材料和试剂
1.0.5 mL 管（RPI，目录号：145505）
2.黑色底面透明 96 孔板（ Thermo Scientific，目录号： 265301 ）
3.生物素化 Shh 肽 [CGPGRGFGKR-(PEG2)-K(Biotin)-NH2] [ Anaspec和 Peptide 2.0，定制合成，PEG2 = Fmoc-NH-PEG2-CH2-COOH； MW（理论值）1532.82 g/mol，至少订购 5 mg，游离 N 末端，NH 2在 C 末端，三氟乙酸盐，通过 MS 进行 QC 分析，通过 HPLC（220 nm，C18 柱）峰面积测定 >95% 纯度, 缓冲液 A：H 2 O 中的 0.05% TFA，缓冲液 B：90% CH 3 CN 中的 0.05% TFA，25 分钟内线性梯度 10 %– 35% B] （至少储存在 -20 摄氏度）
4.硝基苯并恶二唑(NBD)-脂肪酰基-CoAs （Avanti，目录号：810229P 和 810705P）（等分试样至少储存在 -20 °C ）
5.n-Dodecyl-β-D- maltopyranoside (DDM)（ Anatrace ，目录号：D310）（储存于 -20 °C）
6.3 × FLAG®肽（Millipore Sigma，目录号： F4799 ）（储存于 -20 °C）
7.n-Octyl-β-D-glucopyranoside (OG)（EMD Millipore，目录号：494459）（室温储存）
8.Triton X-100（Fisher Scientific，目录号：BP151-500）（常温保存）
9.MES（Fisher Scientific，目录号： BP300-100 ）（室温储存）
10.DTT（Promega，目录号：V3151）（将等分试样储存在 -20 °C ）
11.Pierce TM高容量链霉亲和素珠（ Thermo Scientific，目录号： 20361）（储存于 4 °C ）
12.纯化的 Hhat和模拟纯化的洗脱液或洗脱缓冲液（参见食谱）（ Schonbrun 和 Resh，2022 年）（储存在-80 °C ）
13.反应缓冲液（参见配方）
14.洗涤缓冲液（见配方）

设备

1.荧光酶标仪 ( BioTek Synergy H1)
2.冷藏台式微量离心机（Eppendorf Centrifuge，型号：5417R）
3.PicoFuge （ Stratagene ）
4.附有26 ½的真空吸气器 G 针（Becton Dickinson，目录号：305111）
5.重复或常规移液器

软件

1.Gen5（生物科技）
2.Excel（微软）
3.棱镜 (GraphPad)

程序

A.测定设置

1.在室温下在机架中设置适当数量的 0.5 mL 塑料管。反应应至少重复进行。
2.通过在测定开始前添加 DTT 来准备新鲜的反应缓冲液（室温）。
3.在洗涤缓冲液中制备链霉亲和素涂层珠的悬浮液。
a.将相当于每个反应 15 μL 浆料的浆料总量转移到管中。示例：在一个重复测定八个反应的测定中，应准备 240 µL [(8 × 2) × 15 µL] 浆液以及额外的 60 µL (4 × 15 µL) 标准品，以制作总共 300 µL 浆液 (240 µL + 60 µL)。洗涤后应使用 1,000 µL [(16 + 4) × 50 µL] 洗涤缓冲液重新悬浮合并的浆液。务必在计算结束时将 NBD 标准品所需的额外珠子包括在珠子的计算中（参见步骤 C5）。
b.通过向管中添加相当于每次反应 50 μL 的洗涤缓冲液总量并多次倒置管来清洗珠子一次。
c.离心机中以 2,700 x g和 4 °C将珠子离心1 分钟，然后使用26 ½ G 针吸出上清液。
d.用相当于每次反应 50 μL 洗涤缓冲液的洗涤缓冲液总量重新悬浮珠子。
e.将管子放在冰上。
4.等分反应缓冲液和所需浓度的 NBD-脂酰辅酶 A（我们通常使用 10 μM）和 Shh 肽（我们通常使用 10 μM ）到每个管中。对于抑制或底物竞争测定，包括药物/抑制剂 [例如，RU-SKI 201（Cayman，目录号：21101）] 或未标记的底物（例如，非荧光脂肪酰辅酶 A 或非生物素化 Shh 蛋白/肽）所需的浓度。包括适当的控制反应。
注意：每个管中的最终体积应为 100 μL，重要的是，应包括最终浓度为 0.1% DDM （纯化的Hhat洗脱液的洗涤剂成分）。反应缓冲液中 MES、OG（w/v）和 DTT 的最终浓度应分别在 125 mM、0.06% 和 750 μM 的范围内。如果需要，可以制备反应缓冲液和底物的主混合物。

B.反应

1.通过添加纯化的Hhat酶（或等效体积的模拟纯化洗脱液或洗脱缓冲液作为阴性对照）来启动反应（我们通常使用 130 nM 哈哈）。在PicoFuge中短暂涡旋和脉冲旋转以收集管底部的样品。
2.°C的黑暗中孵育所需的时间。
注意：对于动力学研究，必须首先执行时间过程以确定反应的线性范围。初始动力学研究的建议时间点为 0、10、20、40、60 和 90 分钟。
3.通过将管子放在冰上并添加 60 μL 的冰冷珠悬浮液来淬火反应。

C.反应产物的分离和定量

1.在黑暗中孵育管子，在 4 °C 下摇动1 小时。
2.离心机中以 2,700 x g和 4 °C将珠子离心1 分钟，然后使用26 ½ G 针小心吸出上清液。
3.用 100 μL 的洗涤缓冲液清洗珠子三次。在每次洗涤之间，离心管并如上所述吸出上清液。
洗涤提示：将管子放在一个架子上，盖住架子的顶部，将架子倒置大约五次以进行洗涤。
4.最后一次洗涤后，小心吸出上清液，用 60 μL 的洗涤缓冲液重新悬浮每个管中的珠子，然后小心地将珠子从每个管子转移到黑色侧透明底部 96 孔板的各个孔中。为每个管子使用新的移液器吸头。
注意：为了最大限度地转移珠子，在第一次将珠子转移到板中后，使用移液器吸头将残留的珠子从侧面向下推到管底部，那里仍然有一些悬浮液，并将剩余的悬浮液转移到同一个孔中。
5.为了获得 NBD 荧光 (RFU) 到pmol NBD 标记产品的转换因子以进行数据量化（见下一节），加载标准 [已知量（例如，500 – 2,000 皮摩尔）] 珠悬浮液中的 NBD-acyl-CoA（60 μL，如步骤 C4 中）放入板的单独孔中。
6.465/535 nm 的激发/发射波长下读取板读取器中的 NBD 荧光 (RFU) 。

数据分析

1.将 RFU 读数从 Gen5 软件直接导出到 Excel 电子表格。
2.使用从标准品中获得的 RFU 到pmol转换因子量化 NBD 酰化 Shh 产品。要获得转换因子，请将 RFU 输出值除以已知的 NBD 捐助者pmol数。对于初始速率的计算，选择反应呈线性的时间点（我们通常使用 10 分钟）。将在该时间点产生的 NBD 酰化 Shh 的pmol除以分钟数，然后除以Hhat的pmol数，得到每分钟每pmol的pmol NBD 酰化 Shh Hhat以 min -1为单位。
3.数据可以在 Excel 或 GraphPad Prism 中用标准条形图或折线图绘制，或者在 GraphPad Prism 中用最佳拟合动力学模型绘制，视情况而定（例如图 1）。
注意：对于动力学模型，数据应显示为初始速率（每分钟 pmol 产物或每酶量每分钟 pmol 产物）。

图 1. Hhat酶活性作为 NBD-棕榈酰-CoA 浓度的函数。将增加浓度的 NBD-棕榈酰-CoA 与 25 µM 野生型 Shh 肽和纯化的Hhat在 37°C 下孵育 10 分钟。量化了 Shh的Hhat介导的 NBD-棕榈酰化的初始速率；数据的 Michaelis-Menten 拟合（在 GraphPad Prism 中生成）以表观动力学参数显示为插图（ Schonbrun 和 Resh，2022 ）。

食谱

1.洗脱缓冲液
20 毫米 HEPES，pH 值 7.5
350 毫米氯化钠
1% (v/v) 甘油
1% (w/v) DDM
150 µg/mL 3 × FLAG ®肽

2.反应缓冲液
167 毫米 MES，pH 6.5
0.083% (w/v) 原糖
1 mM DTT（新鲜添加）

3.洗涤缓冲液
167 毫米 MES，pH 6.5
0.083% (v/v) Triton X-100
致谢

这项研究得到了 NIH Grant GM116860 的支持，由William H. Goodwin 先生和 Alice Goodwin 夫人以及英联邦癌症研究基金会和纪念斯隆凯特琳癌症中心实验治疗中心的资助，由癌症中心核心支持将美国国立卫生研究院的 P30 CA008748 授予纪念斯隆凯特琳癌症中心，并通过美国心脏协会博士前奖学金 #20PRE35040000 (2020) 授予 ARS 。

利益争夺

作者声明他们与本文的内容没有利益冲突。

参考

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Jiang, Y., Benz, TL 和 Long, SB (2021)。底物和产物复合物揭示了 HHAT 对 Hedgehog 酰化的机制。科学372(6547)：1215-1219。
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Lanyon-Hogg, T.、Patel, NV、Ritzefeld, M.、Boxall, KJ、Burke, R.、Blagg, J.、Magee, AI 和 Tate, EW (2017)。用于实时分析肽 N-棕榈酰化的微流体迁移率变动分析。 SLAS 发现22(4)：418-424。
Lanyon-Hogg, T., Ritzefeld, M., Sefer, L., Bickel, JK, Rudolf, AF, Panyain, N., Bineva-Todd, G., Ocasio, CA, O'Reilly, N., Siebold, C., Magee, AI 和 Tate, EW (2019)。酰化偶联亲脂性极化诱导 (Acyl-cLIP)：脂质转移酶和水解酶的通用测定法。化学科学10(39)：8995-9000。
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