材料与试剂
1. 875 cm 2 5 层培养瓶（Corning，Falcon® ，目录号：353144）
2. 75 cm 2培养瓶（Greiner Bio-one，Cellstar，目录号：658170）
3. 25 cm 2培养瓶（Greiner-Bio one，Cellstar，目录号：690175）
4. 10 厘米培养皿，培养处理（Greiner Bio-one，Cellstar，目录号：664161）
5. 6 孔板（Corning、Costar，目录号：3516）
6. 24 孔板（Corning，Costar，目录号：3524）
7. 96 孔板（Corning，Costar，目录号：3799）
8. 50 mL Falcon（Thermo Fisher，品牌TM 114821，目录号：10420602）
9. 15 mL Falcon（Thermo Fisher，品牌TM 114818，目录号：10345521）
10. 1.5 mL 管（Eppendorf，目录号：0030120086）
11. PCR 管（Eppendorf，目录号：0030124820）
12. 一次性色谱柱（Bio-Rad，目录号：7321010）
13. pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（Addgene，目录号：42230）
14. pSMART-HCKan， CloneSmart Blunt 克隆试剂盒（Lucigen，目录号：40704-2）
15. PHybr_r2a>mA-srt-his（Addgene，目录号：124806）
16. PHybr_r2a>m2a（沉默）-srt-his（Addgene，目录号：124807）
17. PX458-gR2A_ISO（Addgene，目录号：124808）
18. BbsI-HF ® （新英格兰生物实验室，目录号：R3539）
19. rSAP（新英格兰生物实验室，目录号：M0371）
20. T4 DNA 连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202）
21. T4 PNK（新英格兰生物实验室，目录号：M0201）
22. Q5 聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0491）
23. dNTP（Thermo Fisher，目录号：R0192）
24. ddH 2 O（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：AM9935）
25. 琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A4718）
26. Nancy-520（Sigma-Aldrich，目录号：01494）
27. NucleoBond Xtra Midi Plus EF 套件（Macherey-Nagel，目录号：740422.50）
28. NucleoSpin 凝胶和 PCR 清理（Macherey-Nagel，目录号：740609.50）
29. ISOLATE II 基因组 DNA 分离试剂盒（Bioline，目录号：BIO-52067）
30. 杂交瘤：大鼠 IgG2a，λ 抗小鼠 PD-L1 [MIH5]（内部）
31. 杂交瘤：大鼠 IgG2a，κ 抗小鼠 DEC-205 [NLDC-145]（ATCC，目录号：HB-290 TM ）
32. 杂交瘤：小鼠 IgG1，κ 抗人 CD20 [NKI.B20/1]（内部）
33. SF Cell Line 4D-Nucleofector TM X kit L（Lonza Biosciences，目录号：V4XC-2024）
34. PBS（Fresnius Kabi，目录号：M087312/01）
35. RPMI-1640（Thermo Fisher，Gibco TM ，目录号：42401018）
36. CD 杂交瘤培养基（Thermo Fisher，Gibco TM ，目录号：11279023）
37. 热灭活胎牛血清（FBS）（HyClone，目录号：SV35959）
38. Ultraglutamine-1（Lonza Biosciences，目录号：BE17-605E/U1）
39. 抗生素抗真菌药（Thermo Fisher，Gibco TM ，目录号：15240062）
40. β-巯基乙醇 ( β-ME) （Sigma-Aldrich，目录号：444203）
41. 台盼蓝（Thermo Fisher，Gibco TM ，目录号：15250061）
42. CELLine CL 1000 生物反应器（INTEGRA Biosciences AG，目录号：90005）
43. 杀稻瘟菌素（Invivogen，目录号：ant-bl-05）
44. 嘌呤霉素（Invivogen，目录号：ant-pr-5）
45. BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
46. NaN 3 （Sigma-Aldrich，目录号：26628-22-8）
47. 重组蛋白 G（Thermo Fisher，Pierce TM ，目录号：21193）
48. Ni-NTA 琼脂糖（ Quiagen ，目录号： 30230）
49. 抗6×His 标签（克隆 J095G46）（PE，Biolegend，目录号：362603）
50. 抗大鼠 IgG2a HC（克隆 MRG2a-83）（PE，Biolegend，目录号：407507）
51. 抗小鼠 IgG2a（克隆 m2a-15F8）（PE，eBioscience，目录号：12-4817-82）
52. 兔抗6×His 标签（克隆 RM146，未结合，Abcam，目录号：AB14923）
53. 山羊抗兔 IgG (H+L)（多克隆，IRD800，LI-COR，目录号：926-32211）
54. 山羊抗大鼠 IgG (H+L)（多克隆，AF680， Thermo Fisher，目录号：A-21096）
55. 洗涤缓冲液（见配方）
56. PBA（见食谱）
57. 培养基（见食谱）
58. 1× 选择培养基（见食谱）

设备

1. 电穿孔装置，例如 AMAXA 4D Nucleofector (Lonza BioSciences, AAF-1002X/AAF-1002B)
2. 加湿培养箱，5% CO 2
3. 热循环仪（例如，Bio-Rad，目录号：1861096EDU）
4. 流式细胞仪，例如 FACSLyric（BD Biosciences，目录号：663518）
5. 荧光扫描仪，例如 Amersham Typhoon TM 5（Cytiva，目录号：29187191）
6. Sanger测序服务

软件

1. Snapgene（来自 Insightful Science；可在snapgene.com获取）
2. FlowJo TM软件（俄勒冈州阿什兰；Becton, Dickinson and Company；2021 年）

程序

A. 一般注意事项

1. 在开始杂交瘤修饰之前，需要了解宿主物种和抗体同种型。我们使用切割位点敲入 CH1 重链 (HC) 上游或下游、铰链上游和 Cκ 轻链 (LC) 下游的插入片段，但实际上任何其他切割位点都可用于针对有可能的使用。
2. 从转染目标细胞系到分离出高水平的修饰抗体需要4-6周的时间（图 1）。

图 1. 工作流程概览。杂交瘤在第 0 天用编码成簇规则间隔短回文重复序列 ( CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 和引导核糖核酸 (gRNA) 的质粒以及编码同源定向修复的质粒转染 (HDR) 模板包含抗生素抗性基因。第 3 天，施加选择压力，细胞开始生长。扩展抗性克隆直至达到汇合，并在 96 孔板中制备单细胞克隆 (SCC)。到第 30 天时，筛选阳性克隆以产生修饰抗体并进行扩增以进行生产。

3. 为了本协议的目的并说明潜在应用的多样性，我们描述了三个成功编辑的杂交瘤的完整特征：大鼠 IgG2a (r2a) Ig 的恒定重链 (HC )的同种型转换为小鼠 IgG2a (m2a)恒定 HC 并产生嵌合 r2a(V):m2a(C) mAb，在 r2a HC 的铰链区引入抗原以产生 Fab' 片段-抗原融合，并修饰小鼠 IgG1 (m1) HC 和小鼠kappa (mκ) LC 引入两个位点特异性标签。

B. CRISPR/HDR模板和gRNA的设计

1. 要从头开始设计 HDR 模板和 gRNA， Addgene CRISPR 指南或CRISPR 101 一书是很好的起点。
2. 在图 2-6 中，逐步说明了设计 CRISPR/HDR 模板和 gRNA 的过程。我们以 m1 CH1 的 C 末端为目标来设计 mAb 分泌细胞系，以产生在 CH1 的 C 末端带有特定位点标记位点的 Fab' 片段。

图 2. 注释目标序列。 A.访问感兴趣基因座的基因组序列（例如，在 NCBI 基因上）。使用“序列文本”视图，可视化目标基因座中的外显子和内含子。 B.删除注释以仅可视化核苷酸序列。对于给定的基因座，外显子标记为红色，内含子标记为绿色。这里突出显示了Ighg1基因（mIgG1 恒定区）中的恒定重链 ( CH)1、铰链、CH2 和 CH3 。 C.复制Snapgene中的序列并注释外显子以识别目标区域。这通常取决于预期的修改。在这里，我们的目标是 mIgG1 的 CH1 的 C 端。

图 3. 目标基因座的识别。 A.确定敲入的目标区域。在这里，我们选择 CH1 结构域的 C 端插入部分铰链区、一个短链接器、一个位点特异性标记位点和一个多组氨酸标签。这有效地将 mAb 转化为 Fab' 片段，在其重链 (HC) 的 C 末端带有特定于站点的标记位点。 B.将选择的序列复制到 CRISPOR。 C.选择合适的宿主（此处为Mus musculus ）和 protospacer 相邻基序 (PAM)（通常为 -NGG）并提交。

图 4. gRNA 的选择。 A. Protospacer 相邻基序 (PAM) 序列和相应的 gRNA 候选者由 CRISPOR 识别。所有可能的 PAM 序列（此处为 -NGG）都在输入序列下方标识。 B.潜在 gRNA 的序列和特征显示为表格，按预测功效排序。如果可能，插入位点应距离双链断裂点小于 10 bp。当针对新区域时，根据它们与预期插入位置的接近程度和预测分数选择至少两个或三个 gRNA。在这里，我们选择了 gRNA_m1_HC (5 ' - CTTGGTGCTGCTGGCCGGGT-3 ' ) 。通过单击“克隆”，将打开一个新窗口，其中包含用于克隆到各种包含 Cas9 的载体中的序列。 C.我们使用了 U6 表达系统（U6 启动子、pX330 载体和衍生物）（Cong 等人，2013 年）。在这里，我们使用了 20 nt gRNA，但最近有人提议使用 19 nt gRNA 来提高效率（Kim 等阿尔。 , 2020) 。选择合适的引物并按照说明将 gRNA 克隆到 BbsI 站点的 pX330 向量中。

图 5. 在敲入位点插入所需的序列。 A.将 gRNA 序列复制到 Snapgene 和B.可视化原型间隔相邻基序 (PAM) 序列。插入序列以尽可能靠近 PAM 序列敲入。 C.插入包含所需插入片段的预定核苷酸。在这里，我们插入了部分铰链区 (VPRDC)，允许与 CH1 下游的轻链 (LC) 相关联，然后是多克隆位点 (MCS)、柔性接头 (GGGGS)、分类基序 (LAETGG) 和一个多组氨酸标签 (HHHHHH)，然后是一个终止密码子。插入后跟一个内部核糖体进入位点 ( IRES)，以允许转录杀稻瘟素抗性基因 (BSD) 和猿猴空泡化病毒 40 (SV40) poly A 尾巴以解离核糖体。每个域都被 MCS 包围，以便轻松交换质粒的任何部分。在这里，我们另外优化了 CH1 的一部分以改善与 LC 的关联（PACSTKVDKKI，S>C 突变）。

图 6. 同源臂 (HA) 和最终 HDR 模板设计。 HAs 跨度约。插入片段每侧 0.6 kb。它们的大尺寸允许 HA 和目标基因座之间存在一些不匹配，而不会影响 HA 在 HDR 期间与基因组基因座退火。因此，与最初从基因组浏览器获得的种系序列相比，可以在 HA 序列中进行小的调整，而不会影响 HDR 功效。 A.有必要对“NGG”原型间隔子相邻基序 (PAM) 序列进行突变。要使 PAM 序列失活，请将“NGG”突变为“NGC”、“NGA”或“NGT”。如果 PAM 序列位于编码区域内，请确保它是无声突变。或者，一起删除 PAM 序列。成功进行 HDR 的细胞将不包含 PAM 序列，并且 Cas9 将被灭活。 B.要定义 5'HA 和 3'HA，请在插入片段的每一侧选择 ~0.6 kb。

3. NCBI 基因上访问恒定免疫球蛋白位点的序列； protospacer adjacent motifs (PAM) 序列和 gRNA 可以使用CRISPOR确定或替代工具。
4. HDR 模板应包含位于所需插入片段两侧的 5 '和 3 '同源臂 (HA)、终止密码子、内部核糖体进入位点 (IRES)、抗生素抗性基因（杀稻瘟菌素或嘌呤霉素）和多聚腺苷酸尾（图8A – C）。插入片段的长度通常为 1 – 2 kb。虽然可以插入更长的片段，但 HDR 效果会大大降低超过 2 – 3 kb。 HA 的长度取决于插入片段的长度（每 1 kb 插入片段约 0.5 kb HA），通常介于 0.3 kb 和 1 kb 之间，尽管更短的 HA 是可能的。在这里，我们使用了 0.6 kb 的 HA。
5. 建议：对目标区域进行排序，以确保不存在来自种系的衍生，并确保下游外显子中的 PAM 序列和剪接受体序列已从 HDR 模板中的 HA 中移除。表 2 中提供了通用测序引物，补充文件中提供了通用 PCR 协议。通过T7 测定确定感兴趣区域的 gRNA 功效。
6. HDR 模板以双链 DNA gBlock 形式订购，并克隆到 pSmart 载体（例如， pSMART-HCKan、 CloneSmart Blunt 克隆试剂盒）中。候选 gRNA 被订购为单链 DNA 寡核苷酸，它们在 pX330 家族的载体中退火和克隆（Cong 等人，2013 年）。补充文件中提供了基本的克隆协议。
7. NucleoBond Xtra Midi Plus EF 套件和序列使用标准引物对编码 HDR 和 gRNA 模板的质粒 DNA 进行 midipreps 。 A 260 :A 280比率应至少为 1.8。
8. 我们开发了质粒，能够修饰大鼠 IgG2a 杂交瘤的 HC，用新的同种型替换完整的恒定区，在铰链处切割并插入任何感兴趣的标签（Fab' 片段）（van der Schoot 等人， 2019 ），并修改小鼠杂交瘤的 mIgG1 CH1（如图 2-6 所示并记录在视频中）和 Cκ kappa LC （Le Gall等人，2021 年）。我们发布的质粒可在 Addgene 上或应要求提供。使用标准分子克隆技术和专用限制位点可以轻松交换 HA 之间的插入片段。表 1 中报告了 gRNA，表 5 中报告了 HA（注释）。

表格1。本协议中使用或提及的 gRNA。表 5 中报告了相应 HDR 模板的 HA 序列。

C. 杂交瘤细胞培养和转染前抗生素滴定

已成功进行 HDR 重组的细胞的选择是在抗生素压力下进行的。在程序之前确保亲本细胞系的质量至关重要（见注释）。应测试目标杂交瘤的抗生素（杀稻瘟菌素/嘌呤霉素）敏感性在开始实验之前。
1. 在完全培养基中培养目标杂交瘤细胞，无论是在内部产生还是从美国典型培养物保藏中心获得。确保将细胞维持在高活力 (> 90%)。
2. 汇合后，在 6 孔板中每孔接种 1 × 10 6 个细胞，加入 3 mL 培养基，并补充 0、0.5、1、2、4、8、10 或 20 μg/mL 的适当抗生素.
3. 在 37 孵育细胞 °C 3 – 7 天，具体取决于所选抗生素（嘌呤霉素 3 天，杀稻瘟菌素 7 天）。
4. 使用台盼蓝确定培养物中没有活细胞的最低浓度，并使用确定的浓度执行选择程序（图 7A - B）。

图 7. 耐药细胞的抗生素滴定、转染和扩增。 A.嘌呤霉素对野生型 (WT)抗人 CD20 [NKI.B20/1] 的滴定。连续稀释 0–12.5 μg/mL 嘌呤霉素。 48 小时后，细胞在处理条件下开始死亡。健康的杂交瘤细胞呈圆形、规则且成簇生长。死亡或濒临死亡的细胞失去圆形并变得不规则。死细胞可以在 0.5 μg/mL 时被发现，一些活细胞保持高达 4 μg/mL。从 8 μg/mL 开始，细胞明显死亡。训练有素的眼睛可以轻松识别细胞的活力。 B.为了量化生存能力，台盼蓝染色可以区分活细胞（白色）和死细胞（蓝色）。在这里，我们选择了 8 μg/mL 嘌呤霉素来执行该程序。 C. AMAXA 试管和程序（细胞系 SF、CQ-104）。小心地吸取电极（箭头）之间含有细胞和 DNA 的悬浮液，不要引入气泡。 D.选择后，小簇开始在大多数死亡或死亡细胞中的 HDR 转染板中生长（第 6 天）。这些耐药细胞已经成功地进行了 HDR。传代板，直到较大的簇开始长出（第 10 天）并向融合方向生长（第 13 天）。相比之下，绿色荧光蛋白 (GFP) 转染的杂交瘤仍然死亡，看不到簇（第 13 天，右）。当板已满时，进行有限稀释。 E.有限稀释后，单克隆细胞系可以很容易地在各自孔的底部（箭头）识别出来。扩展和表征这些细胞系。

D. 杂交瘤细胞的转染

6野生型杂交瘤细胞进行电穿孔。在来自 SF Cell Line 4D-NucleofectorTM X 试剂盒的 SF 转染培养基中长时间重悬细胞是有害的：快速、有条理地进行转染。
1. 在第 0 天，使用高活力（>90%）的融合野生型杂交瘤细胞进行电穿孔。
2. 将 3 mL 培养基添加到 6 孔板中，并在 37°C 下孵育。在 50 mL Falcon 中预热培养基。
3. 从所需细胞系中分离杂交瘤细胞（1,500 rpm，5 分钟，4 °C）。
4. 在适量的洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀（目标为 1 × 10 6 – 2 × 10 6 个细胞/mL）
5. 使用台盼蓝计数细胞并将 1 × 10 6 个细胞转移到 1.5 mL Eppendorf 管中。
6. 在台式离心机中旋转细胞悬浮液 [1,500 × g ，5 分钟，室温 (RT)]。
7. 在此期间，在 0.2 mL Eppendorf 管中制备两个或任何所需数量的 DNA 混合物，方法是在每个条件下吸取 1 μg Cas9/gRNA + 1 μg HDR 模板，以及 2 μg pMAX-GFP 作为模拟转染控制（DNA 混合管子）。
8. 使用以下参数准备 4D-Nucleofector：程序 CQ-104，细胞系 SF。
9. 小心吸出细胞沉淀的上清液。
10. 在转移到含有 HDR 模板 + gRNA 或 pMAX-GFP 的 DNA 混合管之前，将 100 μL 的 SF 转染培养基添加到细胞颗粒中并重新悬浮细胞。
11. 重新悬浮并小心地将悬浮液转移到 Lonza 核转染试剂盒提供的 100 μL 电穿孔比色皿的底部（图 7C）。轻轻敲击比色杯，确保样品覆盖电极和比色杯底部，并检查没有气泡。
12. 盖上盖子并将比色皿插入 AMAXA nucleofector。按显示屏上的“开始”以使用以下参数执行电穿孔：程序 CQ-104，细胞系 SF（图 7C）。
13. 小心地将 1 mL 的预热介质添加到比色皿中，并立即将细胞转移到带有预热介质的 6 孔板中（井中的总体积现在约为 4 mL）。避免重复吸入细胞。
14. 用培养基清洗试管以确保所有细胞都被转移。
15. 继续进行下一次转染（从步骤8 开始重复）。
16. 2培养箱中孵育 6 孔板。

E. 工程杂交瘤细胞的选择和单克隆细胞系的产生

本节介绍如何选择成功设计的杂交瘤细胞来识别 HDR 编辑的克隆。这是通过转染后第 3 天 HDR 和 GFP 转染的杂交瘤的抗生素选择压力完成的。抗性细胞生长至融合并可产生单克隆细胞系。
1. 转染细胞在无选择培养基中培养两天，以允许电穿孔细胞生长。在第 1 天，使用荧光显微镜检查转染细胞的活力（通过眼睛）和转染控制细胞的 GFP 表达。小心处理细胞以保持活力。
2. On day 3, either scrape the cells loose or resuspend until the cells detach and transfer all 4 mL of cell suspension to a 10 cm Petri dish containing 5 mL of pre-warmed culture medium supplemented with the appropriate selection drug at twice the predetermined concentration ( 2×选择培养基）。用 1 mL 培养基清洗井，收集所有细胞并转移到培养皿中。转移细胞后，应将培养皿中的最终体积用培养基调整至10 mL，以确保细胞处于1×选择培养基中。
3. 从第 5 天开始，每周两次，传代转染细胞。简而言之，刮掉松散的细胞并转移到 15 mL Falcon 管中。将 5 mL 新预热的 1× 选择培养基放入 10 cm 培养皿中。向下旋转（1,500 rpm，5 分钟，RT）并丢弃上清液。在 2 mL 预热的 1× 选择培养基中重悬细胞沉淀，并将悬浮液转移回培养皿中。用 3 mL 的 1× 选择培养基清洗 15 mL Falcon，然后转移回培养皿中。
4. 根据抗生素的不同，到第 5-10 天时，很明显 HDR/gRNA 转染板中的大多数死细胞中正在形成小簇，而 GFP 转染的细胞都死了（图 7D）。如果未观察到细胞死亡，则应调整抗生素浓度（见注释）。如果在抗生素压力下没有活细胞生长，请参阅列出的故障排除解决方案（见注释）。
5. 传代细胞直到这些簇长出以达到更高的汇合度和活力（图 7D，>90%，通常在第 15-20 天左右）。当 HDR 转染的细胞已满时，GFP 板中的细胞仍应全部死亡。此时，丢弃 GFP 转染板，并继续限制 HDR 转染细胞的稀释。完成此步骤后，不再需要抗生素压力。如果很少有簇生长得非常缓慢，或者一些细胞在 GFP 转染的板中仍然存活，最好将选定的抗生素保留在培养基中，直到鉴定出单克隆细胞系。
6. 在五个圆底 96 孔板中预板 100 μL 每孔培养基，并在 37 °C下孵育。
7. 刮下汇合的 HDR 转染细胞松动并向下旋转细胞悬浮液（1,500 rpm，5 分钟，RT）。保留 1 mL 的上清液样品并丢弃其余样品。
8. 在 5 mL 培养基中重新悬浮细胞，并使用台盼蓝计数。分两步稀释培养基中的细胞，以获得浓度为 3 个细胞/mL 的 50 mL 悬浮液。
[示例：初始悬浮液为 1.5 × 10 6 个细胞/mL → 稀释因子：500,000 (1.5 × 10 6 /3)。首先在 50 mL 培养基中稀释 500×、100 μL 细胞悬液（3,000 个细胞/mL）。然后取 50 μL 细胞悬液（3,000 个细胞/mL）并在 50 mL 培养基中稀释 1,000×（浓度 3 个细胞/mL）。]
9. 板 100 μL/孔的悬浮液在圆底 96 孔板中。最终浓度为 0.3 个细胞/孔，200 μL 或 33 个细胞/板。
10. 从原始细胞悬浮液中保留约 500,000 个细胞用于基因组 DNA (gDNA) 分离（ ISOLATE II 基因组 DNA 试剂盒分离试剂盒）。降速并按照制造商的说明进行操作。
11. 通过遵循标准的冷冻保存协议冷冻保存大量人口的剩余细胞。
12. 在单细胞克隆 (SCC) 增长的同时，应立即对大量人口及其上清液进行表征，以整合 HDR 模板。为此，请按照数据分析部分中的第 1-3节进行操作。

F. 改良杂交瘤细胞的扩增

1. 在不更换培养基的情况下，在 37 °C下孵育板 10-15天。
2. 当 SCC 在井底可见时（图 7E），将它们转移到新的平底 96 孔板中，并添加 100 μL 的新培养基。
3. 当细胞汇合时，收集并冷冻上清液并将克隆扩展到 24 孔板，然后是 T75 烧瓶。
4. 收集约 500,000 个细胞用于 gDNA 分离并冷冻保存扩增的克隆。

数据分析

选定克隆的特征（来自大量和/或 SCC 群体）

验证细胞系是否产生正确的抗体（片段）至关重要。应首先对大量人群进行筛查，以确保程序成功，然后再对 SCC 进行筛查。我们通常结合三种或更多方法来确保插入整合和正确的蛋白质生产：在遗传、蛋白质和功能层面。下面提供了几个例子来说明不同的方法。这个简单的协议不需要统计分析，直到蛋白质的功能表征。如果耐药细胞不产生修饰抗体，请参阅列出的故障排除解决方案（见注释）。

为了说明这一部分，我们展示了使用该技术修饰的三种不同细胞系的完整特征。
• MIH5 是一种大鼠 IgG2a，λ 杂交瘤，可产生与鼠 PD-L1（一种由癌细胞和骨髓细胞表达的蛋白质）结合的单克隆抗体。 PD-L1 是基于 mAb 的癌症治疗（检查点抑制剂）中的治疗靶点。我们利用小鼠 IgG2a (m2a) 和小鼠 IgG2a L234A/L235A/N297A（m2a （沉默））同种型（图 8A）设计了 MIH5 细胞系，产生嵌合抗 PD-L1 抗体（van der Schoot 等。 , 2019) 。
• NLDC-145 是一种大鼠 IgG2a,κ 杂交瘤，可产生与小鼠 DEC-205 结合的单克隆抗体，DEC-205 是一种由交叉呈递树突细胞亚群表达的 C 型凝集素。由于其表达受限，DEC-205 是开发靶向疫苗的有前途的目标，该疫苗可有效地将抗原递送至能够最好地引发 T 细胞反应的受限细胞群。我们设计 NLDC-145 以产生截短抗体（Fab' 片段），其带有来自模型抗原卵清蛋白 (OVA) 的 CD8 T 或 CD4 T 细胞表位（分别为 Fab'OTI 和 Fab'OTII）（图 8B）（Fennemann 等人未发表的数据等人，2021 年）。
• NKI.B20/1 是小鼠 IgG1,κ 杂交瘤，可产生与人 CD20 结合的单克隆抗体。 CD20 是 Rituximab 的靶标，Rituximab 是一种用于治疗 B 细胞淋巴瘤、类风湿性关节炎或狼疮的 B 细胞消耗性单克隆抗体。我们生成了一个 NKI.B20/1 细胞系，它产生一个 Fab' 片段，在 HC 和 LC 上带有两个正交位点选择性修饰位点（图 8C）：HC 上的 LAETGG-His-tag 和 LPESGG-Myc-tag 基序在信用证上。该构建体可用于生成具有两种不同有效载荷的同源抗体-药物偶联物（Le Gall 等人，2021 年）。

图 8. 在遗传、蛋白质和功能水平上验证三种工程化细胞系。 A.用于将大鼠 IgG2a 杂交瘤同种型转换为小鼠 IgG2a 的 HDR 模板和 gRNA。 B.大鼠 IgG2a 杂交瘤与 Fab' 抗原 (Fab'Ag) 的 HDR 模板结构和 gRNA。此处介绍的 Ag、OTI 和 OTII 肽。 C.用于编辑小鼠 IgG1 杂交瘤 LC 的 HDR 模板和 gRNA。在此策略中，HC 和 LC 都被编辑以形成带有两个站点选择性修改站点的 Fab' 片段（此处显示 LC 编辑）。 D.使用位置特异性 (1) 和 HDR 特异性 (2) 引物组对从 m2a 和 m2a （沉默）抗性克隆中分离的 gDNA 进行 PCR 扩增。 E.使用位置特异性 (1) 和 HDR 特异性 (2) 引物组对从 Fab'OTI 和 Fab'OTII 抗性克隆中分离的 gDNA 进行 PCR 扩增。 F.使用位置特异性 (1) 和 HDR 特异性 (2) 引物组对从 mκ 抗性克隆中分离的 gDNA 进行 PCR 扩增。 G.为每种同种型选择单克隆杂交瘤后，将上清液与表达 PD-L1 的靶细胞 (CT26) 一起孵育，并用抗 r2a、抗 m2a 或抗 His 标签对细胞进行染色。显示的图表明，上清液仅包含带有 C 末端 His 标签的工程同种型变体，而原始 rIgG2a mAb 不存在。 H. Fab'-OTI 和 -OTII 的蛋白质印迹，针对 His 标签（绿色）和大鼠 IgG2a（蓝色）染色。蛋白 G 分离的 NLDC-145 抗体用作阴性对照 (WT)。 I. WT mAb CD20、Fab'HC 和 Fab'HC+LC 蛋白的 SDS-PAGE 凝胶内荧光（Sypro 染色）可视化显示在 HC 和 LC 编辑后分子量发生变化。 J.代表性传感图显示 MIH5 WT 和 MIH5 改造的 mAb（WT r2a、m2a、m2a沉默）在增加浓度（0.49–1000 nM）下与固定化鼠 FcγR（FcγRI、FcγRIIb 和 FcγRIV）的相互作用。与 FcγR 的结合以共振单位 (RU) 表示。 K.用于比较 MIH5 同种型变体的效应子功能的体外抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 测定。 MC38 细胞经过51 Cr 标记，用 m2a 或 m2a （沉默） MIH5 同种型变体调理，并暴露于 C57BL/6 小鼠的全血 4 小时。通过测量51 Cr 释放（n = 3，平均值 ± SEM，* p < 0.05）来量化特异性裂解，并表明 m2a 诱导表达 PD-L1 的细胞的特异性裂解，而 m2a 在体外没有活性（沉默）。 L. 体内消耗测定。用紫色和红色示踪染料标记的脾脏 B 细胞用作体内耗竭的靶细胞，并用 m2a （沉默）变体或 m2a 进行调理。随后，将 B 细胞按 1:1（m2a:m2a （沉默）或 m2a （沉默） :m2a （沉默））混合，并静脉内注射到 C57BL/6 小鼠中。二十四小时后，分离脾脏，并通过流式细胞术确定荧光标记细胞群之间的比率，以量化靶细胞的同种型特异性消耗，表明 m2a 和 m2a（沉默）在体内均有功能（ n = 3 , 平均值± SEM, * p < 0.05)。 M.使用 Flt3L 和 OP9-DL-1 饲养层从骨髓中产生表达 DEC-205 的鼠树突细胞（Kirkling等人，2018）。在第 8 天，使用 CD11c 微珠分离CD11c +细胞，并与 1 μM Fab'OTI、5 nM OVA 257-263 （SIINFEKL，阳性对照）或 10 μM OVA 一起孵育。 2 小时后，洗涤细胞并暴露于补充有 0.3 μg/mL 脂多糖 (LPS) 的培养基中新鲜分离的荧光标记的 OTI CD8 T 细胞。 72 小时后，通过流式细胞术分析细胞的增殖（细胞染料稀释）和活化标记物（未显示），并通过 ELISA 分析上清液的促炎性 IFNγ 和 IL-2 细胞因子的产生。 Fab'OTI 处理的树突状细胞诱导 CD8 T 细胞增殖和激活，表明它被表达 DEC-205 的树突状细胞摄取并加工，并且 CD8 T 细胞表位呈现在 I 类主要组织相容性复合体 ( MHC )上（n = 3，均值 ± SD，ns：不显着，**** p < 0.0001，单向方差分析，采用 Tukey 多次测试校正）。 N.第 8 天，将表达 DEC-205 的鼠树突细胞与 1 μM Fab'OTII、1 μM OVA 323-339 （ISQAVHAAHAEINEAGR，阳性对照）或 10 μM OVA 一起孵育。 2 小时后，洗涤细胞并暴露于补充有 0.3 μg/mL LPS 的培养基中新鲜分离的荧光标记的 OTII CD4 T 细胞。 72 小时后，通过流式细胞术分析细胞的增殖和激活标记物表达（未显示），并通过 ELISA 分析上清液的促炎性 IFNγ 和 IL-2 细胞因子的产生。 Fab'OTII 处理的树突状细胞诱导 CD4 T 细胞增殖和激活，表明它被表达 DEC-205 的树突状细胞吸收并加工，并且 CD4 T 细胞表位呈现在 II 类 MHC 上（n = 3，平均值 ± SD，ns：不显着，* p < 0.05，** p < 0.01，单向方差分析，使用 Tukey 对多次测试进行校正）。 O.在 HC 上用H-GGG-CK(FITC)-NH 2和在 LC 上用H-GGG-K(N 3 )-NH 2顺序位点特异性标记的 Fab'CD20 的 SDS-PAGE 分析证实引入了两个不同的货物特定于所引入图案的工程 Fab' 和功能。 P.针对 mAbNKI.B20/1-AF647 的每种工程蛋白的抗原结合竞争分析显示，在 CRISPR/Cas9 编辑和顺序双位点特异性标记后，蛋白质不会失去与其靶标的结合亲和力。 D、G、J、K、L。改编自 van der Schoot等人。 (2019) E、H、M、N。改编自 Fennemann 等人。 (2021) F、I、O、P。改编自 Le Gall等人。 (2021)。
B：杀稻瘟素抗性基因，FITC：异硫氰酸荧光素，H：铰链，H 6 ：六组氨酸标签 (HHHHHH)，HA：同源臂，HC：重链，HDR：同源定向修复，I：内部核糖体进入位点 (IRES)， IFNγ：干扰素γ，IL-2：白介素-2，LC：轻链，myc：myc-tag (EQKLISEEDL)，OVA：卵清蛋白，P：嘌呤霉素抗性基因，pA：poly A 尾巴，PAM：protospacer adjacent motif，PD -L1：程序性死亡配体 1，PEG：聚乙二醇，srt：sortag 基序，WT：野生型。

1. 目标基因座的 PCR 扩增以确定 HDR 整合
应对散装和 SCC 种群进行 PCR 筛选。为此，使用从 ~ 500,000 个细胞中分离出的 gDNA，并使用仅与插入序列退火的引物以及在 HA 区域外的插入位点周围退火的位置特异性引物对目标位点进行扩增。使用 ~100 ng gDNA 使用标准 PCR 程序（提供于补充文件）。表2 提供了在插入我们的 HDR 模板后可用于扩增鼠 IgG1 HC、鼠 Kappa LC 和大鼠 IgG2a CH1 HC 的引物序列。

表 2. 目标区域 PCR 扩增的位点特异性和 HDR 特异性

• 在 1% (w/v) 琼脂糖凝胶上运行 PCR 产品，并使用 Nancy-520 (1:15,000) 可视化 DNA。
• 通过工程 MIH5 [r2a>m2a 和 r2a>m2a（沉默）（r2a_iso_fw + blast_rv，图 8D）]，NLDC-145（ r2a>Fab'OTI 和 r2a>Fab'OTII（r2a_HC_fw + blast_rv，图 8E））和 NKI.B20/1 [mκ> mκ-srt-myc（mκ_LC_fw + ires_rv，图 8F）] 细胞系。
• 应切除正确高度的条带并进行凝胶纯化，以进行 Sanger 测序并确认正确整合。

2. 杂交瘤上清液的流式细胞术分析
可以进行流式细胞术筛选以研究例如 His 标签/Myc 标签、HC、LC 或某种同种型的表达。
对于第一个屏幕，在 4°C 下将 50 μL 的大量人口或 SCC 与 50,000 个目标表达细胞孵育 20 分钟。用 PBA 两次洗涤后，使用表 3 中所示的抗体进行二次染色，以染色所产生抗体的所需部分（同种型、标签等）。

表3。用于通过流式细胞术分析杂交瘤产生的二抗。

• 对于旨在选择高产克隆的第二个屏幕，使用类似的工作流程，但包括对阳性克隆上清液的连续稀释。建议携带已知浓度的亲本抗体的稀释液来计算样品中的抗体量。
• 我们修改了产生 r2a 的 MIH5 细胞系以产生 m2a 和 m2a （沉默）同种型，并将未稀释的 SCC 上清液与表达 PD-L1 的细胞一起孵育（图 8G）。流式细胞术分析显示初始细胞系而非选定克隆产生了原始同种型，并且产生了带有 His 标签的 m2a 同种型，证明了正确的整合。

3. 杂交瘤上清液的蛋白质印迹分析
可以进行流式细胞术筛选以研究例如 His 标签/Myc 标签、重链、轻链或某种同种型的表达，而不需要大量的靶标表达细胞。需要在选定的克隆上单独确认与目标的绑定。
• 我们通常使用斑点印迹法进行首次筛选。为此，取每个单细胞克隆的上清液 3 μL，并使用 96 孔板作为指南点在硝酸纤维素膜上。让硝酸纤维素膜干燥 30 分钟，然后使用表 4 中指示的抗体对所产生抗体的所需部分（同种型、标签等）进行阻断步骤和一般西方印迹协议的二次染色。
• 对于第二个屏幕，使用阳性克隆的稀释上清液以使用传统的蛋白质印迹确认正确蛋白质的产生。在这里，我们分析了 NLDC-145 工程细胞系的上清液，使用抗 rIgG2a (H+L) 和抗 His 标签（图 8H）生产 Fab'OTI 和 Fab'OTII。结果显示，与 50 kDa 的野生型 (WT) HC 相比，产生带有 His 标签的 25 kDa HC，证实了 HDR 插入。
• 或者，SDS-PAGE 分析可以确认正确产品的生产（图 8I）。在这里，我们依次将 NKI.B20/1 亲本细胞系修饰成一个细胞系，该细胞系产生一个 Fab' 片段，在其重链和轻链上带有两个位点特异性修饰位点。在第一步和第二步修改之后，我们分别检测到 HC 从 50 kDa 向下移动到 25 kDa (HC WT > HC Fab'-srt-his)，以及 LC 向上移动 (LC WT > LC- srt - myc ）（图 8I）。

表 4. 用于表征正确插入片段存在的抗体

4. 确认功能性蛋白质的产生
确认所选克隆产生功能性抗体对于验证所选细胞系至关重要。
a. 生产高水平的修饰抗体
基于基因组筛选和蛋白质水平的确认，可以根据其产量和生长速率选择一个克隆，并用于生产高水平的修饰抗体。为此，按照制造商的说明，将选定的克隆扩展到 5 层烧瓶或 CELLineCL 1000 生物反应器。
b. 修饰抗体的分离
隔离方法取决于插入物的性质。 HDR 模板可以设计为包括纯化标签，例如 His 标签或 Myc 标签，亲和树脂可用于这些标签（例如 Ni-NTA 琼脂糖）。不包含此类标签的抗体可以使用例如蛋白 G 树脂分离，在这种情况下，培养基需要无血清（CD 杂交瘤培养基）。
c. 功能测定
确认抗体功能所需的检测通常取决于修饰的性质、目标和预期用途。在这里，我们提供了我们为验证所提供的细胞系而进行的功能测定的示例。这些结果说明 CRISPR/Cas9 在免疫球蛋白基因座中的敲入保留了抗体的特异性，并且插入片段是有功能的。

• 我们生成了产生 m2a 和 m2a （沉默）同种型 mAb 的 MIH5 细胞系。为了确认同种型的功能，我们对固定化鼠片段可结晶γ受体 (FcyR) 上的纯化 mAb 进行了表面等离子共振分析（图 8J）。正如预期的那样，m2a 抗体与鼠类 FcγR 结合，并且结合被 m2a 中引入的突变（沉默）消除。此外，我们对用不同同种型调理的表达 PD-L1 的癌细胞进行了体外杀伤（图 8K）。与来自 C57BL6/J 小鼠的全血孵育显示 m2a 而非 r2a (WT) 和 m2a （沉默）的靶细胞特异性裂解。类似地，用m2a或 m2a （沉默）调理的脾细胞的体内杀伤（图 8L）揭示了 m2a 处理的细胞比 m2a （沉默）的特异性杀伤。总之，这些结果验证了新型嵌合抗体的功能（van der Schoot 等人，2019 年）。
• 工程化的 NLDC-145 细胞系产生 Fab'OTI 和 Fab'OTII，可用于将抗原特异性递送至表达 DEC-205 的树突细胞 (DC)。 OTI 和 OTII 抗原分别被 CD8 OTI 和 CD4 OTII 原代 T 细胞在 DC 呈递到 MHC 分子上时识别。我们将表达 DEC-205 的原代鼠树突细胞与不需要加工的构建体、短肽（阳性对照、OVA 257-264或 OVA 323-339 ）或 OVA 蛋白孵育 2 小时。然后，我们将 DC 暴露于抗原特异性 CD8 或 CD4 T 细胞（图 8M-N），这些细胞标记有 Cell Trace Violet (CTV)。 CD8（图 8M）和 CD4（图 8N）通过增殖（通过流式细胞术稀释 CTV）、激活标记表达和上清液中促炎细胞因子的产生来测量 T 细胞活化 [interleukin-2 (IL-2) ), 干扰素γ (IFNγ) 通过 ELISA]。 CD8 和 CD4 T 细胞在暴露于短肽和 Fab' 抗原融合的 DC 识别其同源抗原后增殖并产生促炎细胞因子。这证实了 Fab' 抗原融合蛋白保留了它们被 DC 处理和呈递的能力，并有效诱导 T 细胞活化（Fennemann 等人未发表的数据）。
• 最后，我们生成了一个 NKI.B20/1 细胞系，该细胞系在 HC 和 LC 的 C 末端产生带有正交位点选择性修饰位点的 Fab' 片段（Le Gall 等。 , 2021) 。为了确认正交位点的功能，我们依次修改 HC 以引入异硫氰酸荧光素和 LC 以引入叠氮基团，如荧光 SDS-PAGE 所证实（图 8O）。通过对表达 CD20 的靶细胞进行竞争性结合测定，我们最终证实了位点特异性修饰不会改变与靶标的结合（图 8P）。

笔记

我们已成功地将此协议应用于各种杂交瘤细胞系。我们建议操作员在开始基因工程之前充分了解目标细胞系的生长速度、生产水平和活力。我们发现以下细节可以帮助改进程序：

1. 确保亲代细胞系的质量
杂交瘤可能会随着时间的推移而失去生产能力或生存能力低下，这会严重影响程序的有效性。为了解决这个问题，我们建议操作员通过执行有限稀释（如 E 部分所述）来亚克隆亲本系，并量化 SCC 的生存能力和 WT 抗体产生，以选择新的单克隆系。这确保了选择具有高产量的高度可行的亲本克隆。对亲代细胞系进行亚克隆也证实了 SCC 可以生长。如果亲本系的活力没有提高，调整培养条件，例如通过去除 β-ME（确保抗体生产不受损）或增加培养基中的 FBS 浓度，将细胞以 800 rpm 的速度旋转 10 分钟而不是 1,500 rpm 5 分钟，或使用 Lymphoprep 等密度梯度去除死细胞。
2. 确认亲本线对抗生素压力的敏感性
通常情况下，杂交瘤系对选择抗生素没有抗性，我们不需要对模拟转染的杂交瘤进行抗生素滴定。可能并非每个细胞系都是如此，在某些情况下，需要对模拟转染的杂交瘤进行滴定。如果是这种情况，请按照 D 部分模拟转染细胞系，然后按照 C 部分中的指示进行滴定。
3. 在手术过程中调整选择药物的浓度
细胞死亡大约在第 2-3 天开始。对于嘌呤霉素，细胞应在第 7 天死亡，而对于杀稻瘟素，细胞应在第 10 天死亡。在抗生素压力下，我们通常会在 GFP 和 HDR 转染板中观察到大量细胞死亡。如果不是这种情况，则选择药物的浓度太低。即使在滴定后也可能发生这种情况，操作人员应增加浓度。
4. 如果细胞在抗生素压力下没有长出
如果转染细胞不能承受抗生素压力，请尝试以下解决方案。在转染和 GFP 转染效果之前检查杂交瘤的活力。对目标区域进行排序，以确保不存在可能影响 gRNA/HDR 效率的突变。执行 T7 测定以确定 gRNA 切割目标轨迹的能力，并在必要时尝试其他 gRNA。检测支原体污染。通过饥饿（低/无 FBS）在转染前同步细胞。加入非同源末端连接抑制剂，如诺考达唑，以支持 HDR。
5. 如果 SCC 在有限稀释后没有长出
虽然我们从未遇到过这个问题，但某些细胞系在有限稀释后可能无法生长。为了解决这个问题，将培养基中的 FBS 浓度加倍可以拯救单个细胞。此外，使用条件培养基进行有限稀释可以帮助单细胞存活。要生成条件培养基，请在 10 厘米培养皿中从亲本细胞系中培养 ~1 × 10 6 个细胞。二十四或四十八小时后，根据生长速率，离心上清液并通过 0.45 µm 过滤器。
6. 如果耐药细胞不产生（仅）修饰抗体
在抗性克隆中，我们通常会发现很大一部分正确编辑的克隆会产生大量抗体 (50% – 90%)。我们发现散发性 SCC 可以抵抗抗生素压力并显示插入物的正确整合，但会产生 WT 抗体，我们将其归因于等位基因排除的异常。通常，其他 SCC 会产生正确的蛋白质，因此应该选择其他 SCC。
但是，如果所有在抗生素压力下存活的 SCC 通过 PCR 显示插入目标区域的整合但不分泌修饰抗体，则 HDR 模板可能需要调整。例如，由于选择性剪接，SCC 可以抵抗抗生素压力但同时产生修饰抗体和 WT 抗体，或仅产生 WT 抗体。为了解决这个问题，删除 3 '中插入片段下游外显子的剪接受体序列，并在合成外显子上游插入合成剪接受体序列（如 GCTAGCGATCGCAGGCGCAATCTTCGCATTTCTTTTTTCCAG）。特别是如果在外显子的上游敲入，请确保插入片段在拼接后与可变序列在框架内。

表 5. 本协议中使用的同源臂。粗体：成功 HDR 重组后突变的 PAM 序列使 Cas9 失活。或者，完全切除供体序列是可能的（例如，Fab r2a_HC）。下划线：rIgG2a CH1 外显子上游的原始剪接受体位点：在 HDR 模板中移除或突变以防止可变区与原始同种型的可变剪接。

食谱

1. 洗涤缓冲液
PBS + 0.5% 牛血清白蛋白

2. 聚苯乙烯
PBS + 5% BSA + 0.03% NaN 3

3. 培养基
RPMI-1640（含 HEPES 的配方）+ 10% 热灭活 FBS + 2 mM ultraglutamine-1 + 1% (v/v)抗生素-抗真菌剂+ 新添加的 50 μM β-ME。

4. 1×选择培养基
RPMI-1640（含 HEPES 的配方）+ 10% 热灭活 FBS + 2 mM ultraglutamine + 1% (v/v) antibiotic-antimycotic + 新鲜添加的 50 μM β-ME + 新鲜添加的预先确定浓度的选择抗生素。

致谢

MV 获得了 ERC 启动补助金 CHEMCHECK (679921) 和 NWO 的化学免疫学重力项目研究所终身教职补助金。 FAS 是 LUMC 战略基金 (#049–19) 的接受者。这项工作源自我们研究小组先前由 van der Schoot等人发表的两篇论文。 (2019) 和 Le Gall 等人。 (2021)。我们感谢 Arthur EH Bentlage 和 Gestur Vidarsson（Sanquin，阿姆斯特丹，荷兰）收集表面等离子体共振数据（van der Schoot等人，2 019）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

本协议中描述的工作部分在动物身上进行，该工作已获得地方当局对动物实验和动物福利的伦理评估 (Instantie voor Dierenwelzijn Radboudumc) 的批准。根据联邦和州动物研究政策以及欧盟指令（指令 2010-63-EU）的附件 III 饲养小鼠。

参考

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