材料与试剂

1. WillCo -dish® 12 毫米玻璃底培养皿（ WillCo Wells BV，目录号：HBST-3512 ）
2. 细胞培养瓶，T-75，表面：标准，过滤帽（ Sarstedt ，目录号：83.3911.002）
3. 活细胞（在此方案中，使用了 HCT116-Venus 细胞（Bozkurt 等人，2021）；但是，此方法适用于任何活细胞）
4. 胎牛血清 (FBS)（Sigma-Aldrich，目录号：F7525），储存在 -20 °C。
5. L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G7513），储存在-20°C
6. 矿物油，适用于小鼠胚胎细胞培养（Sigma-Aldrich，目录号：M5310），室温保存
7. 青霉素 - 链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P0781），储存在-20°C
8. Roswell Park Memorial Institute 1640 培养基（RPMI 培养基）（Sigma-Aldrich，目录号：R0883），4°C 保存
9. 四甲基罗丹明、甲酯、高氯酸盐 (TMRM)，（ Thermo Fisher Scientific，目录号：T668），储存于 4 °C
设备

1. 倒置共聚焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss Ltd，LSM 710），配备 40×/1.3 NA 平面复消色差透镜油浸物镜、显微镜培养箱（37 °C，5% CO 2 ）和电动载物台
2. 细胞培养罩（Heraeus、 HERAsafe 、HS12 型）
3. 离心机（ Eppendorf，5810，目录号：5810000060 ）
4. 水浴锅（GFL 1004 型）
5. 加湿 CO 2培养箱（N ew Brunswick/Eppendorf，Galaxy 170S ）

软件

1. ZEN 2009 版本 6,0,0,303 配置 5，配 MTS 2009-2010 版本 32.007
2. Fiji/ImageJ（美国国立卫生研究院， https://imagej.nih.gov/ij/ ）
3. PlotTwist ，一个用于绘制连续数据的网络应用程序( https://huygens.science.uva.nl/PlotTwist/)（Goedhart，2020年）

程序

A. 细胞接种和染色

1. 通过添加 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 μg /mL 链霉素，准备完整的细胞培养 RPMI （每个WillCo盘使用 4 mL进行计算）。
2. 在 37°C 水浴中预热完整的细胞培养基。
3. nM TMRM添加到 2 mL的完整细胞培养 RPMI来制备染色溶液。在 37 °C 水浴中保持染色溶液温暖。
4. WillCo培养皿上的 1.5 mL 染色溶液中接种7,500 个细胞，让它们在 37 °C 和 5% CO 2条件下粘附过夜。
注意：染色应在播种阶段添加，并在整个实验过程中留在媒体中。
5. 用经过胚胎测试的无菌矿物油覆盖WillCo培养皿。
加入矿物油后不要盖上WillCo培养皿的盖子。

B. 图像采集

1. 小心地将WillCo盘安装在 LSM 710 共聚焦激光扫描显微镜上。
注意：确保物镜和盖玻片之间的浸没介质中没有污垢或气泡，因为它会干扰图像采集和确定焦点的功能。
2. 启动 ZEN 软件。
3. 选择 40 × 1.3 NA 油物镜。
4. 随机选择多个位置。
5. 选择488 nm激光，调整到<5%，选择探测范围490-544 nm或505-560 nm对金星成像；使用 561 nm 激光，调整为 <0.5%，并选择 590–644 nm 的检测范围用于成像 TMRM。将两者的数字增益设置为 1，将偏移设置为 0。激活透射光检测器并确保在光束路径中具有所需的棱镜和分析器。声光可调谐滤波器的%传输基于氩激光器的488nm线，< 10mW ； 0.5% 是基于 561 nm 二极管泵浦固态激光器，当激光器是新的时为 40 mW 。这些设置应该在为实验选择的细胞上进行测试。对激光照射的耐受性可能会有所不同，共聚焦显微镜的校准和激光的年龄是影响物平面功率的主要因素，因此，对细胞造成光损伤。在这里，在对照条件下观察到 24 小时的细胞增殖和线粒体膜电位没有变化（用 TMRM 检测）。
6. 将缩放设置为 1 并使用 1024 × 1024 像素分辨率，视野为 212 μm 2 。将光学切片厚度设置为 1.5 – 2 μm ，使用双向扫描，并确保双向扫描和针孔已校准。然后，保存此配置以供与多时间序列宏一起使用。横向和轴向分辨率设置为细胞的最佳分辨率和成像条件之间的折衷。如果信噪比 (S/N) 太低，则可能需要进一步打开针孔。
7. 启动多个时间序列宏。
8. 确保位置已转移并为每个位置选择正确的配置。
9. 为每个位置运行自动对焦测试并相应地调整偏移量。
10. 定义硬盘驱动器 (HDD) 上的存储名称和位置，并确保至少有 30% 的可用碎片整理 HDD。此外，请确保有足够的可用存储空间以至少有 25% 的可用硬盘容量来结束实验。
11. 选择重复成像之间的时间间隔。这通常是 5 到 10 分钟左右，具体取决于位置数（保持位置数少于 12）。此外，选择实验重复次数。获取至少 12 小时的图像。请记住，较短的时间间隔也会增加对细胞的光损伤；时间间隔应足够短，以便查看您感兴趣的事件的顺序并跟踪对象。
12. 完成实验后，取出盘子，清洁物镜，然后按照 LSM 710 的关闭程序进行操作。
13. 将数据复制到服务器或移动硬盘，并在从图像采集 PC 删除数据之前生成第二个确认副本。

C. 图像处理

1. 下载并安装 Fiji/ImageJ 软件。
2. 启动斐济/ImageJ。
3. 观看“图像处理分步视频指南”（视频 1）。

视频 1。图像处理的分步视频指南

4. 单击“文件” - “打开”打开扩展名为 LSM 的文件。
注意：您只需将文件拖放到 Fiji/ImageJ 软件中即可。
5. 通过单击图像–调整–亮度/对比度（或简单地使用快捷键 Ctrl + Shift + C）打开亮度/对比度 (B&C) 面板。
6. -颜色-通道工具（或简单地使用快捷键 Ctrl + Shift + Z）打开通道工具。
7. 通过单击图像更改查找表-查找表并将 TMRM 设置为红色，将 Venus 设置为绿色。
注意：设置 Lookup tables 只是为了事件的可视化；可以选择任何颜色组合，因为它不会影响结果。
8. 根据需要调整 B&C。
注意：将 B&C 调整为自动通常会得到很好的结果。
9. 取消标记通道工具上的 DIC 通道，然后慢慢滚动整个字段以定位 entotic 事件。如果发生嵌顿细胞死亡事件，一个大的圆形结构将显示 TMRM 随着时间的推移积累，同时金星荧光减少，将出现在现场（参见图 1 和视频 2）。

图1 。未经处理的 HCT116 细胞中嵌顿事件的代表性视野和动力学。 (A) HCT116-Venus 细胞嵌顿事件的代表性延时显微镜图像。显示了 DIC、Venus（绿色）和 TMRM（红色）。白色虚线和黄色虚线分别表示内部单元格 (IC) 和外部单元格 (OC)。 ( B)在嵌顿和嵌顿细胞死亡过程中，TMRM 的单细胞动力学和内细胞中的 Venus 荧光强度的量化。

视频 2。代表性延时视频显示未经处理的 HCT116 细胞中的嵌顿事件。显示了 DIC、Venus（绿色）和 TMRM（红色）。帧率：每秒20帧；两帧之间的间隔为 4 分钟。白色箭头描绘了一个嵌顿事件。

10. 找到事件后，通过向后滚动以确认一个单元格正在入侵另一个单元格来仔细跟踪该事件。
11. -工具- ROI 管理器打开 ROI（感兴趣区域）管理器。
12. 使用多边形选区在内部单元格周围小心地绘制一个区域。使用放大镜工具校正边缘。使用右键单击连接选择的第一个和最后一个点。
注意：不要使用放大镜工具，只需按住 Shift 键并使用鼠标滚动进行放大和缩小并按S步进，然后在字段上单击鼠标左键即可自由移动。
13. 可选：在这个阶段，在较小的视野下工作更容易并且使用更少的计算机功率。要创建较小的视野，请单击矩形工具，绘制一个覆盖事件的区域，然后单击图像 - 复制，然后单击确定。
笔记：
a. 在绘制区域时按住 Shift 键将创建一个方形区域。
b. 只需使用快捷键 Shift + D 即可复制该区域。通过单击文件保存此区域-保存（或使用快捷方式 Ctrl + S）以进行进一步分析。
14. 单击 ROI 管理器上的添加（或使用快捷方式 t）添加选择，单击下一个切片，修改选择（或绘制新选择），然后单击 ROI 管理器上的添加。重复此步骤，直到记录了entosis事件的所有步骤。（按 Alt + 鼠标滚动将移动到下一个切片。）
15. 通过在 ROI 管理器上按 Ctrl + A 选择所有区域，然后通过单击更多保存区域-在 ROI 管理器上保存。
注意：区域可以随时更新，方法是先点击一个区域，然后在修改区域后点击更新。稍后也可以通过单击更多-在 ROI 管理器上打开来打开区域。
16. 单击分析-设置测量值并标记平均灰度值。
17. 要测量平均荧光强度 (MFI)，请选择图像上的 TMRM 通道，通过在 ROI 管理器上按 Ctrl + A 选择所有区域，然后单击“测量”。将结果文件重命名并保存为 TMRM。重复此步骤以测量金星并将文件重命名为金星。
18. 可选：可以使用 Fiji/ImageJ 创建延时视频。在生成视频格式之前，我们建议通过单击图像 - 堆栈 - 时间戳来放置时间戳。还要确保在生成视频之前添加任何注释或标签。要从实验中创建延时视频，请单击文件-另存为 - AVI，选择压缩格式和帧速率，然后单击确定。
19. 可选：可以从延时图像创建蒙太奇。点击Image – Stacks – Make Montage，根据需要完成新的设置窗口，点击OK。
D. 数据可视化与分析

1. 打开PlotTwist ，单击数据上传，然后单击下载（整洁）数据 (.csv)。
2. 小心地将 TMRM 和 Venus 的结果复制并粘贴到模板中。
3. 单击数据下的绘图并选择数据作为点。标记地块厚度；将数据的可见性设置为 0.4，将统计的可见性设置为 0.0； mark Change scale，设置 Range x-axis ( min,max ) scale 为 0,850 和 Range y-axis ( min,max ) 为 0,2000；标记为数据使用颜色并单击调色板 Tol；明亮的;设置高度（目录号：像素）为480，宽度（目录号：像素）为480；在 Labels 标记下 Add treatment/condition 和Bar&Box ；将灰色框的范围（从，到）设置为 TMRM 强度开始增加和 Venus 强度开始降低的时间；添加文本作为内部单元退化的开始并标记添加标题；标记更改轴标签并将 x 轴更改为时间（分钟），将 y 轴更改为平均荧光强度（ au 。）； mark 给对象添加标签。
4. 要在将来重复使用相同的设置，请单击克隆当前设置选项卡，复制链接并将其粘贴到文件中作为PlotTwist _Settings。

笔记

1. 图 1A 的原始数据可以在Supplementary_File 1中找到。
2. PlotTwist设置可以在Supplementary_File 2中找到。此链接可以直接复制并粘贴到任何网络浏览器以生成相同的图形。

致谢

这项工作得到了爱尔兰科学基金会 (16/RI/3740, 16/US/3301, 18/RI/5792) 和健康研究委员会 (16/US/330, TRA/2007/26)。这项研究全部或部分由爱尔兰科学基金会资助。
该协议与我们之前发表在《细胞生物学杂志》上的研究相关（Bozkurt等人，2021 年，doi:10.1083/jcb.202010030）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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