材料和试剂

1. 6 孔透明多孔板（Fisher Scientific，目录号： 25373-187）
2. 10 cm Falcon 组织培养板（The Lab Depot，目录号： 25373-10）
3. 最小必需培养基-α （ MEM - α ）（ ThermoFisher Scientific，目录号：12571063）
4. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（ Thermo Fisher Scientific，目录号：14190-094）
5. 青霉素/链霉素 (P/S) （ Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：15140122）
6. 两性霉素 B（ Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：15290018）
7. 0.25% 酚红胰蛋白酶（ Thermo Fisher，目录号： 25200-05
8. 热灭活胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号： 10-438-026）
9. BCA 蛋白测定试剂盒（Millipore Sigma，目录号：71285-3）
设备

1. 96孔SpectraMax Plus 酶标仪（VWR，目录号： 89212-396）
2. Labomed Lx400 相衬高清数字显微镜（显微镜中心，目录号： 9126017T-HDS）
3. SteriCycle 370 CO 2培养箱（ Thermo Fisher Scientific，目录号：TH-370N）
4. NanoDrop One Microvolume UV- Vis分光光度计（Fisher Scientific，目录号： 13-400-519）
5. 亮线血细胞计数器室（Carolina，目录号： 700722）
6. 热 Sorvall ST16R 冷冻离心机（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 75-004-240）

程序

人牙周膜细胞培养物 ( hPDL )
1. 如前所述（ Scanlon 等人，2011 年），通过直接细胞生长法制备人牙周膜细胞的原代培养物，方法是从拔出的健康人牙齿中间三分之一周围的牙周膜组织中分离细胞。在大约 10 mL 的 MEM - α中维持细胞，在 10 cm Falcon 组织培养板中增加 10% FBS、1% P/S 和 1% 两性霉素 B 在37 °C下含 95% 空气和 5% CO 2的潮湿气氛中。
a. Thermo达到大约 90% 汇合时传代细胞生长 Sorvall ST16R 冷冻离心机。虽然会观察到患者与患者之间的差异，但细胞通常需要大约三到四天才能在大约 70% 的细胞接种后汇合。
b. 使用传代三到六次的细胞进行实验。
c. POSTN特定亚型的 mRNA 表达来验证人牙周膜细胞参数基因，仅由牙周膜细胞表达，2) 评估细胞形态，以及 3) 检查其他可靠细胞生物标志物的表达，例如波形蛋白（一般成纤维细胞标志物）和CD45，这确保培养物不含巨噬细胞（ Marchesan等人，2011 年）。
如果培养物被其他细胞类型污染，则可以使用上述生物标志物通过 FACS 分选进一步纯化hPDL细胞（ Basu等人，2010 年）。
2. 种子约 9 × 将10 个5 个细胞放入 6 孔透明多孔板中，并允许它们在含有 10% FBS、1% 两性霉素 B 和 1% P/S的 MEM - α存在下粘附约 24 小时，然后再刺激或挑战细胞.

牙菌素刺激人牙周膜细胞
用一个 BCA 蛋白测定试剂盒根据制造商的建议来确定纯化的牙菌素( UniProt Accession #: P96091 ) 样品浓度
3. 使用 96 孔SpectraMax Plus 酶标仪扫描板。
4. 如前所述，使用明胶酶谱法确定酶活性（ Cathcart ，2016 ）。
5. 用 PBS 洗涤细胞2-3次。
6. 将纯化的dentilisin /PBS 溶液添加到不含酚红、血清和抗生素的MEM- α介质中，最终浓度为 1 μ g / mL。
7. 将这种牙菌素溶液添加到健康的人牙周膜细胞培养物中，并在含有 95% 空气和 5% CO 2的潮湿环境中于 37 °C 孵育 2 小时。
用纯化的牙菌素刺激会导致细胞形态发生显着变化（图 2）。
8. 用 PBS 轻轻清洗细胞两次，并在含有 95% 空气和 5% CO 2的潮湿环境中于 37 °C 下在不含 FBS、P/S 或两性霉素 B的 MEM -α中再孵育 22 小时。

数据分析

图 2. hPDL 细胞在纯化的Dentilisin刺激后的形态学变化。健康人牙周膜成纤维细胞在不含血清或抗生素的 MEM-α 中用终浓度为 1 μ g /mL 的纯化牙菌素攻击2小时，然后在含有 95% 空气和 5% CO2 的潮湿环境中孵育 22 小时2在 37 °C 下在 MEM -α介质中，无补充。

按照此实验设置，收获细胞以分析各种参数。在我们的研究中，我们收获细胞或条件培养基来评估 MMP 酶活性（明胶酶谱）和蛋白质和 RNA 表达（Western Blot 和qRT -PCR），并用于细胞成像（免疫荧光）（ Ganther等人，2021 年）。
笔记

如果收集条件培养基样品，强烈建议使用不含酚红、血清或抗生素的培养基，因为牙菌素的蛋白酶活性会裂解多种亚基，并可能干扰蛋白质浓度测量。

致谢

我们感谢 Christopher Fenno 博士捐赠纯化的牙菌素样品和等基因突变体。这些研究得到了 NIH (R01 DE025225) 到 YLK ( https://www.nih.gov/ ) 和 Ruth L. Kirschstein国家研究服务奖 (NRSA) 机构研究培训补助金 (T32DE007306)向 SG 的资助( https://www.nih.gov/ )。资助者没有参与研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿的准备。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

加利福尼亚大学旧金山机构审查委员会批准进行人类受试者的研究（#16-20204；参考编号#227030）。

参考

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