材料与试剂
材料
无菌 1.5 mL 微量离心管（Fisher Scientific，目录号：229442）
15 mL Falcon 管（Corning，目录号：14-959-53A）
50 mL Falcon 管（康宁，目录号：14-432-22）
肝素化毛细血管（ Fisherbrand ，目录号：22-362-566）
2” × 2”纱布（ Fisherbrand ，目录号：22-362178）
棉签涂抹器 (Q-tips ® )
凡士林（即凡士林® ）
27 G 针头，每只动物一根（BD Biosciences，目录号：305109）
用于采血的合适的小鼠固定器
70 µm 细胞过滤器（康宁，目录号：352350）
96 孔透明 V 型底聚苯乙烯未处理微孔板（ Corning，目录号：3896）
0.5 mL 胰岛素注射器（BD Horizon，目录号：329461）
1 mL 注射器（BD Horizon，目录号：309659）
称量桶（没有架子或任何小盒子的空 1 mL 吸头盒）
微型试管（Bio-Rad，目录号：2239391）
Corning®低温小瓶，内螺纹（ Corning ，目录号：CLS430488）

老鼠
8–16 周大的 NOD/SCID/IL-2Rgamma null (NSG) 小鼠（杰克逊实验室，菌株：005557）
注意：根据实验问题选择小鼠的性别。可使用市售小鼠和家养小鼠。我们使用过任何一种性别的小鼠，并且没有观察到异种 GvHD诱导的任何差异。

药品
麻醉剂，异氟醚 (USP 250 mL)（Piramal Critical Care Inc，部件号：DVM-102190）

试剂
肝素（Sigma，目录号：H3149-10KU）
70% 乙醇（VWR，目录号：89370-078）
5 × brilliant stain buffer plus（BD Horizon，目录号：566385）
固定/透化浓缩物（ eBioscience ，目录号：00-5123-43）
固定/透化稀释剂（ eBioscience ，目录号：00-5223-56）
10 ×透化缓冲液（ eBioscience ，目录号：00-8333-56）
计数珠（123count eBeads TM ，Invitrogen，目录号：01-1234-42）
DNase I 溶液（1 mg/mL）（ Stemcell TM Technologies，目录号：07900）
青霉素-链霉素 (P/S)（ Gibco TM ，目录号：15140122）
β-巯基乙醇（ Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
二硫苏糖醇（DTT）（ ThermoFisher ，目录号：20290）
EDTA（ Sigma-Aldrich，目录号：03690）
溶组织梭菌的胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C7657）
Percoll （Sigma-Aldrich，目录号：P1644）

媒体和缓冲区
10 × RBC 裂解缓冲液（ eBioscience ，目录号：00-4300-54）
Gibco 1 × Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)（ ThermoFisher ，目录号：14190）
Gibco 10 ×磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（ ThermoFisher ，目录号：70013032）
Lymphoprep TM （ Stemcell TM Technologies，目录号：07851）
Immunocult -XF T 细胞扩增培养基（ Stemcell TM Technologies，目录号：10981）
Gibco 胎牛血清合格（FBS）（ ThermoFisher ，目录号：12483020）
Gibco RPMI 1640 培养基（ ThermoFisher ，目录号：11875093）
Gibco GlutaMax （ ThermoFisher ，目录号：35050061）
Gibco HEPES (1 M)（ ThermoFisher ，目录号：15630080）

抗体
小鼠 Fc 块（BD Biosciences，目录号：553142）
可固定活性染料 (FVD) eFluor 780（ eBioscience ，目录号：65-0865-18）
抗小鼠 CD45（30-F11）AF700（BD Biosciences，目录号：560510）
抗人 CD45 (HI30) V500（BD Biosciences，目录号：560777）
抗人 CD4（SK3）BV786（BD Biosciences，目录号：563877）
抗人 CD8 (RPA-T8) BV711（BD Biosciences，目录号：563677）
抗人 CD3（UCHT1）BB515（BD Biosciences，目录号：564466）
抗人 Foxp3 (236A/E7) PE-Cy7（ eBioscience ，目录号：25-4777-42）
反人类 Helios（22F6）AF488（BioLegend ，目录号：137223）
抗人 HLA-A2 (BB7.2) APC（Invitrogen，目录号：17-9876-42）

设备

II型生物安全柜（ NuAire ，型号： LabGard ES NU-540）
微量离心机（Eppendorf，型号：5810R 和 5452）
细胞计数器（例如， Nexcelom ，型号： Cellometer Auto 2000 或替代品）
X 射线辐照器（Rad Source-RS2000 Pro 生物辐照器；可以使用包括伽马辐照器在内的替代仪器）
剂量计（Radcal-2186 剂量计；可以使用替代仪器）
电动剃须刀（Wahl Professional Animal BravMini + Pet Trimmer，目录号：41590-0437）
耳朵刻痕器（Fine Science Tools，目录号：24214-02 ）
流式细胞仪（BD LSRFortessa TM X-20；可以使用替代仪器）
奥豪斯TM Navigator TM便携式天平（ Thermo Fisher，目录号：01-922-205）
热科学TM Precision TM通用浴槽（ Thermo Fisher，目录号：TSGP05）
VetFlo TM汽化器单通道麻醉系统（Kent Scientific Corporation，目录号：VetFlo-1205SP）

软件

FlowJo （BD 生物科学公司，10.8.1）

程序

实验时间表
第-1天：准备老鼠
第 0 天：注射 PBMC
第 2 天开始：监测直至终点
第 7 天起：每周放血以监测植入

详细流程

第-1天：准备小鼠输注 PBMC

创建实验组
用于识别的耳缺口小鼠。
将小鼠随机分配到实验组。根据机构指南和当地伦理批准，小鼠应在无菌条件下饲养。作为参考，我们每笼饲养2-4 只小鼠（UBC 动物保护委员会批准 A18-0180）。对于最佳实践，将小鼠随机化并以盲法对它们进行分组。将同一笼子的同窝仔分配到不同的实验组，以控制笼子到笼子的变化。
注意：可以使用尾部标记代替耳部标记，但这是短暂的，需要重复应用。
给小鼠称重
用 70% 乙醇擦拭称重桶，然后放在生物安全柜中的便携式天平上。
轻轻地将鼠标转移到称重桶并记录重量。
在笼子之间用 70% 的乙醇擦拭称重桶和手套。
可选：照射小鼠
将小鼠关在笼子里，用 150 cGy （150 拉德）X 射线照射（获得 150 cGy的曝光时间因机器而异，应咨询当地动物设施工作人员）。使用剂量计确认总累积剂量。
注意：用 X 射线照射预处理小鼠是可选的。推荐剂量是亚致死剂量，被认为是温和的（Gibson 等人，2015 年）。辐照促进更快和更一致的植入，并显着加速异种 GvHD的发作（King 等人，2009）。
监控鼠标
在照射后和 4 小时后立即检查小鼠是否有压力/不适迹象。表 1 中提供了此类迹象的示例。如果观察到压力/不适迹象，请咨询您的动物设施的兽医或对动物实施安乐死。
辐射可能会导致轻微 (<10%) 的体重减轻，但应在五天内恢复。如果体重继续下降，则人道地对动物实施安乐死并从研究中移除。

表 1. 带有xenoGvHD评分指南的动物监测表
xenoGvHD评分指南
0 1个 2个 3个
体重减轻（%） <5% 5%–10% 10%–15% >15%
活动明亮而警觉；对环境感兴趣；与炮友互动；看着观察者；当被轻推时，会移开或嗅闻观察者。对环境不太感兴趣；与炮友互动较少；无视观察者；当被轻推时，不情愿地离开或过度活跃。与炮台隔离；坐在笼子的角落；当笼子受到干扰时不会轻易移动（仅在触摸时移动）；当被轻推时，在慢慢离开之前停顿一下。不动或反应过度，即使被轻推也是如此；无法自我纠正。
直觉正常姿势。轻度或偶尔驼背（圆形）。适度的驼背姿势（很容易注意到）。严重的驼背姿势（尖头步态）。
毛皮/皮肤闪亮、保养良好的被毛。蓬乱、暗淡或弄脏的被毛，褶皱的皮毛；
皮肤轻度发炎（轻度红色）。脱毛（可能因爱抚或局部皮肤脱发而全身性脱毛，尤其是面部、颈部、后肢）；
皮肤中度发炎或影响面部或脚垫。 25% 的小鼠掉毛，毛发变脏无光泽；
皮肤溃烂（脸、脚垫）。注意：结膜炎也是 GvHD 的标志（1 = 分泌物、脓液；2 = 角膜闭合、变白）。
疼痛不适用不适用自我创伤；面部表情：眼睛狭窄或闭上，鼻子顶部隆起（小鼠），鼻梁变平（大鼠），脸颊凸起（小鼠：在眼睛和胡须之间），耳朵向后或扁平，胡须向后指或“突出”结尾”。其他：肌肉抽搐或退缩、蹒跚、背部伸展（像猫一样）、腹部扭动、腹部挤压。
没有额外的，按照协议进行监控没有额外的，按照协议进行监控每天监控老鼠立即实施安乐死
在任何一个类别中得分为 2 的动物：每天得分。
实验终点：注射细胞后六、七周的累计分数。人性化终点：任意一类3分。
其他终点：小鼠表现出任何感染迹象或严重状况，例如眼睑闭合、呼吸变化、皮毛脱落、异常忧虑或攻击性、抓挠、咬伤或自残、驼背姿势、攻击性发声、与群体分离或凹陷或膨胀的腹部将被安乐死。
第 0 天：PBMC 的制备和注射

在生物安全柜中准备 PBMC：可以使用新鲜分离或解冻的 PBMC。
根据既定方案 ( https://protocols.io/view/can-asc-consensus-protocol-isolation-cryopreservat-brrsm56e.pdf ) ，使用Lymphoprep TM从人外周血中分离 PBMC 。 PBMC 可以在分离后立即输注或在 4°C 下储存过夜并在第二天输注。对于后者，细胞应储存在 PBS 和Immunocult -XF 的 50:50 混合物中，浓度为 10 × 10 6 个细胞/mL，置于水平放置的 50 mL Falcon 管中。
冷冻细胞：冷冻的 PBMC 可在输注当天解冻。使用批量冷冻的 PBMC 可以在实验前对细胞进行表征，并可以减少实验变异性。图 1 显示了使用来自不同供体的 PBMC 可能导致的变异性示例。静脉输注 5 × 10 6 –10 × 10 6 个PBMC 应在外周血中达到 >20% 的人 CD45 +细胞植入水平输注后 14 天的血液和xenoGvHD症状应在 3-4 周内明显。使用未达到这些标准的 PBMC 可能会产生次优结果。
注意：PBMC 的数量可能是一个限制因素。对于大型实验，商业leukopaks可用作 PBMC 的冷冻来源。
制备Immunocult -XF T 细胞扩增培养基。在水浴中将介质加热至 37°C。将 10 mL 的介质添加到 15 mL Falcon 管中。为每个低温小瓶准备一个 15 mL Falcon 管。
注意：我们使用Immunocult -XF T 细胞扩增培养基来避免使用人血清，人血清通常会显示成分的批次差异。此处可使用任何其他 T 细胞扩增培养基进行解冻过程。
在 37 °C 水浴中解冻冷冻管，直到几乎完全解冻。
将 1 mL 的温暖解冻介质逐滴添加到冷冻管中，然后小心地将细胞转移到含有 9 mL 温暖介质的 15 mL Falcon 管中。

图 1. PBMC 供体变异诱导异种 GvHD 。来自四个不同供体（PBMC A：男性；PBMC B：女性；PBMC C：男性和 PBMC D：女性）的五百万个 PBMC 被测试了它们诱导xenoGvHD的能力。 (A)相对于 PBMC 输注当天（第 0 天）的体重减轻百分比。 (B) % 小鼠存活率。（C）累积 GvHD 分数。 (D)人类 (h) CD45 +细胞的植入占总活 CD45 + （小鼠和人类）细胞的比例。
注意：对于在终点 (D42) 之前终止的小鼠，计算的结束日期值在后续时间点结转。

以 450 × g离心细胞5 分钟并弃去上清液。为减少细胞聚集，将细胞重悬于 10 mL Immunocult -XF + 1% P/S 和 DNase I 中，浓度为 10 µg/mL，用移液器轻轻混匀，取样计数，并在 10 ℃下孵育 10 分钟室内温度。
× g离心细胞 5 分钟，丢弃上清液，将 PBMC 重悬于无菌 PBS 中，浓度 > 100 × 10 6 个细胞/mL（约 120 × 10 6 /mL）。
将细胞通过 70 µm 细胞过滤器，重新计数，并将细胞浓度调整为 100 × 10 6 个细胞/ mL。
注意：此处调整的细胞浓度是针对100 mL 注射体积中 10 × 10 6 个PBMC 的剂量。如果您打算注入不同数量的细胞，请调整细胞数量，使 100 mL 的 PBS 包含所需数量的细胞。诱导xenoGvHD所需的细胞数量因 PBMC 捐助者而异，因此强烈建议进行初步研究以评估冷冻保存等分 PBMC 的植入能力。如果其他试剂或感兴趣的细胞（例如，Tregs）与 PBMC 共同给药，则最终输注体积不应超过小鼠体重的 1%（即，20 g 小鼠为 200 µL）。遵循动物伦理委员会关于通过尾静脉最大注射量的指南。
就在细胞注射之前，将细胞转移到 1.5 mL 管中并储存在冰上直到注射，以尽量减少细胞在冰上储存和细胞注射之间的时间。
注意：在注射当天，PBMC 的活力应高于 70%。
PBMC 注射：注射前 10-15 分钟将细胞从冰中取出，使细胞悬液升温至室温。通过反转 1.5 mL 收集管轻轻混合 PBMC。将 100 mL 的细胞吸入胰岛素注射器中，并确保不存在气泡。按照以下方法，斜面朝上直接注入尾静脉：
笔记：
1) 小鼠尾静脉循环血液的温度约为37 °C 。在过继转移前将细胞预热至 37 °C或室温可最大限度地减少对细胞的热休克并确保更好的体内存活率。
2) 尽可能限制将细胞上下吸入注射器；相反，通过倒置混合。反复将细胞吸进和吸出注射器会使它们承受不必要的纯粹压力，从而降低活力。如果您用 PBMC 注射任何其他细胞，可以将细胞混合在一起并作为单次接种注射，总体积为 200–250 µL 。
在静脉注射前血管扩张小鼠的尾静脉，以帮助可视化。这可以使用以下方法之一执行：
将笼子的一半放在安全热源（如热垫）的顶部。只有笼子的一半应该在热源上，这样笼子的一半温度较低，老鼠可以在过热的情况下移动到那里。
使用装满温水的手套直接对尾巴本身加热。确保水不太热，以免烫伤。
上述任何一种方法都可用于有效的血管舒张，但切勿让小鼠在热源周围无人看管。
如果注射有意识的小鼠，则将小鼠置于抑制剂中；如果注射麻醉小鼠，则将其置于温暖的麻醉诱导室中。
注意：如果注射麻醉小鼠，请确保尽快注射，因为麻醉剂会导致血管收缩，从而难以找到静脉。
用非惯用手握住温暖的尾巴，找到两条侧尾静脉之一。用 70% 乙醇擦拭尾巴（避免使用过多酒精，这可能会导致血管收缩）以消毒并增加静脉的可见度。然后，用惯用手将针斜向上插入尾巴中间三分之一的远端部分。
慢慢按下柱塞以测试您是否在静脉中。如果针在静脉中，则不会有阻力；但是，如果它不在静脉中，您会感到阻力。一旦确信您在静脉中，轻轻注入 100 µL 细胞悬浮液。将针头保持在原位 2-3 秒以限制注射细胞的回流，然后取下针头并用无菌纱布按压注射部位以止血并限制细胞悬浮液的回流。监测动物 5-10 分钟是否有任何不适或出血迹象。
注意：在尾静脉中注射细胞时不要将柱塞拉回，因为这可能会导致细胞结块。我们建议使用胰岛素注射器进行注射，因为死腔较少，可最大限度地减少注射过程中的体积损失。参见 Yano 等人。 (2020 )获取详细的视频协议。

第 2 天到终点：监测

根据批准的动物使用协议监测小鼠的体重和健康状况。对于我们的协议（UBC 动物护理委员会批准 A18-0180），这是每周三次。
细胞注射后每 7 天穿刺隐静脉一次，使小鼠流血，以监测细胞植入。
根据批准的动物协议对小鼠进行安乐死并结束实验。在我们的案例中，这是在达到以下任何标准时： i ) > 15% 的体重减轻，ii) 任何健康评分类别≥ 3，或 iii) 累积健康评分≥ 6（表 1）。

第 7 天以后：每周放血检查移植情况
按照以下步骤从外侧或内侧隐静脉采集血液：
肝素（50 mg/mL）添加到每只动物的单独管中，准备采血管（1.5 mL Eppendorf）。
的非惯用手将鼠标放在适当的限制器中，确保动物的腿保持伸展状态。
找到内侧（内）或外侧（外）隐静脉，并使用电动剃须刀去除毛发。用棉花擦拭预定的穿刺区域蘸有 70% 乙醇的尖头涂抹器，涂上一层薄薄的凡士林。
使用无菌 27 G 针头，在静脉最近端可见区域刺穿垂直于皮肤的血管。将针头留在静脉中 2-3 秒，让皮肤在穿刺部位周围伸展。
，在肝素化毛细管中收集血液（大约50-70 µL）。将血液从毛细管转移到采血管。在室温下储存管子，直到进一步处理。
用无菌纱布按压穿刺部位至少 30 秒或直到出血停止。将小鼠转移到笼子中并监测 10 分钟，以确保完全停止出血。

外周血的处理和流式染色
将 50 μL 的血液转移到 96 孔 V 形底板上，并添加 150 μL 的 PBS。
1,065 × g离心板 3 分钟，移去上清液。同时，用蒸馏水配制 1 × RBC 裂解液，37℃预热 °C水浴。
× RBC 裂解缓冲液中重悬血细胞沉淀，混匀，室温孵育 3 分钟， 1,065 × g离心 3 分钟，移去上清液。
第二次 RBC 裂解：将细胞沉淀重悬于 180 µL 的 1 × RBC 裂解缓冲液中，室温孵育 3 分钟， 1,065离心 ×克 3 分钟，移去上清液。
注意：细胞沉淀在红细胞裂解过程中保持松散附着。为避免细胞丢失，请小心吸取上清液。
第一次洗涤：将细胞沉淀重悬于 180 µL PBS 中， 1,065离心 × g 3 分钟，移去上清液。
第二次洗涤：在 180 µL PBS 中再次重悬细胞沉淀，以 1,065离心 × g 3 分钟，移去上清液。
在 PBS 中稀释小鼠 Fc 块（参见表 2），添加 25 μL/孔，并在室温下孵育 10 分钟。

表 2. 每周和终点植入测试的面板
类型标记克隆福陆稀释 (2 × ) 供应商猫。不。

表面鼠标 Fc 块 2.4G2 - 1: 50 BD 生物科学 553142
FVD - eF780 1：500 电子生物科学 65-0865-18
CD45 30-F11 AF700 1: 50 BD 生物科学 560510
CD45 HI30 V500 1: 50 BD 生物科学 560777
CD4 SK3 BV785 1: 50 BD 生物科学 563877
CD8 RPA-T8 BV711 1：100 BD 生物科学 563677
CD3 UCHT1 BB515 1：100 BD 生物科学 564466
hHLA-A2 BB7.2 装甲运兵车 1：100 英杰公司 17-9876-42

细胞内 hFoxp3 236A/E7 PE-Cy7 1: 50 电子生物科学 25-4777-42
h赫利俄斯 22F6 AF488 1: 50 生物传奇 137223

同时，按照表 2 在 PBS 中制备表面染色混合物。用 25 μL/孔的染色混合物加满水井，混合均匀，并在室温下在黑暗中孵育 20 分钟。
每孔加入 180 µL PBS， 1,065离心 × g 3 分钟，移去上清液。
注意：细胞内染色的可选附加步骤，例如，测量 FOXP3 表达：
9a.准备 1 × fix/perm 缓冲液（一份固定/透化浓缩液，三份固定/透化稀释剂）。
9b.在 100 μ L 的固定/烫发缓冲液中重悬细胞沉淀，并在室温下在黑暗中孵育 45 分钟。
9c.同时，在蒸馏水中制备 1 ×透化缓冲液。
9d。用 100 μ L 的透化缓冲液加满含有细胞颗粒的孔，在 1,065 x g下离心3 分钟，然后吸取上清液。
9e.第二次在 100 µL透化缓冲液中重悬细胞沉淀，以 1,065 × g离心3 分钟，然后吸取上清液。
9f.按照表 2 中的稀释度，在 1 ×透化缓冲液中制备细胞内染色混合物。
9克。在 25 μ L 的染色混合物中重新悬浮，并在室温下在黑暗中孵育 40 分钟。
9小时。用 180 µ L 透化缓冲液加满孔，以 1,065 × g离心3 分钟，然后吸取上清液。
用 180 μL 的 PBS 加满每个孔，以 1,065 x g离心3 分钟，然后吸取上清液。
在 150 μL 的 FACS 缓冲液（PBS + 1% FBS + 5 mM EDTA）中重新悬浮细胞，并将细胞转移到微试管中。
注意：为获得绝对细胞浓度，此时可将 10,000 个计数珠添加到每个微型试管中。确保充分涡旋珠子，因为它们会快速沉降。设置前向散射光 (FSC) 和侧向散射光 (SSC) 的电压，使细胞和珠子都可见。珠子在 FITC/PE 通道中发出强烈的荧光。在获取样品之前，确保这些通道中的珠子荧光在规模上。

用于流式细胞术的白细胞终点制备
采集心脏血液和脾脏
准备 1.5 mL Eppendorf 管，其中 3 μL 肝素用于心脏血液，1 mL PBS 用于脾脏。
使用异氟醚蒸发器气体麻醉室将鼠标放入麻醉手术平面。
将鼠标移至鼻锥，用肝素冲洗装有 27 G 针头的 1 mL 注射器，进行心脏穿刺，并提取约 100 μL 的血液。
执行颈椎脱位和收获脾脏，避免胰腺组织（胰腺酶可能对 T 细胞造成损害）。

心脏血液和脾脏的处理和流式染色
血液：
如“外周血的处理和流动染色”部分所述，对 70 µL 血液进行裂解和流动染色。
脾：
记录整个脾脏的重量，切下一小块（约 15 mg）脾脏组织，并在装有 50 mL Falcon 管和 1 mL 注射器柱塞的预湿（带 PBS）70 µm 细胞过滤器上捣碎。用 PBS 冲洗过滤器，直到不存在可见颗粒。
注：或者，将整个脾脏捣碎，然后取一部分细胞（即捣碎， 450 ×g离心细胞5 分钟，将细胞重悬于 1 mL PBS 中，取20 µL的 1/50总脾细胞）。
将细胞悬浮液以 450 x g离心5 分钟，通过倾倒丢弃上清液，并将（约 200 μL）转移到 96 孔 V 型底板。
将板以 1,065 × g离心3分钟，然后移去上清液
× RBC 裂解缓冲液中重新悬浮血细胞颗粒，并在室温下孵育 3 分钟，进行一次 RBC 裂解。
在 180 µL PBS 中重悬细胞沉淀， 1,065离心 × g 3 分钟，移去上清液。
在 180 µL PBS 中再次重悬细胞沉淀， 1,065离心 × g 3 min ，移去弃上清液。
在 PBS 中稀释小鼠 Fc 块（参见表 2），添加 25 μL/孔，并在室温下孵育 10 分钟。
同时，按照表 2 在 PBS 中配制染色液，每孔加入 25 µL 染色液，室温避光孵育 20 分钟。
每孔加入 180 µL PBS， 1,065离心 × g 3 分钟，移去上清液。
重悬洗涤细胞在 150 µL 的 FACS 缓冲液中，以 1,065 × g离心3 分钟，然后吸取上清液。
将细胞颗粒重新悬浮在 150 μL 的 FACS 缓冲液中，并转移到微试管中。

可选：固有层淋巴细胞 (LPL) 的处理和流式染色：
xenoGvHD的主要症状是肠道炎症和结肠炎样病理的表现。这可以通过使用以下协议分析结肠中的淋巴细胞来进一步研究：
收集结肠：打开腹部，收集从直肠到盲肠的整个结肠。沿着结肠推向直肠，轻轻去除粪便。将结肠放入装有 15 mL 冷 RPMI 的 50 mL Falcon 管中，辅以 10% FBS、2 μM Gibco GlutaMax 、1 × P/S、25 mM HEPES 和 55 μM β-巯基乙醇，冰冻保存。
的PBS，涡旋2-3 秒以清洗结肠。用额外的 ~ 25 mL PBS 重复此洗涤。丢弃 PBS 并添加15-20 mL的温暖 (37 °C) RPMI，辅以 5% FBS、1 mM DTT 和 1 mM EDTA。涡旋 2 – 3 秒，并在 37 °C 下摇动管子 10 分钟。
上皮内淋巴细胞洗涤：小心丢弃 RPMI/DTT 混合物并添加15-20 mL 冷( 4 °C) RPMI + 2% FBS。涡旋 2 – 3 秒以清洗结肠，丢弃上清液，并使用额外的 15 – 20 mL RPMI + 2% FBS 重复此清洗步骤。丢弃上清液并添加15-20 mL的温暖 (37 °C) RPMI，辅以 5% FBS、1 mM DTT 和 1 mM EDTA。涡旋 2 – 3 秒，并在 37 °C 下摇动管子 20 分钟。
结肠消化：小心丢弃 RPMI/DTT 混合物并添加15-20 mL 冷( 4 °C) RPMI + 2% FBS。涡旋 2 – 3 秒以清洗结肠，丢弃上清液，并使用额外的 15 – 20 mL RPMI + 2% FBS 重复此清洗步骤。丢弃上清液，加入 14 mL 的温暖（37 °C）RPMI，辅以 0.5 mg/mL 胶原酶 VIII + 20 μg/mL DNase I。在 37 °C 下摇动 30 分钟以消化结肠。
将介质和消化的结肠倒在新鲜的 70 µm 细胞过滤器上，倒入新鲜的 50 mL 管中。用注射器柱塞对细胞过滤器机械破坏剩余的结肠，并用额外的冷 RPMI + 2% FBS 清洗细胞过滤器，最终体积为 35 mL。以 500 x g沉淀细胞10 分钟。
淋巴细胞富集：制备等渗Percoll溶液（九份Percoll与一份 10 × PBS），并用此溶液用 1 × PBS 稀释以产生 40% 和 80% 的Percoll溶液。将 3 mL 的 80% Percoll添加到 15 mL Falcon 管中。将步骤 5 中的细胞沉淀重悬于 4 mL 的 40% Percoll中，并小心地覆盖在 80% Percoll上。在室温下以652 × g离心，关闭制动器。
去除类脂顶层以防止污染，并将含有 LPL（约 3 mL）的界面收集到新的 15 mL 管中。用 PBS 加满以在 4 °C 下以 652 × g洗涤和沉淀细胞5 分钟。重复此洗涤步骤并继续对丰富的 LPL 进行染色。
在 PBS 中稀释小鼠 Fc 块（参见表 2），添加 25 μL/孔，并在室温下孵育 10 分钟。
同时，按照表 2 在 PBS 中制备染色混合物，加满 25 μL/孔的染色混合物，并在室温下在黑暗中孵育 20 分钟。
用 180 μL 的 PBS 加满每个孔，以 1,065 x g离心3 分钟，然后吸取上清液。
重悬洗涤细胞在 150 µL 的 FACS 缓冲液中，以 1,065 × g离心3 分钟，然后吸取上清液。
将细胞颗粒重新悬浮在 150 μL 的 FACS 缓冲液中，并转移到微试管中。如果需要绝对细胞计数，请添加 10,000 个计数珠。

数据分析

流式细胞术数据分析
此处显示的数据是使用 BD LSRFortessa TM X-20 获取的，并在FlowJo中进行了分析。然而，也可以使用具有相似配置的不同流式细胞仪。数据应如图 2 所示进行分析。从总活事件中，人类细胞植入可以计算为总（人类和小鼠）CD45 +细胞的比例。仅注射 PBMC 后，到注射后第 21 天，预计人体细胞植入率将达到 20% 至 30%。
在试点研究中预先测试它们的xenoGvHD诱导能力。

图 2。用于计算 PBMC 植入的门控策略。应设置电压，使前向和侧向散射（FSC-A 与 SSC-A）图显示总细胞和珠子（第一个图）。来自总细胞、门单峰和活细胞（FVD 阴性部分）。从总活细胞、门小鼠 CD45 (AF-700-mCD45) 和人类 CD45 (V500-hCD45) 并计算左上象限中人类 CD45 细胞的百分比。第一个流程图（SSC-A 与 FSC-A）正在显示。

绝对细胞计数
涡珠 30 秒，在流式细胞仪中运行样品之前，为血液添加 10,000 个珠子，为脾脏样品添加 20,000 个珠子。我们调整了珠子浓度，使 10 mL 包含 10,000 个珠子。
调整 SSC 和 FSC 电压以检测磁珠和细胞（参见图 2，左上角）。在计数珠上画一个门，显示在带有 FITC 与 PE 的流量图上，并在双阳性群体上画门（图 3）。
使用数据分析软件 ( FlowJo ) 中的计数统计信息，使用以下等式确定细胞浓度。

Absolute count (cells/μL)=((Cell count × eBead vol))/((eBead count × Cell vol))× eBeads Concentration

注意：收集至少 7,000–8,000 个珠子事件以获得具有统计意义的结果。

图 3. 显示 SSC 与 FSC 和 FITC + PE +珠子中细胞门控和计数珠子的流程图。绝对细胞数计算基于 PE/FITC 双阳性事件计数。

胸腺 Tregs 延缓了xenoGvHD的发展
作为该模型如何用于测试新疗法的示例，在图 4 中，我们展示了 Treg 介导的xenoGvHD抑制示例。
胸腺 Treg 的制备：根据MacDonald 等人制备胸腺 Treg。（2019）。简而言之，胸腺细胞通过胸腺组织的机械解离，然后进行 CD25 阳性和 CD8 阴性选择来分离。该协议产生 >90% 纯 CD4 + CD25 + Foxp3 +胸腺 Tregs。
PBMC 的制备：按照上述 B 部分中描述的过程解冻冷冻的 PBMC。
× 10 6 /mL的细胞浓度重悬 PBMC 和 Tregs，并将它们分开。在注射时，混合 100 μL 的 PBMC 和 100 μL 的 Tregs，并按照上面 PBMC 注射部分中描述的方法通过尾静脉注射 200 μL 的混合细胞悬浮液。
注意：如果 Treg 与 PBMC 同种异体，则已知 HLA 不匹配有助于细胞追踪。我们定期对 PBMC 和 Tregs 进行 HLA-A2、-A3 和 -A24 表型分析以促进这一过程。同种异体 Treg 减少了人类 PBMC 的植入，而自体 Treg 对 PBMC 植入的影响最小（Dawson 等人，2019）。用不同类型的受体（例如，嵌合抗原受体）改造的 Tregs 可能对 PBMC 植入有更大的影响。

图 4。胸腺 Treg对xenoGvHD的抑制。将七百万个 HLA-A2 + PBMC 和七百万个 HLA-A2 -胸腺 Treg 注射到受照射的 NSG 小鼠中。注入的 Treg 要么是新鲜分离和静置的，要么是新鲜分离和激活的，要么是预先冷冻的。（一）。流程图显示了在细胞注射后第 7 天检测 HLA-A2 + PBMC 和 HLA-A2 -胸腺 Treg 的门控策略。 (二). Kaplan-Meier 生存曲线显示 Tregs 的输注延迟了xenoGvHD的发作。

可选：器官组织学
为了检测细胞浸润，对各种器官（肺、肝、心、肠、肾、皮肤等）进行组织学检查。更高程度的xenoGvHD的发生表明人类 CD45 阳性细胞的大量浸润。有关详细信息，请参阅道森等人。（2019）。

致谢

这项工作得到了加拿大卫生研究院的资助。

利益争夺

MKL 已获得Sangamo Therapeutics、Bristol-Myers Squibb、Pfizer、Takeda 和 CRISPR Therapeutics 的研究资助，用于与本研究无关的工作。所有其他作者声明没有竞争利益。

伦理

在进行任何小鼠实验之前，研究人员必须获得机构动物伦理委员会的适当培训和伦理批准。此处提供的数据是从不列颠哥伦比亚大学动物保护委员会批准的实验中获得的（协议：A18-0180）。

参考资料_

Adigbli , G.、 Menoret , S.、Cross, AR、Hester, J.、Issa, F. 和Anegon , I.（2020 年）。用于移植、移植物抗宿主病和再生医学建模的免疫缺陷动物人源化。移植104(11)：2290-2306。
Boardman, DA 和Levings , MK (2022)。用转基因 Treg 细胞治疗自身免疫性疾病的新兴策略。 J Allergy Clin Immunol 149(1)：1-11。
Dawson, NA, Lamarche, C., Hoeppli , RE, Bergqvist, P., Fung, VC, McIver, E., Huang, Q., Gillies, J., Speck, M., Orban , PC, 等。（2019）。调节性 T 细胞中同种异体抗原特异性嵌合抗原受体的系统测试和特异性作图。 JCI 见解4(6)。 e123672。
Ehx , G., Somja , J., Warnatz , HJ, Ritacco, C., Hannon, M., Delens , L., Fransolet , G., Delvenne , P., Muller, J., Beguin , Y., Lehrach , H., Belle, L., Humblet -Baron, S., Baron, F. (2018)。人源化 NSG 和 NSG-HLA-A2/HHD 小鼠的异种移植物抗宿主病。 Front Immunol 9:1943。
Ferrara, JL、Levine, JE、Reddy, P. 和 Holler, E. (2009)。移植物抗宿主病。柳叶刀373(9674)：1550-1561。
Gibson, BW, Boles, NC, Souroullas , GP, Herron, AJ, Fraley, JK, Schwiebert , RS, Sharp, JJ 和 Goodell, MA (2015)。通过在 C57BL/6J 小鼠中使用骨髓移植重建比较铯 137 和 X 射线辐照器。比较医学65(3):165-72。
Gschweng , E.、De Oliveira, S. 和 Kohn, DB (2014)。用于癌症免疫治疗的造血干细胞。免疫学 Rev 257(1)：237-249。
Khosravi-Maharlooei , M., Madley , R., Borsotti , C., Ferreira, LMR, Sharp, RC, Brehm, MA, Greiner, DL, Parent, AV, Anderson, MS, Sykes, M. ,等。 (2022)。模拟人类 T1D 相关的自身免疫过程。 Mol Metab 56:101417。
King, MA, Covassin , L., Brehm, MA, Racki , W., Pearson, T., Leif, J., Laning , J., Fodor, W., Foreman, O., Burzenski , L., 等人. (2009)。人外周血白细胞非肥胖型糖尿病-重度联合免疫缺陷白介素-2受体γ链基因小鼠异种移植物抗宿主样病模型及宿主主要组织相容性复合体的作用。临床实验免疫学157(1)：104-118。
Loiseau, P., Busson , M., Balere , ML, Dormoy , A., Bignon , JD, Gagne, K., Gebuhrer , L., Dubois, V., Jollet , I., Bois , M., 等人. (2007)。 HLA 与造血干细胞移植结果的关联：HLA-A、-B、-C、-DRB1 或-DQB1 的错配数量与总生存率密切相关。 Biol Blood Marrow Transplant 13(8): 965-974。
MacDonald, KN、Piret, JM 和Levings , MK (2019)。制造用于细胞治疗的调节性 T 细胞的方法。临床实验免疫学 197(1)：52-63。
Walsh, NC, Kenney, LL, Jangalwe , S., Aryee , KE, Greiner, DL, Brehm, MA, Shultz, LD (2017)。临床疾病的人源化小鼠模型。 Annu Rev Pathol 12:187-215。
Yano, J.、Lilly, EA、 Noverr 、MC 和 Fidel, PL (2020)。在小鼠真菌败血症模型中进行高效尾静脉注射的现代加热/约束装置。 J Vis Exp (165)：e61961。