材料与试剂
1.镜头清洁纸（Thor Labs，目录号：MC-50E） 2.#1.5 盖玻片（Warner Instruments，目录号：CS-15R） 3.35 mm 组织培养处理过的培养皿（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号： FB012920） 4.60 mm 组织培养皿（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号： FB012921） 5.浸油（Cargille Laboratories，目录号：16241） 6.Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（ATCC，目录号：30-2002） 7.OptiMEM（Gibco，目录号：02634） 8.0.05% 胰蛋白酶（Cytiva，目录号：SH30236.01） 9.聚乙烯亚胺（PEI）（Polysciences，目录号： 24765-1） 10.人胚肾 293-T 细胞（ATCC，目录号：CRL-3216） 11.胎牛血清（R＆D Systems，目录号：S12450） 12.青霉素/链霉素（Cytiva，目录号：SV30010） 13.CIBN-CAAX（Pietro De Camilli 博士，Addgene ID# 79574） 14.mCherry-CRY2-5Ptase OCRL （Pietro De Camilli 博士，Addgene ID# 66836） 15.mCherry-CRY2–mPKCε-CAT-HA ( Gada et al., 2022, Addgene ID# 190483 ) 16.NaCl（Fisher，目录号：S271） 17.KCl（Fisher，目录号：P217） 18.MgCl 2 （Fisher，目录号：M33） 19.CaCl 2 （Fisher，目录号：C79） 20.HEPES（奥克伍德化学，目录号：047861） 21.TIRF 成像解决方案（参见食谱）

设备
1.激光器（相干公司、OBIS LX445 1185051、OBIS LS 561 1253301 ） 2.相机（ Teledyne Photometrics，Prime95B ） 3.舞台（Mad City Labs， XYZ 纳米定位，型号：Nano-LPS） 4.可以修改以将微镜固定在物镜下方的任何内部或商业显微镜框架。我们使用 Mad City Labs Inc. 的 RM21 镜框。 5.微镜可从 Mad City Labs 获得 6.高数值孔径 (NA) 物镜（例如，Olympus 60×，Olympus 的 1.5 NA） 7.快速释放磁性样品架（Warner Instruments，型号：QR-42LP）
软件
1.Micromanager（加州大学旧金山分校， https://micro-manager.org ） 2.ImageJ（国家卫生研究院/Wayne Rasband， https://imagej.nih.gov/ij/ ）。或者，使用斐济（ImageJ）软件；一个 ImageJ 的构建，带有几个预填充的插件和宏，用于数据分析。

程序
在此协议中，以 mCherry-CRY2–mPKCε-CAT-HA、CIBN-CAAX 和 mCherry-CRY2-5Ptase OCRL的实验分析为例。 mCherry-CRY2–mPKCε-CAT-HA 是在 Gada 等人中开发和使用的。 2022; Idevall-Hagren 等人开发并展示了CIBN-CAAX 和 mCherry-CRY2-5Ptase OCRL 。 (2012)。简而言之，CRY2-CIBN 是形成光控二聚化系统的蛋白质伙伴，由隐花色素 2 (CRY2) 和 CIBN（转录因子 CIB1 的 N 末端区域）组成。 CIBN 通过 C 端 CAAX 盒固定在膜上（ Liu 等人，2008 年；Idevall-Hagren 等人，2012 年）。蓝光照射后，CRY2 吸收 FAD 分子，发生构象变化，促进与 CIBN 的结合，导致 CRY2 及其货物（在本例中为 mPKCε-CAT-HA）靶向膜。
A.设备设置
Larson等人描述了微镜 TIRF 显微镜的组装。 (2014)这构成了我们设备设置的基础。用于 TIRFM 的激光器是根据其提供以研究所需的适当激发波长为中心的连续光束的能力来选择的。我们通常使用可根据实验条件进行调制以改变输出功率的激光器 [例如，相干 OBIS 固态二极管激光器，其输出功率介于 5 – 150 mW （取决于波长）]。激光束与激光净化过滤器上游定制的开普勒扩束器相干。在这里，我们激发单体 Cherry (mCherry)，因此使用带宽为 10 nm (561/10 nm) 的 561 nm 净化过滤器。使用可放置在光束路径中的光功率计获得激光对准和输出的独立验证。可以使用适当的净化过滤器将多条激光线添加到系统中。例如，我们还在 561 激光器的下游分别使用 445 和 514 nm 激光器以及 445/10 nm 和 514/10nm 净化过滤器。这种布置允许广泛的多色成像应用。 445 nm 激光可用于激活本协议中描述的光遗传学探针。在扩展到 ~ 8 毫米后，激光线被组合成一个单一的相干入射光束，该光束聚焦到位于 TIRF 透镜下方的微镜上（图 1 ）。我们使用高数值孔径复消色差物镜 [60×，1.5 数值孔径 (NA)； Olympus] 安装在配备压电驱动纳米定位台（Mad City Labs, Inc）的开放式显微镜框架上。

图 1. 微镜 TIRF 的示意图。 A. 示意图显示 514 nm 激光线水平进入显微镜框架，位于镜头下方。相干光束被固定在臂 (a) 上的微镜反射 90°，进入 TIRF 物镜 (b)。镜头固定在螺纹安装座 (c) 中，第二个微镜 (d) 将出射光束从样品区域反射出去。调整系统以产生从玻璃盖玻片和样品之间的界面穿透约 100 nm 的倏逝波 (e)。 B. 特写显示渐逝波 (e) 没有穿透感兴趣细胞的细胞质。由 514 nm 激发激光束（即黄色荧光蛋白，如 eYFP 和 mVenus）形成的渐逝波激发的荧光团发出穿透 TIRF 透镜 (f) 中心光轴的黄光，最终被检测器收集. C. 示例图像显示使用所述设置在 TIRF 模式下研究的细胞表面捕获的单个 YFP 标记的膜蛋白。 D. 位于 TIRF 目标下方的微镜（a、d）的照片。激发光束被第一个微镜 (a) 反射 90°，进入透镜。镜头固定在螺纹安装座 (c) 中，并从样品区域反射 90°。不可见的荧光信号沿着透镜的中心轴在微镜之间传递。 E，从上方拍摄的微镜照片，镜头已移除。入口和出口微镜 (a, d) 可见，显示 514 nm 激发光束从入口微镜 (a) 反射。每个微镜都安装在固定镜头的螺纹安装座 (c) 下方的臂上。来自样品的荧光信号将沿着透镜的中心轴通过位于微镜下方的环形光阑（g）在微镜之间传递。
我们使用 Mad City Labs Inc 的 RM21 显微镜框架；然而，任何可以修改以适应物镜下方微镜的显微镜框架（包括旧的商业系统）都是合适的。一个微镜放置在光束路径中，直接位于物镜前缘的下方。微镜也可从 Mad City Labs Inc. 获得。调整透镜下方反射镜的位置可控制激发光束进入透镜的角度，从而控制倏逝波的深度和光束从透镜出射的位置（参见设置可视化的图形摘要）。调整微镜和透镜的相对位置以改变光在与细胞的界面处的折射方式。对于实验，镜头与具有相似折射率的非常低的自发荧光浸油配对 [例如，Cargille Type LDF（折射率为 1.5）]。在我们的研究中，mCherry 的发射通过放置在透镜下方、与入射镜相对的出射微镜与激发光束隔离（图形摘要）。位于微镜组件下方的环形光阑进一步减少了激光器与荧光团发射信号之间的串扰。当发射信号包含来自两个荧光团的荧光时，使用由两个 510 nm 长通滤波器组成的分束器将光束分成两个平行轨道。 mCherry 的峰值发射在 510 nm 以上。在其下游，mCherry 通过 620/60 nm 带通滤波器成像，然后在背照式 sCMOS 相机（Teledyne Photometrics）上捕获来自荧光的信号。在使用发射低于 510 nm 的第二荧光团的研究中，发射被定向到分束器另一臂上的适当带通滤波器。在每种情况下，激光输出和相机均由 Micro-Manager 免费软件（加州大学旧金山分校）控制。所有滤镜和镜子均来自 Chroma。透镜、针孔、光阑和功率计均来自 Thor-Labs。 TetraSpeck 珠子 (Thermo) 通常成像以映射 sCMOS 芯片并将渐逝场深度校准到 100 nm。
B.细胞接种
1.在含有无酚红的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 的生长培养基中，在 10 cm 组织培养处理过的培养皿中培养 HEK-293 细胞，辅以 1% 青霉素/链霉素和 10% 胎牛血清，并在 5% CO 2 条件下保持在37摄氏度。 2.细胞约 70% 汇合后，去除生长培养基并用 1 mL 的 0.05% 胰蛋白酶替换 1-2分钟。 3.当细胞从培养皿中分离出来时，在 35 毫米培养皿中的 15 毫米 #1.5 盖玻片上放置几滴（总共约 5–8 µL）胰蛋白酶化细胞悬浮液（图 2）。
图 2. 玻璃盖玻片的细胞接种程序以获得特定区域的单细胞
4.约 1 分钟后，将 2 mL 的生长介质（如步骤 B1 中所示）添加到 35 mm 培养皿中并孵育过夜。
C.细胞转染
1.确保细胞在转染前覆盖盖玻片面积的30% – 50%。 2.在离心管中的 50 µL OptiMEM 或任何低血清、无抗生素培养基中混合用于研究的结构质粒 DNA。 3.在另一个管中，以 DNA：PEI 的 1：4 比例添加转染试剂 PEI，并结合两个管的内容物。我们分别转染了 0.75 μg mCherry-CRY2–mPKCε-CAT-HA 和 CIBN–CAAX 或 mCherry-CRY2-5Ptase OCRL和 CIBN-CAAX。 4.用于估计背景的实验的细胞只能用 0.75 μg CIBN-CAAX 转染。 5.将转染溶液孵育 20 分钟。 6.从细胞中去除生长培养基并更换为 1 mL 的 OptiMEM。 7.将转染溶液添加到种子细胞中并孵育 2-3小时。 8.去除转染介质，每 35 毫米培养皿更换为 2 mL 的生长介质。 9.在 37 °C 和 5% CO 2下孵育过夜。
D.实验设置和数据采集
1.要准备 TIRF 设置，请用镜头清洁纸轻轻擦拭镜头，然后在镜头上滴一滴浸油。 2.将曝光时间设置为 100 毫秒，以最好地捕获荧光，而不会导致荧光漂白。 3.在 Micromanager 的数据采集功能下设置电影参数，每 2-5 秒采集一次数据，持续500 帧。 4.输入存储数据的存储盘位置的数据文件路径，并将存储方式设置为数据堆栈。 5.通过将盖玻片放置在支架内（图 3），将盖玻片安装在样品台上，旋转顶部以对齐磁力锁，并将盖玻片密封到位。
图 3. 样品架组件。 Warner Instruments 的快速释放磁性样品架，用于 1.5 毫米厚的圆形 15 毫米盖玻片（左）。样品架的组装（右）。
6.在盖玻片顶部轻轻添加 150 μL 的 TIRF 成像溶液，确保在此过程中细胞不会从玻璃上剪下来。 7.将样品架放在舞台上，并使用 Micromanager 调整舞台高度，使盖玻片上的细胞在白色透射光下可见。细胞在某些区域看起来靠得很近，而在某些区域则保持良好的间距。 8.在昏暗的环境光下，将 561 nm 激光设置为低功率（~20%），以可视化已成功转染的细胞中的 mCherry，并选择合适的细胞进行分析。 9.使用设置为 50%（或更低）功率的 561 nm 激光启动数据采集，以防止荧光团发生光漂白。 10.捕获两到三帧后，以全功率打开 445 nm 激光以触发 mCherry-CRY2-mPKCεCAT-HA 或 mCherry-CRY2-5Ptase OCRL招募到细胞表面，通过增加 mCherry 荧光进行宏观评估细胞表面通过数据采集过程。此处也可以使用普通的 488 nm 激光线。 11.数据采集完成后，将文件保存为 TIF 格式，将两个激光器置于待机模式，并更换盖玻片以开始从另一个细胞采集数据。 12.使用与 mCherry 标记结构相同的实验方案和激光，仅使用 CIBN-CAAX 转染背景信号的图像细胞。从 mCherry 荧光测量中减去来自背景的平均荧光信号。

数据分析
1.启动 ImageJ（或 FIJI）计算机程序（图 4 ）。 2.在 ImageJ 中，打开 TIF 文件（图 4 ）。
图 4 。在 ImageJ 中启动 TIF 文件。 A–C 描述了如何在 ImageJ 中启动（打开）TIF 文件。
3.单击图像 > 堆栈 > 工具 > 制作子堆栈（图 5 ） a.在称为“切片”的区域中，为您的切片编号。这将是您的背景切片，从中减去所有切片。在下图中，切片标记为“1”。 b.将切片 1 保存为“tiff”。
图 5. 创建和保存背景/基线切片。 A 和 B。描述了如何创建子堆栈切片。 C. 结果文件。 D. 描述了如何将子堆栈文件保存为 tiff。
4.接下来单击 Process > Image Calculator（图 6 ） a.在“图片 1”下。 b.使用下拉箭头选择您当前正在处理的文件的名称。 c.在“操作”下。 d.使用下拉箭头选择操作“减去”。 e.在“图片 2”下。 f.使用下拉箭头选择您在上一步中保存的切片 tiff 图像。 g.单击确定。 h.将弹出一条消息，询问您是否要处理所有图像；单击“是”。 i.将弹出一个包含已处理图像的新窗口（结果窗口）。使用此窗口向前移动。
图 6. 如何从所有图像/帧中减去背景/基线。 A. 描述如何启动图像计算器来处理图像。 B. 显示图像 2（切片文件）是如何从原始文件（图像 1）中减去的。 C. 表示所有图像/帧都已处理。 D. 结果文件。
5.单击图像 > 调整 > 亮度/对比度（图 7 ） a.滚动超出前几帧，然后单击自动。您现在应该能够看到您的细胞。 b.如果您没有看到您的单元格，请滚动浏览更多图像，然后再次单击自动。这样做直到您可以看到单元格。选择合适的亮度和对比度，以便将细胞与背景区分开来。 c.点击应用。 i.当警告像素值更改时，单击确定。 ii.当询问是否应用于所有切片时，单击“是”。
图 7. 如何调整亮度和对比度。广告。描述如何调整图像的亮度和对比度。
6.接下来单击分析 > 工具 > ROI 管理器 > 显示全部（图 8 ） a.在图像上选择 ROI；然后，单击添加 [t]（为添加的每个 ROI 执行此操作）。 b.添加所有 ROI 后，单击“更多”>“多测量”>“确定”。
图 8。如何选择和分析兴趣区域 (ROI)。 A. 指示如何启动感兴趣区域 (ROI) 管理器。 B. 在单元格上描绘五个 ROI。所选区域显示在右侧的窗口中。 C 和 D。描述了如何启动多重测量来测量所有图像/帧的 ROI。 E. 包含所有测量结果的窗口。
7.绘制平均荧光强度与时间的关系图，以创建时间进程或为各种时间点/处理创建摘要条形图。 8.在每个条件的分析中包括五个或更多单元格，以创建具有代表性图像和平均强度时间过程的摘要图，以及摘要（分别为图 9A和8B ）。
图 9. 最终数据表示。 A. 展示 mCherry-CRY2-PKCεCAT-HA 蓝光激活前后荧光强度的代表性图像。比例尺 = 10 µm。 B. 实验的时间进程；蓝色箭头表示 445λ 激光开启的时间点。 C. 显示 12 个细胞的平均荧光强度 ± SE 的汇总数据（ Gada 等人，2022 年）。

食谱
1.TIRF 成像解决方案氯化钠 130 毫米氯化钾 4 毫米氯化镁2 1.2 毫摩尔氯化钙2 2 毫米肝素 10 毫米用 NaOH 将 pH 值调节至 7.4。

致谢
我们感谢 Pietro De Camilli 博士提供 CIBN-CAAX 和 CRY2-5'ptaseOCRL ( Idevall-Hagren et al., 2012 ) 。这项工作由美国国立卫生研究院心脏、肺和血液研究所资助，向 LDP 授予 R01HL144615该协议在Gada 等人中得到验证。 (2022)。

利益争夺
作者声明他们与本文的内容没有利益冲突。

参考
Axelrod, D. (2001)。细胞生物学中的全内反射荧光显微镜。交通2(11)：764-774。 Gada, KD、Kawano, T.、Plant, LD 和 Logothetis, DE (2022)。一种光遗传学工具，可将单个 PKC 同工酶募集到细胞表面并促进膜蛋白的特异性磷酸化。生物化学杂志298(5)：101893。 Idevall-Hagren, O.、Dickson, EJ、Hille, B.、Toomre, DK 和 De Camilli, P. (2012)。磷酸肌醇代谢的光遗传学控制。 Proc Natl Acad Sci USA 109(35)：E2316-2323。 Larson, J.、Kirk, M.、Drier, EA、O'Brien, W.、MacKay, JF、Friedman, LJ 和 Hoskins, AA (2014)。多波长微镜全内反射荧光显微镜的设计和构造。 Nat Protoc 9(10)：2317-2328。 Liu, H.、Yu, X.、Li, K.、Klejnot, J.、Yang, H.、Lisiero, D. 和 Lin, C. (2008)。光激发的 CRY2 与 CIB1 相互作用以调节拟南芥中的转录和花起始。科学322(5907)：1535-1539。 Vangindertael, J.、Camacho, R.、Sempels, W.、Mizuno, H.、Dedecker, P. 和 Janssen, KPF (2018)。为喜欢冒险的生物学家介绍光学超分辨率显微镜。方法 Appl Fluoresc 6(2): 022003。 Zong, W., Wu, R., Li, M., Hu, Y., Li, Y., Li, J., Rong, H., Wu, H., Xu, Y., Lu, Y.,等。 (2017)。用于自由行为小鼠大脑成像的快速高分辨率微型双光子显微镜。国家方法14(7)：713-719。