材料与试剂
1. 9厘米培养皿（Sangon Biotech，目录号：F611001）
2. 水培罐（Koraba，目录号：53506733434）
3. 刀片和镊子
4. 1.5 mL管（南通海迪实验设备有限公司，目录号： B030003）
5. 封口膜（Parafilm，目录号：pm996）
6. 显微镜载玻片，76×26 mm（Sangon Biotech，目录号：F518101）
7. 盖玻片，24×60 mm（Sangon Biotech，目录号：F518118）
8. 水稻种子（Shuhui 527，籼稻）
9. 甘油（Sangon Biotech Co.，Ltd，目录号：A501745-0500）
10. 封固剂（ Thermo Fisher，目录号：008030）
11. NH 4 Cl （ Sigma，目录号： A9434-500G ）
12. Ca(NO 3 ) 2 ·4H 2 O （ Sigma，目录号： C1396-500G ）
13. MgSO 4 ·7H 2 O （ Sigma，目录号： M2773-500G ）
14. K 2 SO 4 （ Sigma，目录号： P0772-250G ）
15. NaH 2 PO 4 ·2H 2 O （ Sigma，目录号： 71500-250G ）
16. FeSO 4 ·7H 2 O （ Sigma，目录号： F7002-500G ）
17. Na 2 EDTA·2H 2 O （ Sigma，目录号： 03685-500G ）
18. H 3 BO 3 （西格玛，目录号： B0394-100G ）
19. ZnSO 4 ·7H 2 O （ Sigma，目录号： Z0251-500G ）
20. CuSO 4 ·5H 2 O （ Sigma，目录号： 209198-250G ）
21. MnCl 2 ·4H 2 O （ Sigma，目录号： M3634-100G ）
22. (NH 4 ) 6 ·Mo 7 O 24 ·4H 2 O （生工生物，目录号： A600067-0100 ）
23. 甲醛（ Sigma-Aldrich，目录号：F8775 ）
24. 乙酸（ Sigma-Aldrich，目录号：A6283 ）
25. Na 2 HPO 4 ·12H 2 O （Sangon Biotech，目录号：A607793）
26. 乙醇（任何制造商）
27. 文化解决方案（见食谱）
28. FAA 固定液（见食谱）
29. 0.2 M PBS (pH 7.0) （见配方）

设备
1. 恒温培养箱（上海景鸿实验室仪器有限公司，目录号：GNP-9080）
2. LED照明（福建九坡生物科技有限公司，目录号：WL50）
3. 频谱分析仪（EVERFINE，目录号：PLA-30）
4. Eppendorf Research ® plus Pipette（100–1,000 μL 移液器，目录号：3120000062）
5. 真空（LABCONCO，CentriVap DNA 真空浓缩器，目录号： 7970037 ）
6. 光学显微镜（尼康，型号： ECLIPSE Ni-U ）

软件
1. 图片J（美国国立卫生研究院， https://imagej.nih.gov/ij/index.html ）

程序
A. 水稻栽培
1. 挑选饱满的水稻种子，不经灭菌放入培养皿中，加入20mL蒸馏水淹没种子。将培养皿放入37℃恒温培养箱中 °C两天。在此期间，每 12 小时换一次水（图 1A）。
2. 选择根长相同的发芽种子。胚朝上，一一放入水培槽的孔中。用自来水填充水培罐；液面应达到种子胚根。在 30 °C的 14:10 小时暗/光循环中，将水培罐放在白光下约 50 μ mol m –2 s –1的生长室中（图 1A）。
3. 生长大约两天后，将水换成培养液并再生长十天。在生长过程中，当液位过低时补充一些培养液（图 1B）。

B. 光处理
1. 打开设置为 100% 的灯光。用光谱分析仪检测离光板不同距离的光强，找到50和300μmol m –2 s –1的位置。
2. 准备三个培养皿并用培养液填充。选择九个健康的幼苗（每个培养皿三个）并将它们水平放置在培养皿中。用一个大盒子盖住它们 3 小时（图 1C）。
3. 暗处理3 h后，取出两个培养皿，分别放置在光照强度为50 μ mol m –2 s –1 （弱光）和300 μ mol m –2 s –1 （强光）；剩下的一个留在黑暗中（图 1D）。
4. 将幼苗置于光处理下 2 小时。

C. 采样
1. 准备三个 1.5 mL 管，并用移液器将 1 mL 的 FAA 固定剂添加到每个管中。将它们标记为黑暗、弱光和强光。用锋利的镊子在每个管子上打一个小孔。
2. 光处理后，剪出小方块（2 × 2 毫米，每个两个）用刀片在叶鞘的上侧，然后将它们放入相应的管子（图 1E）。必须在与光处理相同的环境中切割样品。具体来说，用50 μmol m –2 s –1弱光处理的样品必须在50 μmol m –2 s –1弱光下切割；经 300 μmol m –2 s –1强光处理的样品必须在300 μmol m –2 s –1强光下切割。这样的操作保证了样品切割过程中叶绿体在样品中的分布不会发生变化。在黑暗或昏暗的光线条件下采集经过深色处理的样品。在每个样品的右上角切一个小三角形作为标记，以防止观察时样品的正反面不清楚（图1F）。
3. 用真空设备真空 FAA 管，直到没有气泡出来，慢慢排气，让固定溶液进入组织（将管保持在-0.1 MPa 下 5 分钟就足够了）。如果真空过程中有任何损失，请将一些 FAA 固定剂补充到管中（图 1G）。
4. 用密封膜密封管口并在 FAA 固定液中固定 4 小时 24 小时摄氏度。

D. 观察

1. 用 0.2 M PBS 清洗样品 3 次，每次 5 分钟。
2. 用一滴 50% 的甘油将样品面朝上放在幻灯片上，然后用盖玻片轻轻盖住它。用安装介质密封盖玻片。
3. ×油镜的光学显微镜上观察样品并拍照（图 1H）。

图 1. 实验程序说明。 (A) 种子发芽。 (B) 培养10天的幼苗，选择健康的幼苗，并将它们放入培养皿中。 (C) 黑暗处理 3 小时。 (D) 光照处理 2 小时。取出两个培养皿，分别放置在光照强度为50 μ mol m –2 s –1 （弱光）和300 μ mol m –2 s –1 （强光）的位置。 (E)用刀片在叶鞘的照明侧切出小方块（2 × 2 毫米）。 (F) 在每个样本的右上角剪一个小三角形，放入 FAA 固定剂。 (G) 用真空设备对 FAA 管进行真空处理，并在 4 时固定在 FAA 固定液中 24 小时摄氏度。 (H) 在带 100倍油镜的光学显微镜上观察样品并拍照。

数据分析

如图 2 所示，可以看到野生型植物细胞中叶绿体的不同分布模式。在适应黑暗的植物细胞中，大多数叶绿体位于细胞底部。在弱白光处理下，大部分叶绿体移动到细胞的上侧。然而，叶绿体在强白光刺激下沿背斜细胞壁移动。

图 2. 野生型细胞的上视图。 (A) 黑暗下野生型细胞的上视图。 (B) 弱光下野生型细胞的上视图。 (C) 强光下野生型细胞的上视图。 Scare bar = 5 μ m。

食谱

1. 培养液
对于 10 L 工作培养液，添加 10 mL 营养液I、II、III、IV 和 VI，50 mL营养液V 和 9.9 L H 2 O。将 pH 值调节至 5.8 – 6.0，用使用前的盐酸。
组件_ 试剂量（克/升）
营养液Ⅰ 氨水4氯 58
Ca(NO 3 ) 2 ·4H 2 O 142
营养液Ⅱ MgSO 4 ·7H 2 O 324
营养液Ⅲ 钾2 SO 4 71.4
营养液IV NaH 2 PO 4 ·2H 2 O 40.3
营养液V FeSO 4 ·7H 2 O 6.965
Na 2乙二胺四乙酸·2H 2 O 9.315
营养液VI H 3 BO 3 0.934
硫酸锌4 ·7H 2 O 0.035
CuSO 4 ·5H 2 O 0.031
MnCl 2 ·4H 2 O 1.5
(NH 4 ) 6 ·Mo 7 O 24 ·4H 2 O 0.074

2. FAA 固定液
试剂库存集中度每 100 毫升的量终浓度
甲醛 38% 5毫升 1.9%
醋酸 100% 5毫升 5%
乙醇 70% 90 毫升 63%
甘油 100% 5毫升 5%

3. 0.2 M PBS（pH 值 7.0）
溶液 A：0.2 M Na 2 HPO 4 、7.164 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 溶于 100 mL 蒸馏水中
溶液 B：0.2 M NaH 2 PO 4 、3.121 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O 于 100 mL 蒸馏水中
将 61 mL 的溶液 A 和 39 mL 的溶液 B 放在一起，混合均匀，在 pH 7.0 下制成 0.2 M PBS。
HCl溶液用于调节pH值。

致谢

本研究得到浙江省自然科学基金 (LY20C130004, LGN19C130006) 和国家自然科学基金 (91335103) 的资助。该协议由 Zhang 等人修改。 (2022)。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Kong, SG 和 Wada, M. (2014)。了解叶绿体光重定位运动分子机制的最新进展。 Biochim Biophys Acta 1837(4)：522-530。
Kong, SG 和 Wada, M.（2016 年）。叶绿体光迁移运动的分子基础。 J Plant Res 129（2）：159-166。
Suetsugu, N.、Higa, T. 和 Wada, M.（2017 年）。蕨类植物、苔藓和地钱作为光介导叶绿体运动的模型系统。植物细胞环境40(11)：2447-2456。
和田 (2013)。叶绿体运动。植物科学210：177-182。
Zhang, Y., Dong, G., Wu, L., Wang, X., Chen, F., Xiong, E., Xiong, G., Zhou, Y., Kong, Z., Fu, Y.,等。 (2022)。 Formin 蛋白 DRT1 影响水稻的总体形态和叶绿体迁移。植物生理学。 doi：10.1093/plphys/kiac427。