材料和试剂

1. U 形细胞培养瓶，斜颈，75 cm 2 （Corning，目录号： 430641U）
2. 96 孔 ELISA 板（Fisher Scientific，Corning，目录号：07-200-640）
3. 6孔板（Fisher Scientific，康宁，目录号：07-200-80）
4. PrecisionGlide TM 25G 针（BD，目录号： 305125 ）
5. 预涂有硅胶 F254（Sigma-Aldrich，目录号：717185）的薄层色谱 (TLC) 板
6. Waters TM Corp Sep-Pak C18 3 cc Vac 墨盒（Fisher Scientific，目录号：50785823）
7. 受保护的 RNA亚磷酰胺[ ChemGenes ，目录号：ANP-5671 ( rA -CE)、ANP-5673 ( rG -CE)、ANP-6676 (Ac- rC -CE) 和 ANP-5674 ( rU -CE)]
8. 寡核苷酸合成仪空柱（阿里巴巴，目录号：HJ-H-818）
9. CPG-500Å固体支持物（ ChemGenes ，目录号：N-6103-05）
10. 无水乙腈或 ACN (CH 3 CN)，HPLC 级（Sigma-Aldrich，目录号：34851-4L）
11. 二氯甲烷中的 3% 三氯乙酸（ ChemGenes ，目录号：RN-1462）
12. 乙腈溶液 (0.25 M) 中的 5-乙硫基-1H-四唑 (ETT)（ ChemGenes ，目录号：RN-1466）
13. 四氢呋喃（THF）（Sigma-Aldrich，目录号：186562-1L）
14. CapA （ 80% THF/10% 乙酸酐/10% 2,6-二甲基吡啶）（ ChemGenes ，目录号：RN-1458 ）
15. CapB （THF 中的 16% N-甲基咪唑）（ ChemGenes ，目录号：RN-7776）
16. 3-((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮)( DDTT) ( ChemGenes ，目录号： RN-1588)
17. 氢氧化铵（Sigma-Aldrich，目录号：221228-500mL）
18. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418-100mL）
19. 三乙胺三氟化氢（Et 3 N·3HF）（Sigma-Aldrich，目录号：344648-25g）
20. 乙酸钠（Invitrogen，目录号：AM9740）
21. N-乙酰-D-半乳糖胺（ Thermo Fisher Scientific，目录号：J66095.06）
22. 乙酰氯（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 219472500 ）
23. 叠氮化钠（ NaN 3 ）（ Thermo Fisher Scientific，目录号： J21610.A1 ）
24. 碘化钠 ( NaI )（ Thermo Fisher Scientific，目录号：203182500）
25. 2'-O-炔丙基腺苷 (n- bz ) CED亚磷酰胺（ ChemGenes ，目录号：ANP-7751）
26. 2'-O-炔丙基胞苷 (n- bz ) CED亚磷酰胺（ ChemGenes ，目录号：ANP-7752）
27. 2'-O-炔丙基鸟苷 (n- ibu ) CED亚磷酰胺（ ChemGenes ，目录号：ANP-7753）
28. 2'-O-炔丙基尿苷 CED亚磷酰胺（ ChemGenes ，目录号：ANP-7754）
29. 溴化铜 (I) ( CuBr )（ Thermo Fisher Scientific，目录号：047211.30）
30. 叔丁醇 ( tBuOH )（ Sigma-Aldrich，目录号：471712）
31. 磷酸二氢钠 ( NaH 2 PO 4 ) （Fisher Scientific，目录号：567545500GM）
32. 磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 ) （Fisher Scientific，目录号：7558794）
33. 氯化钠 (NaCl)（ Fisher Scientific，目录号：AC447300010 ）
34. 改良伊格尔培养基（DMEM）（ Fisher Scientific，目录号：MT10027CV）
35. 胎牛血清（FBS）（ Fisher Scientific，目录号：MT35010CV）
36. L-谷氨酰胺（ Fisher Scientific，目录号：AAJ60573A1）
37. Lipofectamine TM RNAiMAX转染试剂（Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：13778075）
38. 人ApoB ELISA 开发试剂盒（HRP）（MABTECH lnc . ，目录号：3715-1H-6）
39. 3,3',5,5' 四甲基联苯胺底物（ Thermo Fisher Scientific，目录号：J61325.EQE）
40. 考马斯（Bradford）蛋白质测定试剂盒（ Thermo Fisher Scientific，目录号：23200）
41. 人载脂蛋白 AI/ApoA1 DuoSet ELISA 试剂盒（R&D Systems，目录号：DY3664）
42. 底物试剂包（R＆D Systems，目录号：DY999）
43. 停止溶液 2 N 硫酸（R&D Systems，目录号：DY994）
44. 蛋白酶抑制剂混合物（Fisher Scientific，目录号：PIA32965）
45. 抗 MTTP/MTP 抗体（Abcam，目录号：ab63467）
46. β-肌动蛋白（D6A8）兔单克隆抗体（ Cell Signaling，目录号：8457 ）
47. 抗兔 IgG，HRP 连接抗体（Cell Signaling，目录号：7074）
48. 磷酸盐缓冲液（PBA 10 × ）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：AAJ62851AP）
49. 氧化溶液（THF/吡啶/水中的 0.02 M 碘，7:2:1 v/v）（ ChemGenes Corporation，目录号：RN14552L）
50. 螺帽管（ Thermo Scientific，目录号：AB1389500）
51. 固相合成柱玻璃料（ BioAutomation ，目录号：FR-1502-1）
52. 分子生物学级（200 标准）乙醇（Fisher Scientific，目录号：BP2818100）
53. RNase/DNase 游离水（MP Biomedicals TM ，目录号：MP112450204）
54. 3-氯丙醇 ( Thermo Scientific TM ，目录号：C0270100G）
55. TEAAC 缓冲液（详见 B 部分，#14）
56. 8 M 尿素（详见 B 部分，#15）
57. 30% 丙烯酰胺/双原液 ( Thermo Scientific TM ，目录号：HBGR329500）
58. 10X TBE 电泳缓冲液（Invitrogen，目录号：AM9864）
59. TEMED（热 Scientific TM ，目录号：17919）
60. 过硫酸铵 (APS) ( Thermo Scientific TM ，目录号：17874）
61. 上样缓冲液 ( Thermo Scientific TM ，目录号：J62832S0)
62. 溴化乙锭 10mg/ml（ Invitrogen TM ，目录号：15585011）
63. Tm 缓冲液或磷酸钠缓冲液 pH 6.5（参见配方）
64. 含有一片蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液 K（参见食谱）

设备

1. 核磁共振 NMR （Brucker，Ascend 500 MHz 光谱仪）
2. 自动固相寡核苷酸合成仪（BIOSSET Ltd，ASM800 ）
3. DNA/RNA speed-vac 浓缩器（ Thermo Electron Corporation，Savant DNA 120 SpeedVac Concentrator）
4. 质谱仪（安捷伦科技，精确质量 Q-TOF LC/MS 6530）
5. 紫外-可见光谱仪（Perkin Elmer，Lambda 35 UV/VIS Spectrometer）
6. 圆二色性（CD）分光旋光仪（JASCO，J-815分光旋光仪）
7. ChemiDoc TM触摸成像系统（Bio-Rad，1708370）
8. Eppendorf离心机（Eppendorf，5424）
9. 紫外灯 ( MilliporeSigma TM Supelco TM , Z16964114EA)
10. 管左轮手枪旋转器（热科学商标, 88881001)
11. 加热印迹 ( Thermo Scientific TM , 88870003)

程序

A. 化学修饰的新型 miR-30c-3p 类似物的合成（图 1）

注意：标准亚磷酰胺和试剂可从ChemGenes 获得。使用 Oligo-800 DNA/RNA 固相合成仪以微摩尔规模合成修饰的反义 miR-30c 寡核苷酸。该系统在氦气保护下。合成从 3' 到 5' 方向进行，每个合成循环有四个主要步骤：脱三苯甲基化、偶联、加帽和氧化，在一个循环完成时添加一个核苷酸。所有合成步骤都在控制孔玻璃 (CPG-500) 上进行，该玻璃具有通过柱内琥珀酸酯连接器固定的第一个核苷酸碱基。

图 1. RNA 合成的准备工作。 (A) 带玻璃料的固相合成空柱。 (B) 装有两个玻璃料的柱子，将 CPG-500 珠子固定在中心，合成发生的地方。 (C) 将柱子安全地堆到系统上。 (D) 拧上每个核苷酸 AUCG 储层，测量并溶解在无水乙腈 (ACN) 中。

1. 将修饰的和天然的 RNA亚磷酰胺分别溶解在无水乙腈中，浓度为 0.07 M。
注：0.07 M 是每种亚磷酰胺（改性和天然）的最终浓度；无水乙腈的体积由商业 AUCG亚磷酰胺的长度、序列和分子量决定。
2. 用两个玻璃料组装柱子，将 CPG-500 Å 珠子固定在中心，合成发生的地方。
3. DMTr -off 模式下使用 Oligo-800 合成仪，以一微摩尔的规模对修饰的 miR-30c 类似物进行自动化固相寡核苷酸合成。所有必需的亚磷酰胺溶液，包括 A、U、C 和 G，都预先填充到合成线中，并在合成开始前进行压力检查。
注意：这是一个自动系统；输入序列是最终的合成产物。该合成在每个合成循环中添加一个核苷酸，从脱三苯甲基化开始到氧化结束。在 1.5 巴的工作压力下，八聚体RNA的平均时间为4 小时。
a. 三氯乙酸的二氯甲烷溶液去除寡核苷酸 3' 端的 5' DMT 保护基团。
b. 用 ETT（0.25 M 的乙腈溶液）进行偶联 12 分钟。
c. CapA （80% THF/10% 乙酸酐/10% 2,6-二甲基吡啶）和CapB （16% N-甲基咪唑的 THF 溶液）对 5'-OH 进行封端
d. 用 20 mM 的碘溶液在吡啶/THF/水中进行磷酸主链氧化；硫代磷酸酯主链的合成是用硫化试剂 DDTT 进行的。
4. 合成周期完成后，将 RNA 产物转移到螺帽管中。
5. 在室温下使用 800 μL 的浓缩氢氧化铵水溶液将 RNA 从固体支持物中分离并脱保护 18 小时。
6. 在高速真空浓缩器中干燥生成的 RNA 溶液（大约3-4小时）。
Savant DNA/RNA 120 speed-vac 浓缩器以三种干燥速率（低热、中热和高温）运行，温度范围从大约43°C 到 65°C，排量在 50 Hz 和 36 时为 31 L/min L/min 在 60 Hz，最大真空在 7 Torr 或 9 mbar。优选低温或中温干燥以防止样品变性。
7. 涡旋和125 µL Et 3 N · 3HF 溶液在 65 °C下使用加热块孵育 2.5 小时，用 100 µL DMSO 重新溶解固体残留物。脱甲硅烷基化是去除甲硅烷基部分。
8. 通过添加 25 μL 的 3 M 醋酸钠溶液和 1 mL 的 100% 乙醇来沉淀 RNA，并在-80 °C下保持至少 3 小时。
9. 在 15,000 × g和 4 °C 下离心45 分钟以回收 RNA。在真空下完全干燥 RNA。
10. 将 RNA 溶解在 500 μL 的无 RNase 水中，并在必要时评估其完整性。在-20 °C储存前进行两次脱盐。

B. GalNAc αProN3 3（图 1）和 2'-GalNAc 修饰的 RNA 链（图 2）的合成

图 2. 3-氯丙基GalNAc 2 和GalNAc αProN3的合成

1. 将 330 毫克（1.5 毫摩尔）的N-乙酰基-D-半乳糖胺溶解在 5 毫升的 3-氯丙醇中。
2. 在冰上（约 0 °C）向上述溶液中加入 0.13 mL（1.8 mmol）乙酰氯。
3. 将所得溶液在 70 °C下加热 15 小时。
4. 使用中等热量通过快速真空浓缩溶液，并通过硅胶色谱法纯化残留物以获得 3-氯丙基GalNAc 2 .
200 mg 白色固体的典型产率约为 45%，参数如下：
• TLC R f = 0.5（CH 2 Cl 2中的 20% MeOH ）
• 1 H NMR (500 MHz, D 2 O) δ 4.92 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 4.4, 12.8 Hz, 1H), 4.00–3.84 (m, 4H), 3.77–3.72 (米, 4H), 3.62–3.56 (米, 1H), 2.10–2.02 (米, 5H)
5. 通过加热溶液，将200 毫克（0.671 毫摩尔）的3-氯丙基GalNAc 2溶解在 6 毫升的CH 3 CN 中。
6. 加入 436 毫克（6.71 毫摩尔）NaN 3和 101 毫克（0.671 毫摩尔） NaI ，并在 60 °C 下搅拌 15 小时。
7. 快速真空浓缩溶液，硅胶层析纯化残余物，得到GalNAc α ProN3 3。
约 110 mg 白色固体的产率为约 54%，参数如下：
• TLC R f = 0.4（CH 2 Cl 2中的 20% MeOH ）
• 1 H NMR (500 MHz, D 2 O) δ 4.94 (m, 1H), 4.21–4.18 (m, 1H), 4.03-3.94 (m, 3H), 3.85–3.78 (m, 3H), 3.59–3.47 (米, 3H), 2.08 (d, 3H), 1.95–1.91 (米, 2H)。

注意： GalNAc修饰的 RNA 链的合成从合成炔丙基修饰的 RNA 寡核苷酸开始，遵循方案 A，使用来自ChemGenes的市售 2 ' -（O-炔丙基）-亚磷酰胺构建块。化学合成的叠氮基-GalNAc部分通过点击化学以铜为催化剂与炔丙基 RNA 缀合。

图 3.通过 Cu(I) 催化的点击反应合成GalNAc修饰的 RNA 链

8. 要制作GalNAc修饰的RNA链（表 1 和 2 中显示的序列），请在1.5 mL Eppendorf 管（即，对于每微克炔丙基 RNA 使用 100 微克叠氮基修饰的GalNAc ( GalNAc α ProN3 ) 进行反应) (Yadav et al., 2022) 。

GalNAc修饰的 MiR-30c 类似物和序列
化合物简写钢绞线顺序（5' 到 3'）
miR30c-B1 B1 miR-30c-1-3p ( pC ) UgGgAgAgGgUuGuUuAcUcC
miR30c-B2 B2 miR-30c-1-3p CuGgGaGaGgGuUgUuUaCuC ( pC ) u
miR30c-B3 B3 miR-30c-1-3p ( pC ) uGgGaGaGgGuUgUuUaCuC ( pC ) 你
miR30c-B4 B4 miR-30c-2-3p ( pC ) UgGgAgAaGgCuGuUuACUCU
miR30c-B5 B5 miR-30c-1-3p CuGgGaGaGgGuUgUuUa （ pC ）U（ pC ）（ pC ）u
miR30c-B6 B6 miR-30c-1-3p （ pC ） UgGgAgAgGgUuGuUuA （ pC ）U（ pC ）（ pC ）u
miR30c-B7 B7 miR-30c-2-3p CuGgGaGaAgG （ pC ） uGuUuA （ pC ）u（ pC ）U
miR30c-B8 B8 miR-30c-2-3p （ pC ） UgGgAgAaGg （ pC ） UgUuUa （ pC ）U（ pC ）u
miR30c-B9 B9 miR-30c-1-3p ( pC )( pC )( pC ) UgGgAgAgGgUuGuUuAcUcC
miR30c-B10 B10 miR-30c-2-3p ( pC )( pC )( pC ) UgGgAgAaGgCuGuUuAcUcU
miR30c-B11 B11 miR-30c-2-3p ( pC )( pC )( pC ) ugggagaaggcuguuuacucu
大写字母：2'-deoxy-2'-fluoro (2'-F) ribosugar -modified nucleosides；小写字母：2'-O-甲基（2'-OMe）核糖修饰的核苷； ( pC ): 2'-GalNAc 点击胞苷。

表 2.包含GalNAc和硫代磷酸酯键的 MiR-30c 类似物和序列
化合物简写钢绞线顺序（5' 到 3'）
miR30c-C1 C1 miR-30c-1-3p ( pC )• U•gGgAgAgGgUuGuUuAcUc•C
miR30c-C2 C2 miR-30c-1-3p ( pC )• UgGgAgAgGgUuGuUuAc•U•c•C
miR30c-C3 C3 miR-30c-1-3p ( pC )• U•gGgAgAgGgUuGuUuAc•U•c•C
miR30c-C4 C4 miR-30c-1-3p GgGaGaGgGuUgUuUaCuC ( pC )•u
miR30c-C5 C5 miR-30c-1-3p GgGaGaGgGuUgUuUaCu•C •( pC )•u
miR30c-C6 C6 miR-30c-1-3p C•u•GgGaGaGgGuUgUuUaCuC ( pC )u
大写字母：2'-deoxy-2'-fluoro (2'-F)核糖修饰；小写字母：2'-O-甲基 (2'-OMe)核糖修饰； ( pC ): 2'-GalNAc clicked cytidine; •：硫代磷酸酯键

9. 在一个单独的管中，溶解 22 个当量的CuBr （100 mM 在 25% tBuOH /75% DMSO) 在 20% 乙腈中并充分混合。
10. 将混合物转移到 RNA 溶液中，并在室温下使用管左轮手枪旋转器以大约 20 rpm 的速度旋转 12 小时。
11. 用 3 M 醋酸钠和 1 mL 冷乙醇沉淀 RNA，并储存在 -80 °C至少 3 小时。
12. 18400 xg下将 RNA离心15 分钟。
13. 将 RNA 颗粒重新悬浮在 500 μL 的无 RNase 水中。
14. 使用 Sep-Pak C18 墨盒对 RNA 溶液进行脱盐。
首先，用 1 mL 的 ACN 调节墨盒，并用 1 mL 的无 RNase 水和 1 mL 的 2 M TEAAC 缓冲液进行平衡。每次丢弃流经。逐滴加载 RNA 样本并允许RNA 结合。用 RNase 游离水进行三次洗涤，每次洗涤 1 mL，并用 1 mL 50% ACN 洗脱脱盐 RNA。
注意：2 M TEAAC pH 8：在通风橱中，用 619 mL 蒸馏水、268 mL 三乙胺和 114 mL 冰醋酸制备 1 L 原料。配方采用冷泉港实验室。
15. 使用 speed vac 浓缩洗脱的 RNA，并使用含有 8 M 尿素的 15% 聚丙烯酰胺通过分析凝胶电泳检查所得产品。
× TBE、250 mL 的 30% 丙烯酰胺/双库存和 240 g 的 8 M 尿素制作含有 8 M 尿素库存溶液（500 mL）的 15% 聚丙烯酰胺凝胶。一种小型分析凝胶由 6.5 mL 15% 8 M 尿素储备溶液、37 µL 10% APS 和 6.8 µL TEMED 制成。将样品在 95 °C 下加热5 分钟，然后在冰上冷却 5 分钟。添加上样缓冲液后，使用 10 µM 样品作为最终浓度。根据凝胶的百分比，在 1 × TEB 下作为运行缓冲液在 250 V 下进行凝胶电泳约 30 分钟。电泳后，在成像前用EthBr染色凝胶15 分钟。

C. 侧重于GalNAc修饰的影响的细胞培养研究人肝癌 Huh-7 细胞系中ApoB 、ApoA1 和 MTP 的miR-30c 类似物

1. 将人类肝癌 Huh-7 细胞保存在含有 10% FBS 和 1% L-谷氨酰胺的 75 cm 2培养瓶中，在 37 °C 和 5% CO 2的加湿培养箱中使用通气盖。
2. 在 6 孔板中播种 Huh-7 细胞，其中含有 2 mL 的上述介质，浓度约为 100,000 个细胞/孔。
3. 将非GalNAc修饰的 microRNA 与RNAiMAX以 3:1 的比例混合，并在细胞转染前在室温下孵育 30 分钟。
4. 将GalNAc修饰的 microRNA 直接添加到细胞中，无需脂质体辅助递送。
5. 在转染后 72 小时更换为 1 mL 的新鲜 DMEM（10% FBS）介质并孵育过夜。
6. ApoB和 ApoA1 测量收集媒体。
7. 在用于 MTP 蛋白水平测量的蛋白酶抑制剂鸡尾酒存在下清洗和收获细胞。
8. 3,3',5,5' 四甲基联苯胺底物的特定人类ApoB /ApoA1 ELISA 开发套件确定收集的介质中的ApoB和 ApoA1 水平。稍后，在 96 孔 ELISA 板中停止解决方案。
9. 制造商提供的标准，使用与实验样品平行准备的ApoB /ApoA1 标准曲线计算每个浓度。
10. ApoB /ApoA1 水平标准化为各孔中的总蛋白，即，将对照 microRNA 转染细胞设置为 100%，并将修饰的 miR-30c 标准化为该值。
11. 确定细胞内的 MTP 蛋白水平，用冰冷的 PBS 清洗转染的 Huh-7 细胞，并在冰冷的缓冲液 K 中刮掉孔（参见食谱）。
12. 使细胞通过PrecisionGlide TM 25G 针来裂解细胞。
13. 在对蛋白质印迹进行 MTP 检测之前，使用考马斯（布拉德福德）蛋白质测定试剂盒测量总蛋白质浓度。

数据分析

A. 2'-OMe 修饰的 miR-30c 链的紫外热变性和圆二色性 (CD) 光谱研究

注意：为了研究生物物理特性，合成的 2 ' -OMe 修饰的 miR-30c-1-3p 和 miR-30c-2p 反义链在磷酸钠缓冲液（10 mM， pH 6.5) 含有 100 mM NaCl。
1. 将溶液在 95°C 下加热 3 分钟，然后在室温下以 1°C /min 的速度缓慢冷却约 2 小时。在 UV-可见光谱仪上运行之前，在 4°C 下过夜。
2. 对于 UV 熔化研究，收集 260 nm 的所有数据点，并以 0.5 °C/分钟的速率从 5 °C 到 85 °C（总共 4 个斜坡）进行两个加热和冷却循环。
3. 使用 1 cm 路径长度的石英比色皿记录 200-300 nm 波长范围内的 CD 光谱。
4. 以 100 nm/min 的扫描速度、1.0 nm 的带宽和 1.0 s 的积分时间收集所有数据点。

图 4.修饰的 miR-30c 双链体的 CD 光谱。与用 miR-30c-5p 退火的天然 miR-30c-1-3p 相比，修饰的双链体的热稳定性总体提高了大约 7 °C，表明双链体稳定性增强 (A)。 CD 光谱显示出相似的构象，表明 miR-30c-1-3p 的修饰不会损害与 miR-30c-5p 的相互作用 (B) （Yadav 等人，2022）。

B. 合成化合物的确认检查

图 5. 3-氯丙基GalNAc 2 和GalNAc αProN3 3 的1 H NMR 光谱，以及 15% PAGE 凝胶中反义寡核苷酸的分析。两种化合物 3-氯丙基GalNAc 2 (A) 和GalNAc αProN3 3 (B) 的正确合成通过 1 H NMR 光谱和 (C) 15% 聚丙烯酰胺分析型 8 M尿素凝胶电泳。第 1 道：反义寡核苷酸 (ASO)，第 2 道：点击后的GalNAc -ASO，第 3 道：参考GalNAc -ASO （Yadav 等人，2022 年）。

C. GalNAc修饰的效果 miR-30c 类似物对人肝癌 Huh-7 细胞ApoB和 ApoA1 分泌和细胞 MTP 蛋白水平的影响

图 6.各种GalNAc修饰的 miR-30c 类似物对Huh-7 人肝癌细胞中apoB分泌的影响。使用 lipofectamine RNAiMAX将表 1 中的所有类似物转染到细胞中。所有这些都有效地抑制了ApoB分泌 (A)，而不影响 ApoA1 分泌 (B)。然而，当这些类似物被给予不含 lipofectamine RNAiMAX的细胞时，只有类似物 B5 和 B8 对ApoB没有影响，而所有其他类似物减少分泌，范围从 40% 到 80% (C)。任何类似物都对ApoA1 (D) 有影响。这些结果表明，与具有多个GalNAc修饰的核苷酸 B5 和 B8的类似物相比，包含一个GalNAc拷贝的类似物 B1 和 B2 具有更好的生物活性。 MTP 蛋白的水平通过在 SDS-PAGE (10%) 凝胶上解析的蛋白质印迹来检测。简而言之，本实验使用了 50 µg 总蛋白。抗人 MTP 的多克隆兔一抗和抗 β-肌动蛋白的兔单克隆抗体按 1:1000 稀释使用。抗兔 IgG 和 HRP 连接的二抗按 1:2,000 稀释使用。使用ChemiDoc TM触摸成像系统对印迹进行成像。蛋白质印迹分析也显示 MTP 蛋白表达降低（Yadav 等人，2022）。

图 7.各种硫代磷酸酯连接的 miR-30c 类似物对Huh-7 人肝癌细胞中apoB分泌的影响。由于 B1 和 B2 类似物已显示出对ApoB分泌的有效抑制作用，我们通过引入硫代磷酸酯连接进一步修饰了类似物（表 2），已建议提高特异性和沉默活性。当用RNAiMAX转染细胞时，用硫代磷酸酯键合成的类似物显示出对ApoB分泌的有效抑制(A) 而对 ApoA1 没有影响。更重要的是，当在没有脂质转染胺辅助递送的情况下转染细胞时，所有具有硫代磷酸酯连接的类似物都会减少ApoB分泌 (C)，但对 ApoA1 (D) 没有影响（Yadav 等人，2022）。

食谱

1. Tm 缓冲液或磷酸钠缓冲液 pH 6.5
试剂终浓度数量
氯化钠 100毫米 294.4 毫克
Na 2 HPO 4 10毫米 70.95 毫克
NaH 2 PO 4 10毫米 59.99 毫克
总共溶解 50 mL Milli-Q H 2 O

2. 缓冲液 K 包含 1 片蛋白酶抑制剂混合物
试剂终浓度数量
Tris-盐酸 1毫米 7.88 毫克
EGTA 1毫米 19.02 毫克
氯化镁2 1毫米 4.76 毫克
溶解在总共 50 mL 的 Milli-Q H 2 O中

致谢

我们感谢美国国立卫生研究院 (NIH) DK121490、HL137202、HD094778 和 VA 优异奖 BX004113 给 MMH、NSF CHE1845486 给 JS，以及 MRI grant CHE1726724 的财政支持。本协议的内容基于已发表的作品 (Yadav et al., 2022)。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

在这项研究中没有使用人类和/或动物受试者。

参考

艾哈迈德 Z.（2014 年）。他汀类药物不耐受。 Am J Cardiol 113(10)：1765-1771。
巴特尔，DP（2009）。 MicroRNAs：目标识别和调节功能。单元格136(2)：215-233。
Blumenthal, RS (2000)。他汀类药物：有效的抗动脉粥样硬化治疗。我的心139(4)：577-583。
Frank, PG 和 Marcel, YL (2000)。载脂蛋白 AI：结构-功能关系。 J Lipid Res 41(6)：853-872。
Gong, J.、He, XX 和 Tian, A. (2015)。 microRNA 在肝细胞癌中的新作用（综述）。 Oncol Lett 9(3)：1027-1033。
Hussain, MM 和Bakillah , A. (2008)。靶向微粒体甘油三酯转移蛋白的新方法。电流意见脂质醇19(6)：572-578。
Irani, S. 和 Hussain, MM (2015)。 microRNA-30c 在脂质代谢、脂肪形成、心脏重塑和癌症中的作用。电流意见脂质醇26(2)： 139-146 。
Iwakawa , HO 和Tomari , Y. (2015)。 MicroRNA 的功能：mRNA 衰变和翻译抑制。趋势细胞生物学25(11)：651-665。
James Soh, J.、Iqbal, J.、Queiroz, J.、Fernandez-Hernando, C. 和 Hussain, MM (2018)。 MicroRNA-30c 通过减少脂质合成和脂蛋白分泌来降低高脂血症和动脉粥样硬化。国家医学19：892-900。
Jialal , I. 和 Barton Duell , P. (2016)。家族性高胆固醇血症的诊断。 Am J Clin Pathol 145(4)：437-439。
Khare , S., Zhang, Q. 和Ibdah , JA (2013)。肝细胞癌的表观遗传学：microRNA 的作用。世界胃肠杂志 19(33)：5439-5445。
Li, S.、Yao, J.、 Xie , M.、Liu, Y. 和 Zheng, M. (2018)。肝细胞癌发展和临床反应中的外泌体 miRNA。 J Hematol Oncol 11(1)：54。
Libby, P., Buring , JE, Badimon , L., Hansson, GK, Deanfield , J., Bittencourt , MS, Tokgozoglu , L. 和 Lewis, EF (2019)。动脉粥样硬化。 Nat Rev Dis 引物5(1)：56。
Liu, Q.、Luo, Q.、Halim, A. 和 Song, G. (2017)。靶向癌细胞的脂质代谢：一种有前途的癌症治疗策略。癌症快报401：39-45。
Ma, XL, Gao, XH, Gong, ZJ, Wu, J., Tian, L., Zhang, CY, Zhou, Y., Sun, YF, Hu, B., Qiu , SJ, 等。 (2016)。载脂蛋白 A1：一种用于预测根治性切除术后肝细胞癌预后的新型血清生物标志物。 Oncotarget 7(43)：70654-70668。
Mortensen, MB 和Nordestgaard , BG (2020)。 70-100 岁人群 LDL 胆固醇升高和心肌梗塞和动脉粥样硬化性心血管疾病风险增加：当代一级预防队列。柳叶刀396(10263)：1644-1652。
Rader, DJ 和Kastelein , JJ (2014)。 Lomitapide 和 mipomersen：两种用于降低纯合子家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白胆固醇的一流药物。流通129(9)：1022-1032。
Rizzo, M. 和Wierzbicki , AS (2011)。新型调脂药物：微粒体转运蛋白抑制剂的作用。 Curr Pharm Des 17(9)：943-949。
Rupaimoole , R. 和 Slack, FJ (2017)。 MicroRNA 疗法：迈向癌症和其他疾病管理的新时代。 Nat Rev Drug Discov 16(3)：203-222。
Stoekenbroek , RM, Kastelein , JJ 和Huijgen , R. (2015)。 PCSK9 抑制：血脂异常治疗的前进方向。 BMC 医学13：258。
Yadav, PK、 Haruehanroengra 、P.、Irani, S.、Wang, T.、Ansari, A.、Sheng, J. 和 Hussain, MM (2022)。新型有效的 microRNA-30c 类似物可减少人肝癌和原代肝细胞中载脂蛋白 B 的分泌。生物化学杂志 298(4)：101813 。
Yan, X., Yao, M., Wen, X., Zhu, Y., Zhao, E., Qian, X., Chen, X., Lu, W., Lv , Q., Zhang, L. ,等。（2019）。升高的载脂蛋白 B 预示着肝细胞癌患者术后预后不良。 Onco目标Ther 12：1957-1964。