材料与试剂

1. PCR 管（Bio Basic Canada Inc.，目录号：BP541-S100）
2. P200 尖端（Bio Basic Canada Inc. ，目录号：BT224-YS）
3. Eppendorf 管（ UltiDent Scientific，目录号：87-B150-C）
4. 96 孔微孔板（Corning，目录号：351172）
5. PVDF 膜（GE Healthcare，目录号：10600023）
6. 15 毫升猎鹰管
7. 链霉亲和素琼脂糖（Millipore Sigma，目录号： 69203)
8. 牛血清白蛋白（BSA）（ Bioshop ，目录号：ALB001.100）
9. RNA 探针（Sigma，序列：5'-[ Btn ]UUUCUUUUUUCUUAUUCUUAUU-3'；见注释 1）
10. DEPC（Bio Basic，目录号：1609-47-8）
11. 脱脂奶粉（康乃馨，目录号：n/a）
12. Clarity Western ECL 底物（Bio-Rad，目录号：170-5060）
13. Tris（ Bioshop ，目录号：77-86-1）
14. Tris-HCl（ Bioshop ，目录号：1185-53-1）
15. 盐酸（HCl）（贫血，目录号：CA11020-884）
16. 氢氧化钠颗粒（ Bioshop ，目录号：SHY700.2）
17. NaCl（ Bioshop ，目录号：SOD002.1）
18. DTT（ Bioshop ，目录号：DTT001.25）
19. EDTA ，二水合二钠（ Bioshop ，目录号：EDT001.500）
20. 甘油（ Bioshop ，目录号：56-81-5）
21. SDS（ BioShop ，目录号：SDS001）
22. Tween-20（ Bioshop ，目录号：TWN510.500）
23. 溴酚蓝（Sigma，目录号：B-6896）
24. 2-巯基乙醇（Sigma，目录号：M3148）
25. HisProbe -HRP 结合物（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15165）
26. 蛋白质测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad，目录号：5000006）
27. 库存解决方案（参见食谱）
28. 下拉缓冲器和解决方案（参见食谱）
29. 蛋白质印迹和其他缓冲液（参见配方）

设备

1. 100 毫升烧杯
2. 500 毫升烧杯
3. 电磁搅拌机
4. Sorvall Legend Micro 21 离心机（ Thermo Scientific，目录号： 75772436）
5. 微型离心机（Fisher Scientific，目录号： 05-090-100）
6. Gel Doc XR+ 成像系统（Bio-Rad，型号：Universal Hood II）
7. 仪（Bio-Rad，型号： ICycler Thermal Cycler）
8. 旋转器（ Kylin -Bell Lab Instruments，型号：BE-1100）
9. -80 °C 冰箱（ Thermo Scientific，型号：990）

软件

1. ImageJ 1.50c 软件
2. GraphPad 棱镜 v7.00

程序

下面的程序概述了三个主要步骤：(A) 微珠制备，(B) 蛋白质-RNA 结合反应，以及 (C) 链霉亲和素-生物素下拉和检测。该程序最初用于研究 Nab3 RRM 与生物素化小核仁 RNA（例如，snR47）探针之间相互作用的结合亲和力（Lee 等人，2020）。如果此过程要与其他蛋白质-RNA 相互作用一起使用，那么我们建议考虑变量（例如，RNA 探针长度、RNA 结构、缓冲液条件、温度等）如何影响 RNA-蛋白质相互作用并相应地进行调整（见注释 2 和 4）。此外，此处的蛋白质来源是重组 His 标记的 Nab3 RRM，从大肠杆菌中表达和纯化。如果需要进行结合亲和力测量，则首选纯蛋白质来源（见注释 2）。

A. 珠子准备

1. 切掉 P200 吸头的末端（平均2-3 毫米），将 150 μ L （即 75 μL干珠体积）链霉亲和素-琼脂糖转移到 Eppendorf 管中（见注释 3）。
2. 以 500 × g离心珠子2 分钟并弃去上清液（见注释 5）。
3. 用 1 mL 的洗涤缓冲液清洗 5 分钟，端到端旋转。
4. 在 500 x g下旋转珠子2 分钟并丢弃上清液。
5. 重复步骤 A3–A4 两次。
6. 加入 300 μ L含有 5% BSA 的洗涤缓冲液，并端到端旋转孵育 4 小时。
7. x g离心珠子2 分钟并弃去上清液。
8. 用 500 μL的洗涤缓冲液清洗 5 分钟，端到端旋转。
9. x g离心珠子2 分钟并弃去上清液。
10. 重复步骤 A8–A9 五次，但保留第五次洗涤的上清液用于 Bradford 测定。
11. 在 triplicates 中，将 10 μL的洗涤缓冲液（作为空白）或上一步中保留的上清液添加到 96 孔微孔板中的 190 μL稀释布拉德福德试剂中，并测量 595 nm 处的吸光度。
12. 如果上清液与空白无法区分，则继续执行步骤 A13。如果不是，重复步骤A8-A9，直到得到这个结果。
13. 在 260 μL的洗涤缓冲液中重新悬浮珠子。
14. 使用末端切断的 P200 尖端将20 μL的珠子（约 5 μL干珠体积）分配到单独的 PCR 管中。
15. 将准备好的珠子悬浮液保持在 4°C 或冰上，直到需要为止。

B. 蛋白质-RNA结合反应

1. 从 -80 °C 中取出 RNA 探针、蛋白质库存和蛋白质储存缓冲液，然后在冰上解冻。
2. 根据表 1在 PCR 管中准备结合反应作为 10 μL反应。调整体积以达到所需的蛋白质或 RNA 浓度。

表1 。蛋白质-RNA 结合反应。下面的示例显示了用于准备结合反应的初始实验设置，其中 RNA 探针浓度固定为 25 μM ，蛋白质浓度从 1 到 50 μM ，以及反应对照。
5 ×结合缓冲液 ( μL ) 最终蛋白浓度 ( μM ) 100 μM蛋白质原液 ( μL ) 蛋白质储存缓冲液 ( μL ) 最终 RNA 探针浓度 ( μM ) 250 μM RNA 探针 ( μL ) DEPC水
控制 1 2个 0 0 7 25 1个 0
对照 2 2个 50 5个 2个 0 0 1个
反应 2个 1–50 0.1–5 2–6.9 25 1个 0

3. 在 15°C 的热循环仪中孵育 30 分钟。
4. 将反应置于冰上并立即进行 C 部分。

C. 链霉亲和素-生物素下拉和检测

注意：除非另有说明，否则所有离心均应在微型离心机上进行 (2,200 × g ) 在室温下。
1. 将每个结合反应或控制转移到包含准备好的珠子的单独 PCR 管中。
2. 在 4°C 下孵育 2 小时，并进行端到端旋转。
3. 向下旋转珠子 2 分钟并丢弃上清液。
4. 用 100 μL的洗涤缓冲液清洗珠子 5 分钟，端到端旋转。
5. 重复步骤 C3。
6. 重复步骤 C4–C5 四次。
7. 添加 20 μL的Laemmli缓冲液和 2-巯基乙醇以洗脱结合蛋白。
8. 在 95°C 的热循环仪中混合和加热管 5 分钟。
9. 向下旋转珠子 2 分钟。
10. 将整个样品（上清液）加载到标准 SDS-PAGE 凝胶上（此处使用 17% 的凝胶，由于其体积小，因此对感兴趣的重组蛋白具有特异性；参见注释 6 和 7）。
11. 在 120 V 下运行凝胶约 2 小时（直到染料前沿到达底部）。
12. 在 180 mA 下将蛋白质转移到 PVDF 膜上 2 小时。
13. 在封闭缓冲液中封闭膜 1 小时。
14. 用 TBST 清洗膜 5 次，每次 5 分钟（参见食谱）。
15. 用适当的抗体或探针（HRP 偶联的HisProbe ）孵育膜 4 小时或在 4°C 下过夜。
16. 用 TBST 洗膜 5 次，每次 5 分钟。
17. 使用 ECL 底物通过标准化学发光检测对膜进行成像。

代表性数据

图 1. 评估 His-Nab3 RRM (329–419) 与生物素化 snR47 RNA 探针的结合。 (A)使用 HRP 偶联的HisProbe对结合的 His 标记重组蛋白 (1–50 μM ) 和 25 μM RNA 探针进行化学发光检测。 (B) 变量 His-Nab3 RRM (329–419) 与生物素化snR47 RNA 探针的剂量反应结合曲线。 K D显示在图形面板中。 (C)使用 HRP 偶联的HisProbe化学发光检测与 25 μM RNA 探针结合的 His-Nab3 RRM 野生型和突变蛋白（10、25、50 μM ）。

数据分析

A. 密度计

1. 启动 ImageJ 并打开包含原始印迹图像的文件。
2. 选择“图像”、“类型”，然后选择“ 8 位”，将图像转换为8 位灰度。
3. 通过选择“分析”然后“设置测量”来设置测量标准。在弹出窗口中，确保仅选中“平均灰度值”并单击“确定”。
4. 在印迹上最大的条带周围画一个矩形。
5. 单击“分析”，然后单击“测量”（或Ctrl+M ），然后记录值。
6. 不调整矩形的大小，将矩形移动到下一个波段并重复步骤 A5。
7. 继续测量每个样品泳道的蛋白质条带密度，包括零蛋白质条件的泳道（这将作为背景测量）。
8. 从所有其他值中减去背景值。
9. 将每个条件标准化为最大结合信号（即Bmax ）。

B. 曲线拟合和K D估计

1. 启动 GraphPad 棱镜。
2. 在“New table & graph”下的弹出窗口中选择“XY”。在“输入/导入数据”下，对于“X”选择“数字”，对于“Y”选择“为每个点输入并绘制单个 Y 值”。然后点击“创建”。
3. 在“数据表”中输入蛋白质浓度和相应的归一化结合值。
4. 在“图表”中可视化结合曲线并确保结合曲线达到饱和。
5. 在“分析”下选择“用非线性回归拟合曲线”。
6. 在“剂量反应-刺激”下的弹出窗口中，选择“[激动剂] vs. 标准化反应-可变斜率”方程。
7. 导航到“结果”表并找到 EC50 值（在这种情况下，背景已被减去，EC50 代表 K D ）。

笔记

1. 设计 RNA 探针时必须考虑几个变量。本文概述的程序中使用的 snR47 RNA 探针序列以前用于表征 Nab3 RRM 和 snRNA 之间的蛋白质-RNA 相互作用（ Hobor等人，2011）。该探针序列最初用于荧光各向异性，并在5'-标记有荧光标记。在这里，我们用生物素替换了荧光团，以便使用链霉亲和素包被的珠子进行下拉。如果旨在通过使用此 RNA pull-down 来评估先前以荧光各向异性为特征的蛋白质-RNA 相互作用之间的结合亲和力，那么我们建议使用相同的探针序列并在 RNA 的同一端用生物素替换荧光团。对于表征较少的 RNA-蛋白质相互作用，我们建议尝试使用 5'-生物素或 3'-生物素标记，以及使用序列长度和探针序列中结合位点的数量进行实验。
2. 我们仅使用从大肠杆菌制备的纯重组蛋白执行了此程序。天然蛋白质的纯来源可以从其他来源获得 [例如来自Sf9细胞的重组体或来自细胞的免疫沉淀（使用天然洗脱）]。如果旨在通过执行图 1A 和 1B 所示的实验来获得结合亲和力测量值 (K D )，则需要相对纯净的可量化蛋白质来源。如果旨在简单地评估蛋白质的相对 RNA 结合，如图 1C 所示，那么理论上可以使用其他更不纯的蛋白质来源，例如细胞裂解物或体外翻译的蛋白质。作为初始实验，我们建议对样品进行滴定，因为感兴趣的蛋白质的表达水平可能会有所不同。
3. 珠子制备部分概述了珠子平衡和封闭的标准程序。对于使用的珠子体积，我们建议根据所需的珠子体积和使用的生物素化 RNA 探针的量调整此参数。一般来说，我们的目标是每次结合反应使用大约 5 μL的干珠体积。在 >85 nmol 生物素/mL 的结合能力下，5 μL干珠足以捕获 >425 pmol生物素。在10 μL反应中生物素化 RNA 探针浓度为 25 μM时，存在 250 pmol探针，因此使用的珠子数量足以捕获所有探针分子。
4. 本协议中提供的结合反应条件适用于评估 Nab3 RRM (329–419) 与 snR47 RNA 探针的结合。如果对另一种相互作用感兴趣，我们建议使用以前在文献中使用过的缓冲条件。这里使用的探针和蛋白质浓度范围是评估生物相互作用的良好起点；然而，这些变量可能需要优化。如果增加生物素化 RNA 探针的浓度，请确保使用足够的链霉亲和素-琼脂糖珠，以便捕获的 RNA 量不受珠子结合能力的限制。应考虑其他变量，如结合反应温度和时间，因为这些可能会影响所用 RNA 探针的降解。我们和其他人分别在 15 °C 和 25 °C 的 Nab3-RNA 结合反应中使用了 snR47 探针序列 ( Hobor et al., 2011)。最后，温度和某些缓冲成分（如 DTT）可能会影响形成的二级和三级结构。 Nab3 RRM 与 snR47 的结合不涉及二级或三级 RNA 结构；然而，如果感兴趣的蛋白质需要这样的结构，那么我们建议相应地调整温度和结合反应。
5. 为确保在去除上清液的过程中没有珠子丢失，可以使用针头去除上清液。
6. SDS-PAGE 的参数（例如，凝胶百分比）和转移（例如，时间）可能需要根据感兴趣的蛋白质的大小进行更改。
7. 为确保检测方法按预期执行，可以加载包含目标重组蛋白的额外泳道。一般来说，加载 10% 的输入蛋白质应该足以通过免疫印迹检测。
8. 粉末形式的干燥 SDS 使用起来非常危险；建议在称量粉末时佩戴适当的个人防护设备，例如面罩和护目镜。作为替代方案，最好购买现成的 10% 和 20% SDS 溶液。

食谱

库存解决方案

1. Tris，1 M pH 8.0
a. 将 121.14 g Tris 添加到 1 L 烧杯中
b. 加入800mL蒸馏水
c. 用磁力搅拌器搅拌至溶解
d. 用 HCl 调节 pH 值至 8.0
e. 在量筒中加满体积至 1 L
f. 121 °C 高压灭菌 20 分钟
g. 常温保存

2. Tris，1 M pH 6.8
a. 将 121.14 g Tris 添加到 1 L 烧杯中
b. 加入800mL蒸馏水
c. 用磁力搅拌器搅拌至溶解
d. 用 HCl 调节 pH 值至 6.8
e. 在量筒中加满体积至 1 L
f. 121 °C 高压灭菌 20 分钟
g. 常温保存

3. 安全数据表，10% w/v
a. 将 10 g SDS 添加到 100 mL 烧杯中（见注释 8）
b. 加入 100 mL 蒸馏水
c. 用磁力搅拌器搅拌至溶解
d. 常温保存

4. Tris-HCl，1 M pH 7.8
a. 将 157.6 g Tris-HCl 添加到 1 L 烧杯中
b. 加入800mL蒸馏水
c. 用磁力搅拌器搅拌至溶解
d. 用 HCl 调节 pH 值至 7.8
e. 在量筒中加满体积至 1 L
f. 121 °C 高压灭菌 20 分钟
g. 常温保存

5. 氯化钠，4M
a. 将 116.88 g NaCl 添加到 500 mL 烧杯中
b. 加入 350 mL 蒸馏水
c. 用磁力搅拌器搅拌至溶解
d. 在量筒中加满体积至 500 mL
e. 121 °C 高压灭菌 20 分钟
f. 常温保存

6. 地面地面电视，1M
a. 将 1.54 克 DTT 添加到 15 mL 猎鹰管中
b. 加入 7.5 mL 蒸馏水
c. 颠倒或涡旋直至溶解
d. 将体积加满至 10 mL
e. 制备 0.5–1 mL等分试样并储存在 -20 °C

7. 乙二胺四乙酸，0.5 M pH 8
a. 将 93.06 g EDTA 添加到 500 mL 烧杯中
b. 加入300毫升蒸馏水
c. 用磁力搅拌器搅拌，慢慢加入约20克氢氧化钠颗粒溶解
d. 将 pH 值调整为 8
e. 在量筒中加满体积至 500 mL
f. 121 °C 高压灭菌 20 分钟
g. 常温保存

8. DEPC H 2 O
a. 将 1 mL DEPC 添加到 999 mL 蒸馏水中
b. 在磁力搅拌板上室温搅拌过夜
c. 121 °C 高压灭菌 20 分钟
d. 常温保存

下拉缓冲器和解决方案

1. 蛋白质储存缓冲液
试剂终浓度数量
Tris（1 M，pH 8.0） 20毫米 20毫升
氯化钠 (4 M) 250毫米 62.5 毫升
甘油 5%（体积比） 50 毫升
地面地面电视 (1 M) 1毫米 1毫升
氢气_ _ 不适用 866.5 毫升
全部的不适用 1 公升

2. 5 ×结合缓冲液
试剂终浓度数量
Tris-HCl (1 M, pH 7.8) 50毫米 0.5 毫升
氯化钠 (4 M) 250毫米 0.625 毫升
乙二胺四乙酸 (0.5 M) 5毫米 0.1 毫升
甘油 25%（体积比） 2.5 毫升
地面地面电视 (1 M) 12.5毫米 0.125 毫升
DEPC H 2 O 不适用 6.15 毫升
全部的不适用 10毫升

3. 洗涤缓冲液
试剂终浓度数量
结合缓冲液 (5 × ) 1 × 2毫升
吐温20 0.1% 10微升_
DEPC H 2 O 不适用 8毫升
全部的不适用 10毫升

4. RNA探针
a. 根据收到的 RNA 探针的数量，溶解在足够体积的 DEPC 水中，最终浓度为 250 μM 。
b. 快速分装并储存在 -80 °C 直至使用。

5. 蛋白质原液
根据纯重组蛋白的浓度，使用蛋白储存缓冲液将蛋白稀释至终浓度为 100 μM （见注释 2）。

蛋白质印迹和其他缓冲液

1. 稀释的 Bradford 试剂
注意：使用前准备。
a. 将 1 mL 的蛋白质测定染料试剂浓缩物添加到 15 mL Falcon 管中。
b. 加入 4 mL 蒸馏水并倒置混合。

2. 结核菌素，pH 7.6
a. 在 800 mL 蒸馏水中溶解 3.152 克 Tris-HCl 和 8.006 克 NaCl
b. 用氢氧化钠调节 pH 值至 7.6
c. 加入 1 mL Tween-20 并混匀
d. 用蒸馏水补足体积至 1 L
e. 常温保存

3. 阻塞缓冲区
注意：使用前准备。
a. 将 1 g 脱脂奶粉溶解在 10 mL TBST 中
b. 反转或涡旋溶解

4. 稀释的 HisProbe -HRP 偶联物
注意：使用前准备。
a. 在 15 mL Falcon 管中，在 5 mL TBST 中稀释 1 μL HisProbe -HRP偶联物
b. 储存在 4 °C 或冰上直至使用前
c. 将使用过的溶液储存在 4°C

5. Laemmli缓冲液，2 ×
试剂终浓度数量
Tris（1 M，pH 6.8） 120毫米 1.2毫升
甘油 20% 体积比 2毫升
安全数据表 (10% w/v) 4% 瓦特/瓦特 4毫升
水不适用 2.8 毫升
溴酚蓝 0.02% 瓦特/瓦特 2毫克
全部的不适用 10毫升

6. 含 2-巯基乙醇的Laemmli缓冲液
a. 在 1.5 mL Eppendorf 管中，混合 50 μL 2-巯基乙醇和 950 μL Laemmli缓冲液， 2 ×
b. 常温保存

致谢

这项研究得到了加拿大自然科学与工程委员会 (NSERC) 向 KKB 提供的发现资助 (资助号 RGPIN-2016-06151) 的支持。 Anand Chopra 获得了加拿大 NSERC 的加拿大研究生奖学金 - 博士 (CGS-D)。菲拉斯 Balbous获得了加拿大 NSERC 颁发的本科生研究奖。 Lee 等人使用了该协议。（2020）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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Corley, M.、Burns, MC 和 Yeo, GW (2020)。 RNA 结合蛋白如何与 RNA 相互作用：分子和机制。分子细胞78(1)：9-29。
Hobor , F., Pergoli , R., Kubicek , K., Hrossova , D., Bacikova , V., Zimmermann, M., Pasulka , J., Hofr , C., Vanacova , S., Stefl , R. ( 2011）。核聚腺苷酸化 RNA 结合 (NAB) 3蛋白识别转录终止信号。生物化学杂志 286(5)：3645-3657 。
Lee, KY, Chopra, A., Burke, GL, Chen, Z., Greenblatt, JF, Biggar , KK, Meneghini , MD (2020) Nab3 RRM 域中关键的 RNA 结合赖氨酸残基经历 SET1 和 SET3 响应甲基化。核酸研究。 48(6)：2897-2911。
Majumder, M. 和Palanisamy , V. (2021)。揭示体内 RNA-蛋白质相互作用的方法纲要。方法协议4(1)：22。
Ramazi , S. 和 Zahiri, J.（2021 年）。蛋白质的翻译后修饰：资源、工具和预测方法。数据库（牛津） 2021。
Singh, J.、Hanson, J.、 Paliwal , K. 和 Zhou, Y.（2019 年）。使用二维深度神经网络和迁移学习的集合预测 RNA 二级结构。 Nat Commun 10(1)：5407。
Zhang, N.、Lu, H.、Chen, Y.、Zhu, Z.、Yang, Q.、Wang, S. 和 Li, M. (2020)。 PremPRI：预测错义突变对蛋白质-RNA 相互作用的影响。国际分子科学杂志21(15)：5560。