细胞可用于研究不同条件下的多种细胞反应，因为它们最接近体外发生的过程（ Eghbali，1992 ）。然而，细胞传代 2-3 次后，心脏成纤维细胞倾向于转分化为肌成纤维细胞，其特征是 α-SMA 分泌增加( Rohr, 2011 ) 。
由于成纤维细胞参与各种疾病的发病机制，因此培养的成纤维细胞可以作为研究多种疾病和病理状况的合适模型。此外，培养的成纤维细胞可用于研究药物毒理学甚至药物筛选。从人体皮肤培养的成纤维细胞已在一项已发表的研究中用于阐明表面活性剂的细胞毒性作用和皮肤刺激性（ Lee 等， 2000 ）。在另一项研究中，从肺中分离出的成纤维细胞已被用于研究抗菌药物的毒性（ Krempaska 等。 , 2020 ) 。
虽然培养的心脏成纤维细胞不能完全模拟体外表型，但它们在生理学和病理生理学研究的多个方面被证明是一种有利的模型。例如，它们可以通过多种治疗方法进行选择性操作，而不会受到心肌细胞的干扰，因为它们是作为一个独特的同质群体培养的（ Ravi 等。 , 2021 年）。这些细胞可用于各种遗传和/或药物筛选目的，其完成时间可能比体外研究短。培养的心脏成纤维细胞也是研究负责其转化和调节ECM的产生和降解的因素的有益工具。此外，它们可用于阐明心脏成纤维细胞在内分泌活动中的作用（ Grupp 和 Müller，1999 ）。
由于多种原因，小鼠和大鼠被用于培养原代心脏成纤维细胞。大鼠和小鼠模型很容易获得，不需要高成本和技能。此外，这些小鼠模型得到了很好的研究，并且大多数已发表的关于信号通路和代谢的研究都是在这些模型中进行的（ Zaragoza 等， 2011 ）。
与永生化癌细胞系相比，培养的原代成纤维细胞在生物学研究中可作为更好的模型系统。这些细胞缺乏肿瘤抑制基因和癌基因的突变。因此，它们成为研究 DNA 修复、细胞周期调节和细胞凋亡的首选模型系统（ Alikhani 等。 , 2005 ;绍布勒等人， 2012 年； Marthandan等人。 , 2016 年）。此外，大多数现有协议使用复杂和专门的技术，如密度梯度离心。然而，我们的协议是一组简单的步骤，涉及所有实验室都可以轻松找到的常用机器和化学品。
尽管培养的原代成纤维细胞是研究纤维化的极好模型，但它们也有其局限性。由于与培养皿的固体表面接触，培养中的原代成纤维细胞可能自发地转分化为肌成纤维细胞。此外，由于这些细胞与活生物体中它们周围存在的其他细胞类型隔离生长，因此不可能完全理解成纤维细胞与不同器官中各种其他细胞类型之间的相互作用和信号通路所调节的相互作用和信号通路。

结果
使用所描述的协议，我们成功地从新生小鼠幼崽 (P0-P2) 中培养了原发性心脏成纤维细胞。此外，培养的细胞用纤维化的主要调节因子 TGF-β1 处理。总体而言，我们的结果证明了所描述协议的预期结果。此外，我们表明这些细胞可以在 TGF-β1 处理后转分化为活化的肌成纤维细胞。

培养的心脏成纤维细胞的可视化和表征
成纤维细胞在预电镀的初始阶段和开始附着到细胞培养皿的涂层表面时呈圆形。随着时间的推移，成纤维细胞扩散并牢固地附着在涂层培养皿上。最终，它们形成单层丰满的纺锤形细胞（图 2A）。一些细胞仍然是圆形的，即使在一天后也不会附着；这些细胞可以在传代细胞或更换培养基时使用 PBS 洗掉。在将成纤维细胞保持在汇合状态、使血清细胞饥饿或用 TGF-β1 处理细胞时，纺锤形成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞，其具有特征性的大表面积和质膜的各种突起（图 2B） ).

用 TGF-β1 处理心脏成纤维细胞
TGF-β1 是纤维化的主要调节剂之一。 TGF-β1 治疗是研究小鼠和培养细胞纤维化诱导的成熟模型。在 TGF-β1 处理后，成纤维细胞被激活并转分化为肌成纤维细胞。这可以通过增加 α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 的产生来表征，α-SMA 是一种肌成纤维细胞特异性标记物。 α-SMA 是一种细胞骨架蛋白，负责活化的肌成纤维细胞的流动性。此外，由于 TGF-β1 治疗导致纤维化的诱导，它伴随着 ECM 蛋白的产生和沉积增加，包括纤连蛋白 1 (FN1)、胶原蛋白 1a (Col1a) 和胶原蛋白 3a (Col3a)。它们充当纤维化标志物，它们的水平可以表明纤维化是否在治疗后开始。
为了证明分离的细胞确实是心脏成纤维细胞并且可以分化成肌成纤维细胞，我们用 TGF-β1 (10 ng/mL) 处理细胞 24 小时以诱导纤维化。使用和未使用 TGF-β1 处理的细胞用肌成纤维细胞特异性标记物 (α-SMA) 和纤维化标记物（FN1、Col1a 和 Col3a）染色。我们观察到 α-SMA 蛋白水平的增加及其排列的差异，证实了在 TGF-β1 处理后成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞（图 2C）。此外，我们可以注意到 FN1、Col1a 和 Col3a 的蛋白质水平增加，所有这些都是纤维化标志物（图 2C）。这意味着与对照组相比，用 TGF-β1 处理的细胞纤维化增强。
为了进一步巩固我们的主张，我们进行了蛋白质印迹分析以检查 α-SMA、FN1、Col1a 和 Col3a 的蛋白质水平。在无血清培养基中用 TGF-β1 (10 ng/mL) 处理细胞 24 小时，制备裂解物并在 SDS-PAGE 凝胶中电泳。我们发现 α-SMA、FN1、Col1a 和 Col3a 水平增加，从而证实与对照样品相比，TGF-β1 处理的样品中肌成纤维细胞的数量多于成纤维细胞（图 3A）。此外，我们进行了qRT -PCR 分析以检查 α-SMA、FN1、Col1a 和 Col3a 的 mRNA 水平是否有任何变化。在分析qRT -PCR 结果后，我们发现与对照相比，TGF-β1 处理的样品中 Col1a 的 mRNA 水平升高（图 3B）。然而，我们看不到其他基因的 mRNA 水平有显着差异。
我们的结果证明，使用该协议分离的细胞确实是心脏成纤维细胞，并且可以使用 TGF-β1 治疗分化成肌成纤维细胞。培养的心脏成纤维细胞可用于类似的研究，以评估各种药物的毒性以及此类治疗引起的表型和亚细胞变化。

图 2. 用 TGF-β1 处理的培养的原代心脏成纤维细胞。 (A)附着在聚-L-赖氨酸涂层培养皿上的新生大鼠心脏成纤维细胞的明场图像。比例尺：500微米。 (B)使用和不使用 TGF-β1 处理 24 小时的原代心脏成纤维细胞的亮场图像。比例尺：100微米。 (C)用 TGF-β1 处理原代心脏成纤维细胞 24 小时，并用 α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 作为肌成纤维细胞的标记，以及纤连蛋白 1 (FN1)、胶原蛋白 1a (Col1a) 和胶原蛋白 3a 染色(Col3a) 作为纤维化标志物。 Hoechst 33342 用于将细胞核染成蓝色。比例尺：50微米。

图 3. 用 TGF-β1 处理的心脏成纤维细胞的分子分析。 (A) TGF-β1 处理 24 小时后新生大鼠心脏成纤维细胞的蛋白质印迹分析。 Α-SMA 用作肌成纤维细胞标记物，FN1、Col1a 和 Col3a 用作纤维化标记物。肌动蛋白用作上样对照。 (B)用 TGF-β1 处理 24 小时的新生大鼠原代心脏成纤维细胞中α-SMA、FN1、Col1a 和 Col3a 的相对 mRNA 水平。肌动蛋白已用于标准化（作为内部控制）。用于统计分析的学生 t 检验 (* p ≤ 0.05)。数据以平均值±标准差表示

所需时间
表 3 中提到了根据所描述的协议从新生大鼠幼崽中进行初级心脏成纤维细胞培养所需的总时间。

表 3. 时间要求
程序时间（小时：分钟）笔记
基本协议
分别用水和 70% 乙醇对幼崽进行清洗和消毒0:10指定的时间段适用于 5–7 只幼鼠。时间可以根据使用的动物数量进行调整
幼崽安乐死0:15
通过解剖收获心脏0:15
将心脏切成小块0:10
马血清中心脏组织的消化和细胞收集1:30
在培养皿上播种细胞（预电镀）1:30
用培养基清洗和重新取代细胞（以去除未附着的心肌细胞）0:10
全部的4:00总时间可能会有所不同，具体取决于用于实验的动物数量和用户的专业知识。
支持协议
添加多聚-L-赖氨酸包被溶液并孵育0:30
取出溶液并风干0:30涂层应在组织消化之前或期间进行。

笔记

重要参数及故障排除
列出了使用我们的协议培养原发性心脏成纤维细胞时要注意的关键点。在可能的情况下，我们在协议中包含了提示，以避免每个步骤出现潜在问题。我们还编制了一个表格，在表 4 中列出了所有可能面临的问题及其可能的解决方案。

表 4. 常见问题的故障排除
问题问题的可能原因解决方案
心肌成纤维细胞产量低

较低的生存能力●小鼠/大鼠心脏组织碎片太大，无法正常消化

●使用的消解液不足

●未保持最佳条件，例如速度（rpm）或温度

●消解试剂过期或不合格导致消解不当

●消化循环不够

●过度消化

●机械应力过大

●在心脏的采集和消化过程中没有保持最佳条件

组织培养板包被不当服用大块会导致心脏组织消化不完全。应将一颗心脏切成约 1 毫米3的碎片（大鼠幼崽 4-5 片，小鼠幼崽 2-3 片），以获得更好的产量。

为了更好地消化，应添加足够的DM （每四只小鼠或一只大鼠心脏 130 μL ）。

摇床培养箱应设置为 250 rpm 和 37 °C 以进行消化。

确保使用的试剂是新鲜的和新的，并在推荐的温度下适当储存。

消化应进行足够数量的循环（9-10 个循环）。

心脏组织的消化不应超过 10 个周期。一个循环的消化时间不应超过 7 分钟。

应避免过度机械应力，如心脏组织过度切碎和长时间涡旋。摇床培养箱的速度不应超过 280 rpm。

收获后，应立即将切除的心脏置于冰冷的 PBSG 缓冲液中。在每个消化周期后，应将细胞收集在马血清中，并将 50 mL 试管保存在保持在 37 °C 和 5% CO 2饱和水平的CO 2培养箱内。

应使用适当的粘附剂对组织培养板进行适当的涂层。
细菌/真菌对细胞的污染●使用未经消毒的解剖工具和/或试剂

2培养箱或组织培养罩污染

●使用过期或劣质抗生素所有步骤都应在无菌条件下进行。所有工具和试剂都应消毒，包括剪刀和镊子。应使用新鲜刀片和新的无菌 50 mL 锥形离心机。缓冲液应新鲜并高压灭菌。 DM、马血清、完全培养基和用于包被板的试剂应过滤灭菌。

对培养箱进行热灭菌以对其进行去污。应经常对组织培养罩进行熏蒸或紫外线消毒。
在开始消化过程之前，将组织培养罩暴露在紫外线下至少 30 分钟。

应在使用前将抗生素添加到培养基中。对于含有抗生素的培养基，应避免反复冻融循环。
非成纤维细胞污染●预镀过多

●心脏采集过程中未完全去除其他器官的组织

预电镀不应超过 1 小时，因为其他细胞（心肌细胞）也可能开始附着在板的涂层表面。

在开始消化过程之前，应完全去除非心脏组织，如肺、隔膜或粘在心脏上的任何其他结缔组织。

食谱

1.消化混合物 (DM)
通过将 8 mL 胰蛋白酶 0.25% 溶液 1 × （不含酚红）与 4 mg II 型胶原酶混合并通过加入 1 ×无菌 PBSG 缓冲液。通过 0.22 μm注射器过滤器对该混合物进行灭菌。准备好的 DM 可以分装到小瓶中，并在- 20 °C 的冰箱中储存长达三个月。

2.含有 10% FBS 和抗生素-抗真菌混合物的 DMEM（完全培养基）
445 mL DMEM，高葡萄糖辅以 50 mL FBS（使用 0.22 μm注射器过滤器过滤灭菌）和 5 mL 100 ×抗生素-抗真菌溶液以制备完全培养基。该培养基可用于在消化步骤后接种原代心脏成纤维细胞并用于传代细胞。培养基应新鲜制备，因为抗生素和抗真菌剂在 4 °C 的冰箱中长时间储存可能会降解。

3.0. 01% (w/v) 聚-L-赖氨酸
0.1% (w/v)聚-L-赖氨酸在使用前用去离子水稀释至 0.01% 的工作浓度。这种稀释的工作溶液可以储存在 4 °C 的冰箱中。如果不存在浑浊或细菌生长，储存的溶液最多可使用三个月（如果被污染则丢弃）。

4.磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (1 ×)
通过溶解 2.7 mM制备 PBS 缓冲液 (1 ×) 氯化钾, 137毫摩尔 DDW 中的NaCl 、1.8 mM KH 2 PO 4和 10 mM Na 2 HPO 4 。必须借助 HCl 将 pH 值设置为 7.4。在用于细胞培养之前应进行高压灭菌，并在 4°C 的冰箱中储存（如果可以看到污染，则丢弃）。

5.磷酸盐缓冲盐水 - 葡萄糖 (PBSG) (1 ×)
PBS 按照配方制备并高压灭菌。通过将 1 mL 无菌 1 M D-葡萄糖（在水中）添加到 100 mL 高压灭菌的 1 × PBS 中，制备 PBS 中的 0.01 M 葡萄糖。 PBSG 不能高压灭菌，因为葡萄糖在高压灭菌时会降解。准备好的缓冲液可在 4°C 下保存长达一个月。

6.含 Tween-20 的磷酸盐缓冲盐水 (PBST) (1 ×)
PBS 按照配方制备并高压灭菌。 PBS 中的 0.05% Tween-20 是通过将 0.05 mL Tween-20 添加到 100 mL 高压灭菌的 1 × PBS 中制备的。准备好的缓冲液可在 4°C 下保存长达一个月。

7.含 Tween-20 的 Tris 缓冲盐水 (TBST) (1 ×)
通过将 20 M Tris、160 mM NaCl 和 0.05% Tween-20 溶解在 DDW 中来制备含有 0.05% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水。必须借助 HCl 将 pH 值设置为 7.4。准备好的缓冲液可在 4°C 下保存长达一个月。

8.转移缓冲液 (1 × )
通过将 12.5 mM Tris 碱基、230 mM 甘氨酸、0.125% SDS 和 20% 甲醇溶解在 DDW 中来制备转移缓冲液。它可以储存在4 °C，并应在一周内用完。

致谢

中央动物设施、共聚焦设施（微生物学和细胞生物学系）和位于班加罗尔的印度科学研究所因其服务和技术帮助而受到认可。这项工作得到了科学技术部、生物技术部、印度医学研究委员会和生物技术部-印度科学研究所高级研究伙伴关系计划的资助。 NRS 获得了创新青年生物技术学家奖 (IYBA)、国家职业发展生物科学奖和印度政府生物技术部的Ramalingaswami Re-entry 奖学金。该协议已从之前出版物中使用的协议进行了修改和改进（ Maity等人，2020 年）。
作者贡献： Shweta Kumar：数据规约、分析、调查、方法、撰写原稿、审查和编辑， Dimple Nagesh：调查、方法、撰写原稿， Venketsubbu Ramasubbu ：数据管理、调查、分析、方法论， Arathi Bangalore Prabhashankar ：数据管理、审查和编辑， Ravi Sundaresan ：资金获取、项目管理、资源、监督、审查和编辑。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。
数据可用性声明：支持研究的数据可根据要求提供给通讯作者。

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