材料和试剂

血清移液管，10 mL（Drummond，目录号：6 000 010）
Labcon Eclipse 补充装通用移液器吸头，带有TubeGuard 0.1 – 10 µ L （ Labcon Eclipse，目录号：1036-260）
VWR 再填充移液器吸头 100/200 µL（VWR，目录号：89079-476）
VWR 再填充移液器吸头 1 , 000 µ L （VWR，目录号：89079-470）
15 mL离心管，散装，无菌，25/pk，500/cs（Montreal Biotech，目录号： MBI601052C ）
50 mL离心管，散装，无菌，25/pk，500/cs（Montreal Biotech，目录号： MBI602052C）
150 mm × 15 mm 组织培养处理的培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875714）
Microtube-50 AFA 纤维螺旋盖小瓶（ Covaris ，目录号：520166）
注射器过滤器 PES 0.22 µm 30 mm 直径，通过伽马辐射灭菌（ Ultident ，目录号：229747）
NEB ® 5-alpha F'Iq感受态大肠杆菌（高效）（ New England Biolabs，目录号：C2992H）
Mag-Bind ® TotalPure NGS珠子（ Omega Bio-Tek ，目录号：M1378-01）
NEBNext ®末端修复模块（ New England Biolabs ，目录号： E6050S ）
Monarch ® DNA洗脱缓冲液（ New England Biolabs，目录号：T1016L ）
连接测序试剂盒（Oxford Nanopore Technologies，目录号：SQK-LSK110）
原生条形码扩展 1-12（Oxford Nanopore Technologies，目录号：EXP- PBC001 ）
Blunt/TA 连接酶预混液（New England Biolabs，目录号：M0367S）
NEBNext FFPE DNA 修复混合物（New England Biolabs，目录号：M6630S）
NEBNext快速连接模块 - 20 rxs （New England Biolabs，目录号：E6056S）
ThermoPol缓冲液的 Taq DNA 聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0267S）
dNTPs混合物10 mM（ BioBasic ，目录号：DD0056）
琼脂糖（Bishop Canada Inc.，目录号：AGA002.250）
NEBuilder HiFi DNA 组装主混合物（New England Biolabs，目录号：E2621S）
胰蛋白胨（ BioBasic ，目录号：TG217（G211））
酵母提取物（ BioBasic ，目录号：G0961）
琼脂A（ Biobasic ，目录号：FB0010）
氯化钠（Fisher Scientific，目录号： S271-1 ）
氢氧化钠（白色颗粒）（Fisher Scientific，目录号：BP359-212）
盐酸（Fisher Scientific，目录号：A144-212）
硼酸（ Omnipure ，目录号：2710）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma Aldrich，目录号：E9884-100G）
锰六水合物（Fisher Scientific，BP214-500）
二水合氯化钙（Sigma Aldrich，目录号：223506-500G）
PIPES，倍半钠盐（Fisher Scientific，目录号：BP304-100 ）
氧化钾丸（Fisher Scientific，目录号：P250-500 ）
Trizma Base（AMRESCO，目录号：0497-5KG）
氨苄青霉素，三水合物（ BioBasic ，目录号：AB0064）
pUC-19 质粒（NEB，目录号：N3041S）
Covaris AFA 级水（800 mL）（D-mark Biosciences，目录号：Cov-520101）
Lambda DNA/Hind III 加标记（ BioBasic ，目录号：M105R-2）
Ecostain （ BioBasic ，目录号：DT81413）
细胞刮刀（Cole-Parmer，目录号：UZ01959-14）
EZ-10 离心柱质粒 DNA 小量制备试剂盒（ BioBasic ，目录号：BS414）
NucleoBond® _ Xtra maxi plus EF（Takara，目录号：740426.10）
pYD1 质粒（ Addgene ，目录号：73447）
限制酶：
Bam HI（新英格兰生物实验室，目录号： R0136S ）
Hind III（New England Biolabs，目录号： R0104S ）
X ho I （New England Biolabs，目录号： R0146S ）
NEBuffer TM r3.1（New England Biolabs，目录号： B6003S）
流通池（R9.4.1）（Oxford Nanopore Technologies，目录号：FLO-MIN106D）
Luria-Bertani (LB) 培养基，含琼脂和氨苄青霉素（参见食谱）
氨苄青霉素原液 (100 mg/mL) (50 mL) （参见食谱）
Tris-Borate-EDTA 缓冲液（10 L）（参见配方）
10 × TBE 储备溶液 (1 L) （参见配方）
SOB 培养基 (1 L) （见食谱）
Inoue 溶液 (1 L) （见食谱）
0.5 M PIPES 缓冲液 (100 mL) （参见配方）
70% 乙醇（见配方）

设备

移液器 0.2 – 2 µL（Gilson，目录号：FA10001M）、2 – 20 µL（Gilson，目录号：FA10003M）、20 – 200 µL（Gilson，目录号：FA10005M）和 100 – 1,000 µL（Gilson，目录号: FA10006M)
Portable Pipet-Aid ® XP 移液器控制器（Drummond，目录号：4-000-101）。
聚焦-超声波发生器（ Covaris ， M220，目录号： 500295 ）
管的 12 位磁力架（ Promega，目录号：Z5342 ）
T100 热循环仪（Bio-Rad，目录号：1861096）
Isotemp 215 水浴（Fisher，目录号： 15-462-15 ）
Avanti® JE离心机，50 Hz，200 V，24 A（Beckman Coulter，目录号：369005）
微量离心机 5418/5418R （Eppendorf，目录号：EP5401000137）
变速摇床振动台（VWR，目录号：75832-308）
NAPCO 模拟显示自动 CO 2水套培养箱（ Napco ，目录号： 102219021 ）
Innova® 44 培养箱摇床（New Brunswick，目录号：M1282-0000 ）
超纯水系统（Millipore Synergy，目录号：C9202）
电泳装置： Thermo Scientific Power Supply 400 mA 300 V（Fisher，目录号：S65533Q）
NanoDrop ND-1000（ Thermo Fisher，目录号：2353-30-0010）
ChemiDocMP成像系统（ BioRad ，目录号：12003154 ）
Oxford nanopore MinION Mk1C 测序仪（Oxford Nanopore Technologies，目录号：MIN-101C）

软件

Minimap2 （ Lemos Duarte 等人，2021 年） ( https://github.com/lh3/minimap2 )
山姆工具（李，2018 ） ( https://www.htslib.org/ )
DeepTools ( Liao et al., 2014 ) （ https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html ）
库框架（这项工作）（ https://github.com/cestari-lab/Libframe-tool ）
子阅读（ Pointer 等人，2014 年） ( http://subread.sourceforge.net/featureCounts.html )
Circlize （拉米雷斯等人，2016 年） ( https://jokergoo.github.io/circlize/ )

程序

DNA 片段化和大小选择
准备三个 microtube-50 AFA 纤维螺帽小瓶，每个小瓶在 55 µL AFA 级水中含有 5 µg 基因组 DNA。在 7 °C 下，使用聚焦超声波发生器以 200 个周期、25 个峰值入射功率 (W) 和 10% 占空比对 3 秒进行超声处理，以获得 0.5–3 kb（平均基因范围）的片段。根据生物体基因组大小、碱基组成或 DNA 提取方法，可能需要优化此步骤（见注释 1）。
在 1.5 mL Eppendorf 管中将三个小瓶中的片段 DNA 合并为总共 165 μL，并在 1% 琼脂糖/TBE 凝胶中分析 30 μL，并使用 5 μL 的ecostain 。用 1 µg 非片段 DNA 加载一口井进行比较（可选）。在 90 V 下运行 30 分钟或凝胶长度的三分之二，并在 ChemiDocMP成像系统中可视化 DNA。片段化的 DNA 应迁移为 0.5 – 3 kb 之间的涂片，峰值强度为 1.5 kb（图 4A）。片段的峰值强度可能因片段化条件和基因组组成而异。
Bind ®选择DNA 以获得高于 500 bp 的片段 TotalPure NGS 微珠加入 135 µL 片段化 DNA（比例 0.7 × ，微珠体积：片段化 DNA 体积）。在室温下孵育 10 分钟，转速为 50 rpm（见注 2）。
快速旋转（大约 10 秒，850 × g ）含有磁珠和 DNA混合物的微量离心管，将管转移到磁架上，在室温下孵育，直到磁珠从溶液中分离出来（大约 1 分钟）。吸管并丢弃上清液。
在珠子上慢慢加入 200 μL 的 70% 乙醇，孵育 30 秒或直到珠子与溶液分离。收集并丢弃乙醇。重复此洗涤步骤两次。
在室温下将珠子和混合物风干 2 分钟。不要干燥到破裂珠子的程度。
向珠子中加入 55 μL 的洗脱缓冲液，轻弹试管轻轻混合，并在室温下孵育 1 分钟。
将 Eppendorf 管转移到磁架上，以将珠子与洗脱的 DNA 分离。将现在含有 DNA 的上清液收集到一个新的 1.5 mL 微管中。丢弃含有珠子的管子。
NanoDrop量化 DNA 浓度和纯度。大小选择应恢复 50% 至 70% 的 DNA。理想的 260/280 和 260/230 吸光度比分别为 1.8 和 2.0。
如步骤 A2 中所述，使用 5 μL 的ecostain分析 1% 琼脂糖/TBE 凝胶中回收的 5 μL 的 DNA，以验证大小选择和 DNA 恢复。

末端修复反应和接头连接
将 1 µg DNA（来自步骤 A8）添加到 0.2 mL 试管中，并与 10 µL NEBNext ®末端修复缓冲液 (10 × ) 和 5 µL 末端修复酶混合物混合。加水，最终体积为 100 μL。
在热循环仪中在 20°C 下孵育 60 分钟。
®清理末端修复的 DNA TotalPure NGS 微珠（比例为 0.7 × ，微珠体积：末端修复反应体积）。按照步骤A 3 到A 8 中所述的步骤操作。在 31 µL洗脱缓冲液中洗脱DNA 。
NanoDrop量化 DNA（1 µL 样品）。预期的 DNA 回收率约为 90%。
将剩余的 30 μL 末端修复 DNA （约 1 μg）添加到 0.2 mL 管中。在试管中加入 20 μL 的牛津纳米孔条形码适配器（来自连接测序试剂盒的 BCA 试剂）和 50 μL 的 2 × Blunt/TA 连接酶主混合物。轻轻吸管以混合反应。
在热循环器中在 25°C 下孵育 2 小时。
加入 70 µL Mag-Bind ®清理条形码接头连接的 DNA TotalPure NGS 珠子（比例为 0.7 × ，珠子体积：条形码适配器连接反应体积），如步骤A 3 至A 8 所述。在 31 µL洗脱缓冲液中洗脱DNA 。
NanoDrop量化 DNA 。预期的 DNA 回收率约为输入材料的 90%（步骤 B5）。

引物设计和文库扩增
此步骤描述了通过 PCR 设计引物和片段扩增，以便使用 Gibson 组装将文库克隆到表达载体中。图 2 显示了该步骤中使用的引物序列和pYD1 质粒图。引物应与步骤 B5 中与文库片段连接的条形码接头退火（图2A，序列由As表示），并具有与表达载体互补的突出端（序列由Xs表示）。
每个引物悬垂序列应为 ±20 bp，引物熔解温度应约为 50°C。如果需要，在引物中添加限制酶位点以重构质粒中的任何限制位点。如果未在底漆中重组（图 2A），用于线性化载体的限制性位点将丢失。

图 2。 Gibson 装配引物的设计。
(A) 用于 Gibson 组装的正向和反向引物方案。 (B) Bam HI 消化的 pYD1 载体、条形码适配器连接片段（DNA 片段）和引物的示意图。 (C) 正向 (For) 和反向 (Rev) 引物，用于放大 Gibson 组装的条形码适配器连接片段（参见 B 中的配对区域）。橙色序列对应于与 pYD1 向量互补的 ~20 bp 向量序列，黑色字母是Bam HI 限制性位点，~20 bp 纳米孔条形码接头退火序列为绿色。 F 和 R：分别与克隆位点两侧的载体配对的正向和反向引物，用于通过 PCR 扩增克隆片段以进行克隆验证或测序。

使用条形码接头连接的片段 DNA 作为模板制备六个 PCR 反应，如下所示：10 µL ThermoPol缓冲液 5 × 、200 µM dNTP、500 nM引物混合物（正向和反向引物的混合物）和 1.25 单位的 Taq DNA聚合酶。添加条形码适配器结扎的 DNA (20 ng) 并用水将最终体积调整为 50 μL。放大热循环器中的反应，在 95°C 下初始变性 30 秒，然后在 95°C 下 30 秒、49°C 下 30 秒和 68°C 下 14 个循环 3 分钟。在 68 °C 下添加 5 分钟的最终延伸，并将反应储存在 4 °C （见注 3）。
®纯化扩增子 TotalPure NGS 微珠加入 300 µL 反应液（比例为 0.7 ×微珠体积：末端修复反应体积）。按照步骤A 3 –A 8 中描述的程序进行操作。在 31 µL洗脱缓冲液中洗脱DNA 。
NanoDrop量化 DNA 。预期的 DNA 回收率约为 80 – 140 ng/µL。

线性化向量
×反应缓冲液 r3.1、2 μL（20 单位）的Bam HI 限制酶和水至 30 μL 的最终体积，消化 4 μg 的 pYD1 载体 DNA 。在 37°C 下孵育 16 小时。
注意：不要使载体去磷酸化，因为它会干扰 Gibson 组装反应（见注 4）。
Mag -Bind ®纯化线性化 DNA TotalPure NGS 微珠（0.5 ×比例，微珠体积：消化反应体积）。按照步骤A 3 到A 8中所述的程序进行。在 31 µL 洗脱缓冲液中洗脱 DNA。
NanoDrop量化 DNA 。预期的 DNA 回收率约为 90%。

吉布森组装反应和效率评估
将 10 μL 的NEBuilder HiFi DNA 组装主混合物添加到 0.2 mL 管中。然后将 50 ng (16 fmol ) 的消化载体（来自步骤 D3）、30 ng（32 fmol ）的扩增片段（来自步骤 C3）和水添加到总共 20 µL 的反应体系中。所示浓度导致载体：PCR片段的比例为 1:2。
在 50°C 的热循环仪中孵育吉布森组装反应 1 小时。
将 1 μL的 Gibson 组装反应与 50 μL的合格 NEB 5-alpha F'Iq 混合在冰冷的 15 mL Falcon 管中，在冰中解冻的大肠杆菌细胞。在冰上孵育 30 分钟。我们建议使用 100 pg pUC19 和 50 µL 感受态细胞进行额外的转化，以估计感受态细胞的效率，并使用 50 ng pYD1 载体作为不插入片段的对照（用于步骤 E9）。见注 6 和 7。
将混合物在 42°C 下孵育 30 秒，立即转移到冰上，孵育 2 分钟。
加入 950 μL 的 SOB 培养基，在 37°C 下孵育，摇动 1 小时。
将 500 μL 的转化细胞放入 150 × 15 mm 培养皿中，其中含有 LB 培养基，琼脂和氨苄青霉素在 50 μg/mL 时用于质粒选择。对于 pUC19 转化细胞，进行连续稀释（1：10、1：100 和 1：1，000），并将 500 μL 板放入培养皿中。
在 37°C 下孵育过夜。
量化通过转换获得的菌落数，以估计库组装所需的 Gibson 组装反应和转换的数量。使用 pUC19 转换来估计感受态细胞的效率。对于使用效率为 10 9 CFU/µg pUC19 DNA的感受态细胞进行吉布森反应转化，预计每板总共有 4,000–6,000 个菌落。见附注 8。
要检查 Gibson 组装的效率，请从菌落 PCR 的转化中选择 10-20个菌落，以使用与载体配对的引物和库片段两侧的引物来放大克隆片段（图 2B和2C，引物 F 和 R）。在 0.2 mL 管中，使用 4 μL 的ThermoPol缓冲液 5 × 、200 μM dNTP、500 nM引物混合物（正向和反向）和 1.25 个单位的 Taq DNA 聚合酶在 20 μL 中制备 22 个 PCR 反应。我们建议准备一个主 PCR 反应混合物，然后将反应分成 21 管。选择一个带有 10 μL 移液器尖端的菌落，并将菌落与 PCR 管中的反应混合。用 pYD1 转化（无文库）细菌的菌落制备一个反应作为对照。放大反应，在 95°C 下初始变性 2 分钟，然后在 95°C 下 35 次循环 30 秒，54°C 下 30 秒，68°C 下 3 分钟。在 68°C 下添加 5 分钟的最终延伸，并将反应储存在 4°C。
将 20 μL 反应加载到 1% 琼脂糖/TBE 凝胶和 5 μL ecostain中，以分析扩增的 DNA。扩增子应显示为单个条带，其大小在所选片段的范围内 (0.5 – 3 kb)。预计组装效率会高于 90%，即 20 个菌落中有 18 个阳性菌落。否则，优化 Gibson 组装反应（步骤 E1，见注 9）。
要检查克隆的片段是否来自所需的生物基因组，请从转化为 15 mL 细胞培养管中挑选 10 个菌落，其中含有 2 mL LB 培养基和50 μg/mL 氨苄青霉素抗生素用于质粒选择。在 37 °C 下孵育，以 225 rpm 的速度摇动 18 – 24 小时。
使用小型制备试剂盒将质粒从菌落中分离出来，并使用与载体配对的引物和库序列侧翼进行 Sanger 测序（图 2C，引物 F 和 R）。
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ) 对生物体基因组或国家生物技术信息中心的非冗余数据库进行序列比对。序列应与用于初始 DNA 片段化的生物体基因组序列对齐。

计算库大小和大规模转换
使用 Carbon 和 Clarke 方程以 99% 的概率 (P) 计算要在库中表示的每个基因组序列所需的克隆片段数 (N)：

N=ln⁡(1-P)/ln(1-F) , where F=i/g

F 是插入片段大小 ( i ) 与基因组大小 (g) 之间的商，以 bp 为单位。我们建议将最终值乘以 6，以增加片段与来自表达系统的蛋白质（例如 pYD1 载体中的 Aga2p）框内克隆的机会。
将计算出的所需片段数 (N) 除以在步骤 E8 中获得的菌落数，以估计所需的转换数和 Gibson 组装数。一次 Gibson 组装反应产生 20 个转化并产生 40 个转化板。对于 44 Mb 单倍体基因组（例如，原生动物克氏锥虫 Sylvio X10/1 菌株单倍体基因组）和 1.5 kb 平均大小的最小计算片段数的 6 倍，预计将收获约 811,000 个菌落。因此，有 203 个平板，每个平板有 4,000 个菌落，大约有 5 个 Gibson 组装反应。
如步骤 E3-E7 中所述转换 Gibson 装配组合，以实现计算片段的数量。如果组装效率等于 100%，则将每个菌落视为一个克隆片段。

质粒 DNA的提取
从盘子上刮下所有菌落，并将它们组合在 50 mL Falcon 管中。使用含有 50 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基将体积调整到 50 mL。如果不立即提取 DNA，请将悬浮液在 4°C 下最多保存一周。
用 50 μg/mL 的氨苄青霉素稀释 LB 中的培养物，以获得 1 到 2 之间的 OD。在 37°C 下孵育 3 小时以进行细胞恢复。
NucleoBond ®分离质粒 DNA Xtra maxi plus EF 根据制造商的说明。
NanoDrop上的质粒 DNA 。预期的 DNA 产量应约为0.5 –2 mg。
通过将 DNA 与 3 µL 10 ×混合来消化 2 µg 质粒 DNA NEBuffer TM r3.1 和 0.5 µL Bam HI（5 个单位），最终反应体积为 30 µL 。在 37°C 下孵育 2-18 小时。也可以使用切割多克隆位点的其他限制酶，例如Hind III和Xho I。
将 30 μL 反应加载到 1% 琼脂糖/TBE 凝胶和 5 μL ecostain中，以分析消化的 DNA。凝胶应显示 5 kb 带（消化 pYD1）和 500 至 3,000 bp（消化库片段）之间的涂片，峰值约为 1.5 kb（图 4A）。

牛津纳米孔 DNA 测序文库的制备
准备六个 PCR 反应，每个反应包含 20 ng 质粒、10 µL ThermoPol缓冲液 5 × 、200 µM dNTP、400 nM条形码引物（包含在 Oxford Nanopore 的 Native Barcoding Expansion 1-12 中）、1.25 单位 Taq DNA 聚合酶、和 50 µL 最终反应体积的水。在热循环仪中运行 PCR 反应，在 95°C 下初始变性 30 秒，然后在 95°C 下 30 秒、60°C 下 30 秒和 68°C 下 16 个循环 3 分钟。在 68°C 下添加 5 分钟的最终延伸，并将反应储存在 4°C。
混合 PCR 反应以获得总共 300 μL 的反应。添加 210 µL Mag-Bind ® TotalPure NGS 微珠（0.7 ×比率，微珠体积：PCR反应体积）并根据步骤 A3 至 A8 中描述的步骤纯化 DNA。在 61 μL 的洗脱缓冲液中洗脱 DNA。
NanoDrop量化 DNA 。预期产量约为 30 – 60 ng/µL。
将 1 µg DNA 添加到 0.2 mL 管中，并与 3.5 µL NEBNext ®末端修复缓冲液和 3 µL NEBNext末端修复酶混合物、3.5 µL NEBNext ® FFPE DNA 修复缓冲液、3 µL NEBNext ® FFPE DNA 修复混合物混合和 1 µL（约 10 ng）的 CS DNA（对照 DNA，~3 kb 噬菌体 λ DNA 片段）。加水，最终体积为 100 μL。
在热循环仪中在 20°C 下孵育 60 分钟。
®清理末端修复的 DNA TotalPure NGS 珠子的比例为 0.7 × （珠子体积：末端修复反应体积），加入 70 µL 珠子，然后按照步骤 A3 至 A8。在 61 μL 的洗脱缓冲液中洗脱 DNA。
NanoDrop量化 DNA 。预期的 DNA 回收率约为 90%。
将 60 µL 体积的末端修复 DNA（0.5–1 µg）添加到 0.2 mL 管中，然后与 25 µL 牛津纳米孔连接缓冲液（LNB）、10 µL NEBNext Quick T4 DNA 连接酶和 5 µL 适配器混合mix (AMX )（ LNB 和 AMX 是 Oxford Nanopore 的 Ligation 测序试剂盒中包含的试剂）。通过小心地上下移液来混合。
在 20°C 的热循环仪中孵育 2 小时。
添加 40 µL Mag-Bind ® TotalPure NGS beads to the ligation reaction ( 0.4 × ratio, beads volume:ligation reaction volume ) .在室温下旋转混合 10 分钟。
快速旋转样品 10 秒，并在室温下在磁性支架上孵育 2 分钟，将珠子与溶液分离。取出并丢弃上清液。
添加 250 μL 的短碎片缓冲液，然后轻弹管子轻轻混合。
重复步骤H11 和 H12。然后，如步骤 H11 中所述，将珠子从溶液中分离出来。在室温下将珠子晾干 30 秒。不要过度干燥。
添加 12 μL 的牛津纳米孔洗脱缓冲液。预计产量约为 10 – 40 ng/µL，即 200 – 1,500 fmol DNA。 5 到 55 fmol的 DNA 用于测序。见注 5。
根据制造商的说明，将准备好的库的5–55 fmol加载到流动单元 (R9.4.1) 中。按照制造商的说明对 DNA 进行排序。

数据分析

测序文库的计算分析
这些分析中使用的数据保存在序列读取档案 (SRA) 中， BioProject编号为 PRJNA851089。
MinION Mk1C 设备的Minknow软件创建了总结纳米孔测序结果的测序报告文件。 .txt 摘要文件可用于提取有关序列质量、读取长度和条形码的信息。序列以 fast5 格式生成，然后在测序期间或之后使用 Guppy 工具通过MinION设备进行碱基调用。对于我们的实验，我们选择通过MinION进行高精度碱基调用，生成fastq文件。以下步骤描述了使用fastq作为管道中的输入文件进行数据分析的工具和脚本。我们还描述了用于计算基因组映射、可视化映射读取以及使用我们开发的Libframe工具预测库产生的肽的脚本。有关这些步骤的示意图和结果说明，请参见图 3 和图 4。
注意：在运行脚本之前，请检查可用的计算资源，即内存和处理器。我们建议通过 Bash 脚本连接到服务器并提交作业。作业所需的资源将根据文件的数量和大小以及使用的工具而有所不同。下面的脚本是在 Windows Subsystem for Linux 中使用 Linux Ubuntu 提交的。为简单起见，给出了通用文件名，例如，参考基因组的“ GenomeOfReference.fasta ”或映射输出文件的“reads-map_v1.sam”。

图 3 计算分析步骤流程图

解压缩fastq文件并使用 minimap2 将读取映射到基因组。可以更改映射条件以改进对基因组的数据映射。请参阅 minimap2 手册 ( https://github.com/lh3/minimap2 )。
#映射前必须使用bash命令解压*.fasta.tar.gz格式的文件
柏油 xvzf yourdata.fastq.tar.gz -C路径目录

#此脚本将从 ONT 测序获得的读数与参考基因组对齐，创建一个 .山姆文件。
模块加载 minimap2 / 2 。 24

minimap2 - ax map- ont - k11 - m30 - w7 - I4G - t16 - 2 GenomeOfReference.fasta \

/~/数据/ fastq /*.快q.gz \

>/~/数据/分析/读取-map_v1.sam

获取映射统计信息并转换 . sam文件到 .bam 文件。然后，对 .bam 文件进行排序和索引。映射读数的比例将根据参考基因组的数据质量和组装而变化。
#Samtools 命令从读取映射中提取统计信息，并将创建 bam 二进制文件以供进一步处理。

模块加载samtools

工具旗帜统计 /~/data/analysis/reads-map_v1.sam > _ _ _ _ _ /~/data/analysis/reads-map_v1-flagstat.txt _ _ _ _ _

samtools stat /~/ data / analysis / reads-map_v1.sam > /~/data/analysis/reads-map_v1-stat_lib.txt _ _ _ _ _

samtools view -S -b /~/data/analysis/reads-map_v1.sam > _ _ _ /~/data/analysis/reads-map_v1.bam _ _ _ _ _

samtools排序/~ /数据/分析/reads-map_v1.bam > //~/数据/分析/读取-map_v1_sorted.bam

samtools索引/~ /数据/分析/reads-map_v1_sorted.bam > //~/数据/分析/读取-map_v1_sorted.bam.bai

执行覆盖率分析以确定基因组的读取覆盖率分布。然后，执行读取计数以确定每个基因映射的读取数。
使用DeepTools模块进行进一步分析并生成可视化效果。
模块加载python / 3 。 8 . 2
#对于这些步骤，创建了一个虚拟环境
来源~/ ENV / bin / activate

#plotCoverage 生成一个曲线图，描述每个碱基的读数和基因组的平均覆盖率。
plotCoverage -b /~/ data / analysis / reads-map_v1_sorted.bam --标签 reads-map_v1 -- plotFileFormat pdf -- outRawCounts Reads-V1_Lib.txt -- numberOfProcessors 8

读取计数分析所需的包（包子读取）。读取计数用于量化每个基因的读取次数。

模块加载gcc / 7 。 3 . 0
模块加载StdEnv / 2020
模块加载子读/ 2 。 0 。 3

#featureCounts 计算基因、外显子、启动子等基因组特征的映射读数。下面的脚本将生成每个外显子的读数计数。
特征计数 - LMO -a GenomeOfReference.gtf -o reads-map_v1_counts.txt - F "exon" -g " gene_id " -s 0 - T4 reads-map_v1_sorted.bam

处理数据以可视化文库覆盖率并分析基因组区域的潜在偏差。
#bamCoverage 通过对读取进行标准化和分箱来生成覆盖轨道，生成 *. bw文件。该文件可以在基因组可视化工具（例如，集成的基因组查看器，例如https://igv.org/app/ ）中进行分析，以进行视觉验证并检查文库覆盖率中的潜在偏差。
bamCoverage -b reads-map_v1_sorted.bam -o reads-map_v1.bw -- binSize 50 -- normalizeUsing RPKM -- extendReads 1000 -- outFileFormat bigwig -- numberOfProcessors 10

#computeMatrix 为每个区域创建一个分数矩阵，作为将数据可视化为热图所需的中间体。
computeMatrix scale-regions -b 500 -a 500 - m 3000 -R GenomeOfReference.gtf -S reads-map_v1.bw -- skipZeros -- sortRegions no -- transcriptID 'exon' -o matrix_reads-map_v1-sr1.gz

#plotHeatmap 使用来自computeMatrix的矩阵文件生成热图以可视化基因覆盖率。
plotHeatmap -m matrix_reads-map_v1-sr1.gz -- outFileName reads-map_v1_heatmap.png -- colorMap RdBu -- whatToShow 'heatmap and colorbar ' -- zMin -4 -- zMax 4

使用圆形图生成图表以可视化基因组上的读取覆盖率。此步骤需要加载 Linux 中安装的 R。相同的脚本可用于 RStudio for Windows 中的分析。
#Circlize 包用于生成基因组覆盖率的循环可视化。首先，加载 R。
模块负载

#发起R
R

#安装需要的包
install.packages （ “ circlize ” ）

#加载必要的库
库（ dplyr ）
图书馆（圈出）

#从plotCoverage输出文件中读取数据（每个碱基读取）
Lib_Cov.df = read.table ( 'Reads-V1_Lib.txt' , sep = "\t" )

#根据阅读次数对表格进行排序
Lib_Cov.ordered <- Lib_Cov.df [顺序（ Lib_Cov.df $ V4 ）， ]

#Filter 数据框只包含来自完整染色体的读数。对于部分测序或部分组装的参考基因组，这是一个有用的步骤。
Lib_Cov.chrom 文件 <- dplyr ::过滤器( Lib_Cov.ordered , grepl ( 'CHR' , V1 )) %>%
#Converting the scale to log2 以改善可视化（可选）
dplyr ::变异（ V4 = log2 （ V4 ）） %>%
# 将所有在对数转换过程中变成-inf 的单元格转换为NA。
dplyr :: mutate_if ( is.numeric ,列表(~ na_if ( ., - Inf )))

#生成圆图
#This第一行初始化圆形图
circos.initializeWithIdeogram ( Lib_Cov.chrom , plotType = NULL , circos.par ( gap.degree = 8 ））

染色体轨迹的最外环
轨道( ylim = c ( 0 , 1 ) ,面板.fun = 函数( x, y ) {
chr = CELL_TARGET $扇区索引 #使用染色体名称作为标签
xlim = CELL_GOAL $ xlim
依林 = CELL_META $ ylim
circos.rect ( xlim [ 1 ] , 0 , xlim [ 2 ] , 1 , col = “浅蓝” ） #改变染色体矩形的颜色
circos.text ( mean ( xlim ) , mean ( ylim ) , chr, cex = 1.5 ,科尔 = “白” ，
面对= " bending.inside " , niceFacing = 真） #Changes 文本的颜色及其在矩形内的方向。
} ,轨道高度 = 0.15 ,背景边框 = 不适用）

#This chunk 添加计数轨道
circos.genomicTrack ( Lib_Cov.chrom ,
面板.fun = 功能（区域，价值，... ） {
circos.genomicPoints （区域、值、类型= “段” ， lwd = 2 、
山口 = “洋红色” ， cex = 0.5 , ... )
circos.yaxis （ “正确” ， labels.cex = 0.4 ,科尔 = “灰色” ， labels.col = “深灰色” ）
})
#这会在圆圈中间添加一个文本
text ( 0 , 0 , "Genome\ ncoverage " , cex = 1.5 )

确定文库中与表达系统中的蛋白质（例如，pYD1 中的 Aga2p-Xpress）框内序列的比例，并计算其预测的肽长度和氨基酸序列。
笔记：此步骤中使用的Libframe工具是用 Python 开发的，用于 pYD1。如果使用不同的表达系统，可以修改代码以将 Xpress 标签序列替换为任何应与克隆片段在框架内的序列。该代码可在https://github.com/cestari-lab/Libframe-tool获得。

#libframe脚本在reads中找到 Xpress 标签序列，并在框架内翻译库核苷酸序列与 Xpress 标签，直到找到终止密码子。

#加载python并激活环境
模块加载 python/3.8.2
来源 ~/ENV/bin/activate

#安装biopython
点安装biopython

#将*.fasta.gz文件解压成*. fasta文件并连接所有多个 FASTA 文件。
枪弹 *。快q.gz
猫 *。快速 > 新文件名.fastq

#执行库框架。它将输出一个包含肽段长度和序列的文本文件。它需要三个命令：1）输入fastq文件； 2) 输出文件的名称 (.txt)； 3) 肽的最小长度。 Xpress 标签有 8 个 aa（24 个碱基），加上接头（6 个碱基，2 个 aa）和限制性位点（Bam HI，6 个碱基，2 个 aa），产生 12 个 aa 序列 DLYDDDDKVPGS。因此，我们建议肽的最小值为 13。

蟒蛇3 ./libframe.py路径/到/ fastq / file /。 fastq路径/到/输出/文件/。文本 13

#结果示例：
#蛋白质长度为 127 aa，序列为：DLYDDDDKVPGSTSHAPGRHGGRRIRLELHLDNFKLLPQLCSSVSADGSPAVPLQPVLPGIRQMLHHSVSIKCADARVARFLWPCPYALHCALLSITSEFAAACGSTIWISVVEFCEISSTVAAARV
#蛋白质长度为16 aa，序列为：DLYDDDDKVPGSLCWC
#蛋白质长度为 75 aa，序列为：DLYDDDDKVPGSFLLVLILRRLLGCLTLIRAERHNRPQQGFVRRTAGVFHPSVATKSTCVFHFCISMYGRICGLL
#蛋白质长度为25 aa，序列为：DLYDDDDKVPGSFVGADIAGDRAGK
#蛋白质长度为73 aa，序列为：DLYDDDDKVPGSFLLVLILRRLHGCLTLCLRVHTLDTKQPEYPLLGGISRAPAHKGAALGGSFSSGCLHAEEV

预期结果
该协议首先使用Covaris M220 对基因组 DNA进行超声处理，以获得大约 0.5到3 kb 之间的 DNA 片段。根据所使用的基因组或超声仪，可能需要优化超声处理条件。我们在 1% 琼脂糖/TBE 凝胶上分析了超声处理的基因组 DNA，以确认 DNA 以预期的长度片段化。我们的破碎条件导致了 92% 的T. cruzi 基因组片段范围在 401 bp 和 2,000 bp 之间（图 4A 和 4C）。然后，我们使用磁珠来选择大于 500 bp 的片段（图 4A 和 B）。如果使用其他品牌的磁珠，我们建议查看制造商的尺寸选择说明。所选大小的 DNA 应迁移为类似于1% 琼脂糖/TBE 凝胶上的超声范围（图 4A）的涂片。
对于文库制备步骤，我们发现 DNA 片段的末端修复和 A 加尾极大地改善了后续连接，即使 PCR 是使用 A 尾 DNA 的 DNA 聚合酶进行的。在每个文库制备步骤（例如，DNA 末端修复、A 加尾、接头连接、PCR 反应或向量线性化）之后，用磁珠清理 DNA，并使用NanoDrop对回收的 DNA 进行定量。理想的 260/280 和 260/230 比率分别为 1.8 和 2.0。这些值的微小变化（大约 10%）在测定中得到了很好的耐受。更大的变化表明可能影响后续反应的潜在污染物，尤其是吉布森组件。我们发现使用磁珠纯化的 DNA 比使用硅胶柱和离液缓冲液纯化的 DNA 具有更高的 Gibson 组装反应效率。为了提高 DNA 纯度，我们建议使用等于反应体积加上珠子体积的乙醇体积进行 DNA珠子洗涤，确保从珠子中提取所有乙醇并在洗脱前风干 DNA。
在放大 Gibson 反应之前，我们建议检查组装效率。我们对大约 20 个转化菌落进行 PCR 反应，并在 1% 琼脂糖/TBE 凝胶上分析扩增子。如果至少 90% 的菌落显示扩增子在预期大小范围内迁移（DNA 片段大小），则仅继续扩大文库转化。我们经常在 Gibson 组装反应中获得 100% 的效率。为了解决 Gibson 组装效率问题，我们建议使用不同比例的 DNA 片段与载体进行连接，例如 1:2、1:4、1:6 和 1:8（载体：DNA片段）。我们的大多数库在 1:2 到 1:4 的比例下运行良好。在扩大文库转化以确保文库包含来自所需生物体的序列之前，Sanger 对一些文库克隆进行测序也很重要。
扩大文库转化后，刮取所有菌落并合并，提取质粒。为了确保片段被克隆，我们进行了质粒 DNA 消化以释放克隆的片段。图 4 显示了我们在 pYD1 载体中的T. cruzi全基因组文库的结果。该文库在 1% 琼脂糖/TBE 凝胶上进行了分析，显示出 5 kb 的 DNA 条带，表明消化的 pYD1 和约 1.5 kb 的涂片，表明消化的文库片段（图 4A）。
我们的方法专为 Oxford 纳米孔测序而设计，因为它会产生覆盖克隆片段整个序列的长读数；然而，该协议可以适用于其他测序技术。用于分析的测序数据的范围取决于基因组和文库的大小。 T. cruzi _ Sylvio X10/1 菌株具有 44 Mb 的单倍体基因组。我们的图书馆包括四百万个基因组片段，估计平均长度为 1.5 kb，导致基因组的 30 倍。在图 4 中的示例中，我们获得了大约 8.7 Gb 的 DNA 测序，产生了大约 820 万次读取和 147倍的基因组覆盖率（图 4D 和 4E），这足以进行数据分析。在文库测序和 reads 与基因组比对之后，我们通常使用 minimap2 获得 85%–99% 的基因组映射。然而，基因组映射的百分比将根据参考基因组组装的质量而变化。如果参考基因组组装不当，我们建议检查每个染色体或重叠群的映射。我们使用圆形图验证了克隆片段中的任何潜在偏差或可能缺少序列，以可视化映射到基因组的读数（图 4D）。为了进行详细分析，我们使用了基因组浏览器（例如，集成基因组浏览器）。我们注意到大量读取映射到大基因家族的重复区域，例如克氏锥虫中的粘蛋白或粘蛋白相关基因 (图 4D), 这很可能反映了这些地区基因组组装的质量，而不是图书馆克隆的偏见。我们发现所有参考基因组序列都存在于文库中。我们使用DeepTools进行了绘图热图分析，并确认所有基因序列都被文库读取覆盖（图 4F）。计算每个外显子的读取次数（ featureCounts ，包子读取）也可能有助于确定基因在文库中的丰富程度。
为了评估我们的文库生成的潜在肽，我们开发了一种工具，该工具使用纳米孔读数（ fastq格式）并使用表达系统搜索框架内的序列，例如 pYD1 载体中的 Aga2p 和 Xpress 标签。 Libframe工具预测文库氨基酸序列并使用可用的纳米孔数据计算它们的长度。使用我们的数据集，我们发现大约 90% 的预测肽的长度在 21 到 160 个氨基酸 (aa) 之间（图 4G）。 aa 长度反映了文库片段的大小和过早终止密码子的存在。在基因组文库中，并非所有 DNA 序列都来自编码基因，片段可以以多个框架和方向克隆。因此，重要的是生成至少是基因组 6 倍的文库，以确保包含所有编码序列（例如， T. cruzi 库有 400 万个片段序列和 30 倍的基因组）。
总的来说，我们的协议详细介绍了一种分步方法，可以有效地将全基因组文库组装成表达载体，用于蛋白质-配体相互作用研究。

图 4.克氏锥虫分析用于酵母表面展示的全基因组文库。
Covaris M220对基因组 DNA 进行超声处理。 DNA 在 1% 琼脂糖/TBE 凝胶中分离。 S1：入射功率 25，占空比 2，每脉冲 200 个周期，持续 20 s； S2：入射功率为 10，占空比为 2，每脉冲 700 次循环，持续 30 秒。中间，1% 琼脂糖/TBE 的超声处理基因组 DNA 大小使用磁珠选择以获得高于 500 bp (S) 的片段。对， T. cruzi 克隆到未消化 (U) 或用Hind III 和Xho I 限制酶消化 (D1 和 D2) 的 pYD1 载体中的文库。 D1：1.0 µg DNA； D2：1.5 µg DNA。 (B) 含有 100 μL 超声 DNA 样品和磁珠 (0.7 × ) 的微离心管的图像，在珠子分离之前（混合）和在磁架中分离后（磁化）。显示了前视图和侧视图。 (C) 片段序列长度分析。数据来自牛津纳米孔测序摘要文件。 (D)使用Circlize R 包创建的Circlize图显示了基因组的读取覆盖率。外面的绿色轨迹代表染色体；内部橙色点表示映射读取。下面是使用集成基因组浏览器可视化的 5 号染色体（Chr 5）的快照。绿色图显示读取覆盖率，下面的黑条表示基因。还显示了 Chr 5 的 100 kb 片段（上图）。 (E) 使用plotCoverage函数 ( DeepTools ) 的文库覆盖率分析，描述映射后每个基因组部分的读取覆盖率。 (F) 由computeMatrix和plotHeatmap函数生成的每个基因的读取热图。所有基因的大小都调整为相同的长度。显示了从开始 (S) 到基因结束 (E) 的 0.5 kb。 (G)预测的文库蛋白质与来自表达系统的蛋白质，即Aga2p和Xpress标签的框内分布。使用Libframe工具分析数据。

笔记

如果使用标准探头超声仪，我们建议从 50% 频率、1,000 J 和 5 秒的三个脉冲开始优化超声条件，脉冲之间有 15 秒的休息时间。在冰中执行该程序。
用户应参考 Omega Bio-Tek “协议和资源”部分，根据俄勒冈大学基因组学和细胞表征核心设施协议 ( Weitzman, 2018 )在大小选择过程中选择珠子的比例。
我们建议首先进行 35 个循环的 PCR 反应并在琼脂糖凝胶中分析扩增子以检查扩增效率。它应该导致从 0.5 到 3 kb 的涂片（图 4A）。如有必要，执行梯度 PCR 以优化退火温度。如果没有观察到扩增子，检查末端修复或接头连接反应是否失败，并重复 B 部分。一旦确认扩增，继续进行多个 14 循环 PCR 扩增反应，这应该提供足够的 DNA 来执行后续步骤协议。 PCR 循环的数量应保持在 14 到 16 之间，以防止由于所选序列的 PCR 扩增或 PCR 伪影的引入而导致库中的偏差。
我们建议在文库组装前通过琼脂糖凝胶电泳检查质粒是否完全消化。可以使用硅胶柱从琼脂糖凝胶中纯化限制酶消化的质粒；但是，在组装 Gibson 之前，应始终使用磁珠清洁它们。我们观察到，使用离液缓冲液的二氧化硅基 DNA 纯化方法中常见的杂质会降低 Gibson 组件的效率。
fmol的计算基于 1.5 kb 的平均片段大小。
使用低温方法（ Ueda 和 Tanaka，2000 年）获得具有化学活性的大肠杆菌培养物。我们使用 NEB ® 5-alpha F'Iq 用于制备感受态细胞的大肠杆菌菌株。效率应为 1 × 10 9 –5 × 10 9 CFU/µg pUC19 质粒 DNA。
10 CFU/ μg pUC19 DNA）产生高效转化。然而，吉布森组装反应的电穿孔会导致效率低于化学转化。我们注意到 Gibson 反应成分会干扰电穿孔。因此，我们建议使用化学转化。我们也不建议使用超过 1 µL 的 Gibson 组装反应进行化学转化。
转化效率 (TE) 计算如下：

TE (CFU/(μg of DNA))= (NT *VT (μl))/(DNA (μg)*VCP (μl))*DF

而CFU是菌落形成单位， NT是转化子的数量， VT ( µL ) 是以 µL 为单位的转化体积， DNA ( µg ) 是以µg 为单位添加到细胞中的DNA量， VCP ( µL ) 是体积µL 中电镀的细胞数量，DF 是电镀中的细胞稀释因子。
质量差的 DNA 会影响 Gibson 组装反应。确保 260/280 和 260/230 比率在推荐范围内。为了解决 Gibson 组装效率问题，我们建议使用不同的片段与载体比例进行连接，例如 1:2、1:4、1:6 和 1:8（载体：DNA片段）。

食谱

含有琼脂和氨苄青霉素的 Luria-Bertani (LB) 培养基
Bacto-胰蛋白胨、5 g Bacto-酵母提取物和 5 g NaCl混合制备 LB 肉汤；稀释至 900 mL 蒸馏水。
用 1 N NaOH 或 1 N HCl 调节至 pH 7.25 根据需要，然后加入蒸馏水至最终体积为 1 L。
在 LB 肉汤中加入 15 g Bacto琼脂并立即高压灭菌。
等待冷却至大约40-50 °C ，然后加入 1 mL 氨苄青霉素原液（100 mg/mL）。然后，将 40 mL 倒入150 mm × 15 mm 培养皿中。
将培养皿在 4 °C 下最多保存一个月。
氨苄青霉素原液 (100 mg/mL) (50 mL)
在 45 mL 蒸馏水中溶解 5 g 氨苄青霉素。用蒸馏水将体积调整至 50 mL。
使用 0.2 µm 注射器过滤器进行过滤。准备 1 mL 等分试样并将其保持在 -20 °C。
Tris-硼酸盐-EDTA 缓冲液 (10 L)
通过将 1 L 10 × TBE 储备溶液（见下文）与 9 L 蒸馏水混合至最终体积为 10 L 来制备 TBE 缓冲液。
10 × TBE 原液 (1 L)
通过将 108 克Trizma碱、55 克硼酸和 8.2 克 EDTA 混合到 800 毫升蒸馏水中来制备 TBE 溶液。
用 1 N NaOH 或 1 N HCl调节至 pH 8.3 根据需要。
加入蒸馏水至最终体积为 1 L。
使用 0.2 µm 注射器过滤器进行过滤。
保持在室温下。
SOB 培养基（1 升）
通过混合 5 克 NaCl、20 克胰蛋白胨、5 克酵母提取物和 2.5 毫升 1 M KCl制备 SOB 培养基，并稀释至 800 毫升蒸馏水。
加入蒸馏水至最终体积为 1 L。
立即高压灭菌。
保持在 4 °C 长达六个月。
井上溶液 (1 L)
86.62 mM MnCl 2 、19.82 mM CaCl 2 、250.84 mM KCl 、10 mM PIPES 缓冲液
通过混合 10.9 g MnCl 2、2.2 g CaCl 2、18.7 g KCl和20 mL 0.5 M piperazine-1,2-bis [2-ethanesulfonic acid] (PIPES) 缓冲液（见下文）制备井上溶液。将MilliQ水添加至 1 L 的最终体积，并使用 0.2 µm 过滤器进行过滤消毒。
0.5 M PIPES 缓冲液（100 mL）
将 15.1 克 PIPES 溶解在 80 mL 的MilliQ水中，将 KOH 颗粒倒入，直到溶液清除。用 1 N KOH 或 1 N HCl 将 pH 值调节至 6.7。
将MilliQ水添加至100 mL的最终体积并分装在 10 mL 管中。储存在-20°C。
70% 乙醇
将 100 mL 的MilliQ水与 368 mL 的乙醇（95%）混合。
通过将MilliQ水添加到 500 mL 的最终体积来调整体积。保持在 4 °C。

致谢

这项工作由加拿大卫生研究院（CIHR PJT-175222，至 IC）、加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC RGPIN-2019-05271，至 IC）、加拿大创新基金会（JELF 258389）资助, 到 IC), 以及麦吉尔大学 (130251, 到 IC)。我们感谢 Andressa Lira 和 Sahil Sanghi在这项工作的早期阶段提供的技术支持。这项研究部分得益于 Calcul Quebec ( https://www.calculquebec.ca/en / ) 和 Compute Canada ( www.computecanada.ca ) 提供的计算资源。

利益争夺

作者声明与本文内容无利益冲突。

参考

Bharucha , N. 和 Kumar, A. (2007)。酵母基因组学和药物靶点鉴定。 Comb Chem 高通量筛选10(8)：618-634。
Bidlingmaier , S. 和 Liu, B. (2011)。酵母表面展示的 cDNA 文库的构建。方法 Mol Biol 729：199-210。
Bidlingmaier , S. 和 Liu, B. (2011)。酵母表面展示的 cDNA 文库的构建。方法 Mol Biol 729：199-210。
Boder , ET 和Wittrup , KD (1997)。用于筛选组合多肽文库的酵母表面展示。国家生物技术15(6)：553-557 。
Danecek , P., Bonfield , JK, Liddle, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, MO, Whitwham , A., Keane, T., McCarthy, SA, Davies, RM, 等。（2021 年）。 SAMtools 和 BCFtools 十二年。 Gigascience 10(2)。
Gibson, DG, Young, L., Chuang, RY, Venter, JC, Hutchison, CA, 3rd 和 Smith, HO (2009)。高达数百千碱基的 DNA 分子的酶促组装。 Nat 方法6（5）：343-345。
Gu, Z., Gu, L., Eils , R., Schlesner , M. 和Brors , B. (2014)。 circlize 在 R 中实现和增强循环可视化。生物信息学30（19）：2811-2812。
Inoue, H.、 Nojima , H. 和 Okayama, H. (1990)。用质粒高效转化大肠杆菌。基因96（1）：23-28。
Kieke ，MC，Cho，BK， Boder ，ET，Kranz，DM 和Wittrup ，KD（1997 年）。通过酵母表面展示分离抗 T 细胞受体 scFv 突变体。蛋白质工程10（11）：1303-1310。
Lemos Duarte, M., Trimbake , NA, Gupta, A., Tumanut , C., Fan, X., Woods, C., Ram, A., Gomes, I., Bobeck , EN, Schechtman , D., et人。（2021 年）。针对突触蛋白的抗体的高通量筛选和验证，以探索阿片类药物信号动力学。通讯生物学4（1）：238。
李海 (2018)。 Minimap2：核苷酸序列的成对比对。生物信息学34(18)：3094-3100。
Liao, Y.、Smyth, GK 和 Shi, W.（2014 年）。 featureCounts：一个高效的通用程序，用于将序列读取分配给基因组特征。生物信息学30(7)：923-930。
Pointer, KB, Clark, PA, Zorniak , M., Alrfaei , BM 和Kuo , JS (2014)。胶质母细胞瘤癌症干细胞：生物标志物和治疗进展。 Neurochem Int 71：1-7。
Ramirez, F.、Ryan, DP、 Gruning , B.、Bhardwaj, V.、 Kilpert , F.、Richter, AS、 Heyne , S.、 Dundar , F. 和Manke , T.（2016 年）。 deepTools2：用于深度测序数据分析的下一代 Web 服务器。核酸 Res 44(W1)：W160-165。
Smith, AM、Ammar, R.、 Nislow , C. 和 Giaever, G. (2010)。用于药物和靶标发现的酵母基因组测定的调查。药效学那里 127(2): 156-164 。
Ueda, M. 和 Tanaka, A. (2000)。蛋白质在酵母细胞表面的遗传固定。生物技术Adv 18（2）：121-140。
韦茨曼，M.（2018 年）。用于 DNA 大小选择的 Omega Mag-Bind® TotalPure NGS 微珠的评估。基因组学和细胞表征核心设施，俄勒冈大学技术说明。