材料和试剂

2 mL玻璃小瓶（Agilent，目录号：20097845）
聚丙烯离心管，15 和 50 mL（Corning，目录号：430791）
聚丙烯微量离心管，11 × 38 mm，1.5 mL（Beckman Coulter，目录号：9080511）
12 mm 方形聚苯乙烯比色皿（Malvern Panalytical，编号：DTS0012）
2 mL低温小瓶（Corning，目录号：30721070）
商源不锈钢剪刀（Fiskars，目录号：01-004250J）
Optifit预灭菌吸头，10 – 1,000 μL （Sartorius，目录号：PR151159）
Optifit预灭菌吸头，5 – 350 μL （Sartorius，目录号：PR149531）
石英分光光度计电池矩形，塞子，1 mm（Starna Cells，目录号：21Q1）
肌动蛋白（>99% 纯）：兔骨骼肌；存储在 4 °C （细胞骨架，目录号：AKL99）
分子生物学用水（Millipore，目录号：H20MB1001）
氯化钙，干燥，粉末，97%（CaCl 2 ）（Alfa Aesar，目录号：10219230）
无水氯化镁，99%（MgCl 2 ）（Alfa Aesar，目录号：W07D102）
氯化钾（ KCl ）（VWR，BDH Chemicals，目录号：18J2256059）
Tris碱基（Fisher Bioreagents，目录号：BP152-500）
β-巯基乙醇，分子生物学级（BME）（Millipore，目录号：3192024）
三磷酸腺苷(ATP)，100 mM 原液（细胞骨架，目录号：BSA04）
DL-二硫苏糖醇（DTT），分子级（Promega Corporation，目录号： 0000383224 ）
氢氧化钠，颗粒，97%，ACS 试剂 (NaOH)（Sigma-Aldrich，目录号：1310-73-2）
HCl 体积标准，0.1 N 水溶液（Sigma-Aldrich，目录号：7647-01-0）
精密红色蛋白测定试剂（Cytoskeleton，目录号：ADV02）
5 3/4” 移液管（ Fisherbrand ，Fisher Scientific，目录号：13-678-20A）
70% v/v 变性乙醇溶液（Fisher Bioreagents，目录号：216731）
Orion 缓冲液 pH 4.01、pH 7.00 和 pH 10.00（Thermo Scientific，目录号：YX1、YW1、YX1）
通用浸渍池套件（Malvern Panalytical，目录号：ZEN1002）
50 mM CaCl 2 （参见配方）
50 mM MgCl 2 （参见配方）
1.0 M氯化钾（见食谱）
102.24 毫米氯化钾（见食谱）
G-肌动蛋白缓冲液 1 (pH 7.80)（参见配方）
G-肌动蛋白缓冲液 2 (pH 7.66)（参见配方）
G-肌动蛋白缓冲液 3 (pH 8.23) (参见食谱)
聚合缓冲液 1 (pH 7.56)（参见配方）
聚合缓冲液 2 (pH 7.64)（参见配方）
聚合缓冲液 3 (pH 8.07)（参见配方）
电解质缓冲液 1 (pH 7.72)、缓冲液 2 (pH 7.66) 和缓冲液 3 (pH 8.06)（参见配方）

设备

Analytical Explorer Pro-Scale（奥豪斯工业秤，型号：PX84 ）
移液器+（赛多利斯，Andrew Alliance Stand+）
智能电子移液器：5 – 350 μL ，10 – 1,000 μL ，5 – 10 mL（Sartorius，Andrew Alliance Stand+）
带标准管头的涡流混合器，120V（Corning LSE，The Lab Depot，Ref:6775）
磁力搅拌器 RT Basic-12（Thermo Scientific，目录号：88880007）
Orion Star A211 pH 计，精度： ± 0.002（Thermo Scientific，目录号：X56954）
Allegra 64R 台式离心机（Beckman Coulter，产品号：367585），带有 F1202 转子，30,000 rpm（Beckman Coulter，目录号：19U3138）
Zetasizer ULTRA，精度 MW： ± 10% 典型值，温度精度：0.1 °C （Malvern Panalytical，型号：ZSU5700）
Cary 100 紫外-可见分光光度计，准确度：~2%（Agilent Technologies，产品编号：10069000）

软件

ZS Xplorer 软件（Malvern Panalytical， https: //www.malvernpanalytical.com/en/products/product-range/zetasizer-range/zetasizer-advance-range/zetasizer-ultra ）
微软 Word 2021（微软， https://www.microsoft.com/ ）
Cary WinUV Kinetics（安捷伦科技， https: //www.bioprocessonline.com/doc/cary-winuv-software-0001 ）
Cary WinUV 扫描（安捷伦科技， https: //www.bioprocessonline.com/doc/cary-winuv-software-0001 ）

程序

ATP重组
短暂离心以收集储存管底部的白色粉末。
在 pH 7.5 下添加 1 mL 的冷 100 mM Tris 碱，以在 100 mM 处重组 ATP。
根据需要将 ATP 分成实验大小的量。
使用液氮快速冷冻 ATP。
储存在 -20 °C或以下。
笔记：
°C 下可稳定六个月。
°C或以下，ATP 可稳定保存六个月。

图 1. 实验仪器和时间线。
(A) 每日时间表。 (B) 工作场所区域和仪器。 (C) Electronic Pipette+ OneLab ，可减少错误并确保许多测试的一致性。 (D) 将蛋白质溶液转移到细胞比色皿中并放入 Zetasizer ULTRA 支架中以开始扩散系数测量。 (E) 随后，将浸渍池 (ZEN1002) 引入 Zetasizer ULTRA 支架中以执行 ELS 实验并获得电泳迁移率，以及相移和频移数据图。

蛋白质重组
笔记：
肌肉肌动蛋白是一种可靠的蛋白质；它应该小心处理。
为避免重复解冻循环，请考虑特定的实验用量。
本节中考虑的一些步骤由生产商 (Cytoskeleton, Inc) 推荐。除此之外，我们考虑了添加混合步骤（B3 和 B5），因为随着缓冲液的不断添加，肌动蛋白会快速聚集/聚集。因此，我们的目标是通过考虑以下几点来实现无聚集体的解决方案：由于应小心处理肌动蛋白，因此在短时间内将涡流速度设置为低到中速 (4/10)。移液也应小心处理，以避免蛋白质溶液中的高机械应力。
此步骤在第 3 天执行（图 1）。
°C 下可稳定六个月。

将蛋白粉转移到 3 mL 玻璃瓶中。
将 100 μ L 超纯水加入含有蛋白粉的玻璃瓶中，以 10 mg/mL G-肌动蛋白密度重组。
将溶液涡旋30-40 秒，以尽可能多地溶解蛋白粉。
将 2.4 mL 的 G-肌动蛋白缓冲液（缓冲液 1、2 或 3 —配方 B 部分）添加到装有蛋白质溶液的玻璃瓶中。
涡旋一次35-45 秒，以尽可能多地溶解聚集体。如果聚集体仍然存在，移液器并混合溶液以获得均匀的蛋白质溶液。
根据所需的实验数量，将溶液分装成实验大小的量。将小尺寸溶液转移到冷冻管小瓶中。我们建议将蛋白质溶液等分到 250 μ L的倍数（1 × 250 μ L 、2 × 250 μ L 、3 × 250 μ L ……）。
一旦所需的蛋白质溶液被等分，用液氮快速冷冻冷冻管小瓶并立即储存在 -80 摄氏度。

肌动蛋白聚合
笔记：
ATP 和 DTT 最初存储在 -20 摄氏度。当准备好准备解决方案时，解冻这两种解决方案。使用后立即快速冷冻，然后将它们放回冰箱。
按照制造商的建议，在 2 小时离心过程后，按照步骤 C11 从每个微量离心管中去除上清液的前 90%（198 μ L）。留在微量离心机中的半透明颗粒量为 22 μ L。
此步骤在第 4 天执行（图 1）。
肌动蛋白聚合步骤的时间表如图 2 所示。

°C 冰箱中提取一个含有 1 × 250 μL蛋白质溶液的冷冻管小瓶。
在室温下等待 5 分钟解冻。
在冰上孵育小瓶 1 小时，以解聚储存期间形成的肌动蛋白低聚物。
从冷冻管小瓶中提取 200 μ L ，然后转移到 1.5 mL 聚丙烯微量离心管中。
将 20 μL聚合缓冲液（1/10体积）（缓冲液 1、2 或 3 -配方部分 C ）添加到含有 200 μL蛋白质溶液的微量离心管中以开始聚合。
以低速 (3–4/10) 涡旋溶液 40–50 秒。
在室温下孵育蛋白质溶液 1 小时。
在上一步完成前 10-15 分钟打开离心机。在 4 °C 下将离心机设置为 50,000 × g 2 小时。
注意：加速和减速都应该设置在非常低（2/10）的速度。
将蛋白质溶液离心 2 小时。
小心地从离心机中取出含有肌动蛋白溶液的管子，并将它们放在冰上。
将 5 – 350 μ L Pipette+ 置于滴定模式，并按以下方式从溶液中提取上清液，以避免溶液中任何可能导致肌动蛋白丝断裂的压力: 100 μL 、 50 μL和48 μL 。
使用与上一步相同的 Pipette+ 规格，将 978 μL电解质缓冲液（缓冲液 1、2 或 3 —配方部分 D ）添加到肌动蛋白颗粒（22 μL ）中。
将溶液储存在 4 °C并放置过夜。

图 2. 肌动蛋白丝的激活、成核、伸长和退火。
(A) F-肌动蛋白的每小时聚合时间线，从肌动蛋白在室温下的孵育和聚合缓冲液的添加开始。一小时后，离心过程开始将上清液与沉淀（F-肌动蛋白）分离，最后加入电解质缓冲液。 (B) G-肌动蛋白单体经历从活化开始的聚合过程。在该步骤中，Mg 2+ 、K +和Ca 2+与G-肌动蛋白单体结合，从而降低了单体之间的静电排斥并引起结构变化。 (C) 随后，成核开始，由于存在 ATP-和 ADP-肌动蛋白，G-肌动蛋白单体形成稳定的细胞核，支持添加更多单体。 (D) 在伸长阶段，单体通过细丝的两端（尖头和倒刺端）迅速添加到细胞核中。 (E) 最后，在退火步骤中，细丝两端的 G-肌动蛋白单体发生结合和解离。

紫外可见分光光度计吸光度
笔记：
使用前 10-15 分钟打开紫外-可见分光光度计。
用精密红色蛋白质测定试剂测定上清液中的蛋白质浓度。目标是在添加电解质缓冲液后获得颗粒中的蛋白质浓度。有关详细信息，请参阅数据分析>蛋白质浓度分析。

将 1 mL 的精密红色蛋白质测定试剂移液器放入 1.5 mL 一次性微量离心管中。
C11得到的上清蛋白溶液10 μL ，倒置混匀。
在室温下孵育 1 分钟。
将溶液转移到石英比色皿中。
平均时间的扫描控制设置为 0.100 秒，将数据间隔设置为0.12 纳米，将扫描速率设置为 100 纳米/分钟。
– 620 nm 处空白精密红色蛋白质测定试剂上的分光光度计，并在 600 nm 处读取蛋白质样品的吸光度。

动态光散射
测量由几个平均归一化强度自相关衰减组成，称为运行，每个持续 10 秒。运行次数可以由软件根据散射光强度自动确定，这取决于大分子的浓度和大小。或者，它可以由用户手动输入。对于 F-肌动蛋白，运行次数通常为五次（请参阅数据分析下的更多详细信息）。

仪器启动
打开电脑。
按下位于仪器背面的电源开关，打开 Zetasizer ULTRA。
Zetasizer ULTRA 上的状态灯最初为红色。
打开 ZS Xplorer 软件。
Zetasizer ULTRA 上的状态灯将很快变为绿色。
等待 10-15 分钟让仪器稳定下来。
标准操作程序 (SOP)
选择分析> 选择资源管理器> 选择项目资源管理器“+”号> 输入新项目的名称。
选择测量（参见图 3）
名称：输入此测量的样品名称。
单元格：选择DTS0012
材料：选择蛋白质
分散剂：选择水
项目：选择在步骤 2a 中创建的项目。
测量类型：选择尺寸和5 次运行
测量
温度：选择25 °C
返回默认温度：选择是
平衡时间（s）： 180型
数据处理
分析模型：选择通用
高级设置
检测角度：选择反向散射
定位方式: 自动选为Measure at a fixed position
单元格位置：自动选择为5.50
衰减：选择自动
测量过程：选择自动
在子运行后使用暂停：选择否
滤光片：选择无滤光片
重复之间的停顿 (s) : 键入0
用于测量平移扩散系数和相关函数的样品制备：
从 4 °C冰箱中取出 1 mL 等分的聚合 F-肌动蛋白（缓冲液 1、2 或 3 ?? ），置于室温 10 – 15 分钟。
同时，用水和乙醇对剪刀进行清洁和消毒。将Optifit 吸头切割至距离吸头 3 – 5 毫米的直径。当将等分试样转移到细胞比色皿中时，这一动作将大大减少细丝的断裂。
比色皿必须清洁（气压）且没有划痕，因为这可能导致错误测量。
将 Pipette+ (5 – 350 μL )设置为低速 (1 – 2/10) 滴定模式，以将蛋白质溶液提取到细胞比色皿中。以 45 °角模式滴定蛋白质。电池应以 45 °角缓慢填充，以避免产生气泡。
不要完全盖住电池。仅完全盖住电池的一侧。此操作还将减少测量过程中气泡的存在。
按下盖子前面的按钮打开细胞区域盖子。将细胞比色皿推入细胞支架，直到它停止。单元格顶部的小三角形表示单元格的正面，应面向用户。关闭细胞区域盖。
在测量期间（每两组五次运行），打开盖子，从细胞支架中取出细胞比色皿，并使用直径为 3-5 毫米的切割尖端混合蛋白质溶液 2-3 次。紧接着，将细胞比色皿放回细胞架中，然后进行下一组实验。这个动作将减少沉淀。

图 3. Zetasizer ULTRA。
(A) DLS 和 ELS Zetasizer ULTRA 仪器使用 633 nm He-Ne 激光器。它装有一个比色皿，可测量 173 ° 、90 °和 17 °散射的光。它与运行 Windows 10 的计算机连接，并通过 Zetasizer 软件进行控制。 (B) ELS 测量的 SOP 窗口。此处显示的设置也显示在 ELS SOP 下（步骤 I1）。 (C) DLS 测量的 SOP 窗口。此处显示的设置也显示在 DLS SOP（步骤 H2）下。

DLS 测量
设置项目和规格并加载样品后，开始测量。单击属性选择处的播放底部图标，Zetasizer ULTRA 的初始绿灯将变为蓝色。
在 DLS 测量期间，选择Multi-view以显示以下三个窗口： 1) “g 2 (t)-1”与衰减时间“t”，随着运行的继续而更新（参见图 5）； 2)背景中描述的强度波动； 3) 强度分布。
随着一系列运行累积到测量中，选择分析选项卡并找到项目名称以获取此测量生成的所有数据。
每次运行结束后，都会计算分布函数，并提供许多数据选项，例如“强度与大小”、“强度与体积”和“相关图”。这个过程重复五次，得到五个相似的相关函数。
测量完成后，蓝光将恢复为绿色，这意味着 Zetasizer ULTRA 已准备好进行下一组测量。

电泳光散射
一次测量包括几个平均快速场反转相移，称为运行，每次持续 1.4 秒。运行次数可以由软件根据散射光强度自动确定，这取决于大分子的浓度和大小。或者，它可以由用户手动输入。对于 F-肌动蛋白，运行次数通常为 3（请参阅数据分析下的更多详细信息）。

标准操作程序 (SOP)
选择Analyze > 选择Explorer > 选择Project Explorer“+”号> 输入新项目的名称。
选择Measure （参见图 3）
名称：为该测量键入一个样本名称。
电池：选择ZEN1002
材质: 精选蛋白质
分散剂：选择水
项目：选择在步骤 1a 中创建的项目。
测量类型：选择Zeta和3 次运行
测量
温度：选择25 °C
返回默认温度：选择是
平衡时间（秒）： 180型
数据处理
分析模型：选择自动模式
高级设置
衰减：选择自动
测量过程：选择自动，最小运行次数设置为10 ，最大运行次数设置为30
Use pause after sub runs ：选择Yes并将暂停持续时间设置为10
电压选择：选择自动
重复之间的停顿（s）：类型60

用于测量电泳迁移率、频率和相移的样品制备：
一旦 DLS 测量结束，从电池架中取出蛋白质溶液，然后继续插入浸液电池 (ZEN1002)。
在插入浸渍池之前，必须用乙醇和水清洁其电极。每次测量后，必须清洁电极以减少样品间的污染。
浸渍池必须放入样品比色皿中。将 ZEN1002 细胞放入含有蛋白质溶液的细胞比色皿中。确保池顶部的小三角形仍朝向仪器正面，如第 I 部分所示。确保完全插入 ZEN1002 时样品不会溢出比色皿。
同时握住 ZEN1002 池盖的底部和比色皿的顶部，将池推入池架直至停止。
按下盖子前面的底部，打开电池区域盖子。同时握住 ZEN1002 池盖的底部和比色皿的顶部，将池推入池架直至停止。关闭单元格区域盖。
在 ELS 测量期间，检查浸入池电极和样品是否存在任何潜在污染。每次运行后未能清洁电极可能会导致样品之间的交叉污染。
ELS 测量
设置项目和规格并加载样品后，开始测量。单击属性选择处的播放底部图标，Zetasizer ULTRA 的初始绿灯将变为蓝色。
在 ELS 测量期间，选择Multi-view以显示以下三个窗口： 1) “PALS: phase(rad) vs t”，随着运行的继续而更新（参见图 6）； 2)背景中描述的强度波动； 3) 频移。
随着一系列运行累积到测量中，选择分析选项卡并找到“项目名称”以获取此测量生成的所有数据。
每次运行结束后，相位分析的快速场反转 (FFR) 将与其他数据选项（例如频移）一起可用。
测量完成后，蓝光将恢复为绿色，这意味着 Zetasizer ULTRA 已准备好进行下一组测量。
关闭
退出 ZS Xplorer 软件（文件 > 退出）。
关闭 Zetasizer 设备。
关闭计算机。

数据分析

有关数据分析的详细信息已经出现在原始研究文章的“材料和方法”部分（Alva 等。 , 2022) 。

DLS 分析
注意：反向散射角技术显着减少了信噪比相关图中灰尘的存在。但是，由于多重指数衰减和波动次数的增加，相关图的基线中可能会出现摇摆不定的行为。在这种情况下，它可能会导致样品的聚集和沉淀。因此，我们建议遵循注释 12。

完成一组测量后，选择“分析”选项卡并选择已保存所有测量的适当项目名称。
选择大小选项卡。在数据选项下，选择可用于每次运行的多个参数。例如，根据用户的需要选择大小 > Z 平均值、PDI、平移扩散系数、派生平均计数率或任何其他大小参数（参见图 4）。

图 4. 表属性。
(A) 全面显示可用参数和属性，可根据用户对 DLS 和 ELS 的需求进行选择。 (B) 为 DLS 测量选择和推荐的参数。（C）。为 ELS 测量选择和推荐的参数。

显示所选参数后，选择相关图作为每次运行要显示的数据图之一。相关图是分析和确定样品和测量质量的重要数据函数。相关图必须遵循实验标准，以尽量减少错误并确保可重复性。
相关图的截距必须小于 1 并且在低多分散性指数 (0.4 < PDI < 0.8) 的范围内，表明多分散性样品的质量良好。
得出的计数率应高于 100 kpcs，这是获得合适测量值所需的最小值。
相关图还应呈现平滑且均匀的单指数衰减。但是，由于样品的聚集体、沉降和灰尘，相关图数据图可能会在单次运行中显示多个指数衰减。在这种情况下，数据将被忽略。在实验标准下也考虑了这一点，以减少错误并提高可重复性（参见图 5）。

图 5. 相关系数。
从尺寸测量中获得的相关数据函数 [g 2 -1 与时间 ( μ s)] 图的说明性示例。 (A) 从五个连续的独立实验中测量的数据。 (B) 根据实验标准忽略两次测量 (2/5) 后选择用于数据分析的三个相关数据函数以提高准确性。

ELS 分析
完成一组测量后，选择“分析”选项卡和保存所有测量的相应项目名称。
选择Zeta选项卡。在数据选项下，选择可用于每次运行的多个参数。例如，根据用户的需要选择 Zeta > zeta 电位、电泳迁移率、品质因数、电导率或任何其他电泳参数（图 4）。
显示所选参数后，选择要为每次运行显示的相位图和频移数据图。快速场反转 (FFR) 相位图是确定样品和测量质量的重要数据函数。对每个肌动蛋白丝样品进行了三个独立实验，以减少电泳迁移率值的统计误差。
品质因数是在测量的 FFR 阶段从相位分析图中得出的参数；它必须大于 1 才能被视为优质数据。
频移图应该有非常低的噪声痕迹，因为这是另一个质量数据检查。此外，相位 FFR 图应具有正弦特性，这也意味着数据质量良好（参见图 6）。

图 6. 相移和频移。
从电泳测量中获得的相移和频移图的说明性示例。在相位 (A) 和频移 (B) 上测量三个独立实验，以减少电泳迁移率值的统计误差。频移图中显示了良好数据质量的证据，因为没有噪声痕迹并且曲线非常匹配。

蛋白质浓度分析
注意：我们对颗粒浓度进行了计算，以确认我们实验中使用的样品处于稀释状态，其中光散射测量对应于单肌动蛋白丝特性。当颗粒浓度值“c”= 1.37 μ M 低于时，达到此条件1/〖〗^3 *N_A，其中和 N A分别是平均灯丝长度和阿伏加德罗数。使用拟合方法（Alva 等人，2022 年，表 8），我们获得了 ~ 0.5 μ m 和1/〖〗^3 *N_A~ 13.3 μ M。因此，我们的实验是在稀释状态下进行的。

计算初始浓度 (C o )
100μL超纯水复溶肌动蛋白时，配方如下：

C(concentration)= (Mass of Protein Powder (mg))/Volume=10 mg/mL

添加 2.4 mL 的 G-肌动蛋白缓冲液会将蛋白质浓度更改为 0.4 mg/mL：

C=(1 mg)/(0.1 ml+2.4 ml)=0.4 mg/mL

我们从每个试管中提取 200 μ L并添加 20 μ L聚合缓冲液。因此，用于实验测量的蛋白质初始浓度如下：

C_o=(0.08 mg)/(0.2 mL+0.02 mL)=0.3636 mg/mL

图 7. 吸光度。
从分光光度测量中获得的吸光度数据图的说明性示例。在 600 nm 处测量总初始蛋白质浓度（黑线）和上清液的三个独立实验的吸光度曲线。平均吸光度值用于确定数据分析步骤 C2 中上清液的质量。

计算质量上清液浓度 (M SN )
注意：在这个阶段，分光光度的吸光度范围是 0.009 – 0.012。该范围来自对所有缓冲区执行的多个独立测量。如果吸光度值超出此范围，则可能有一定百分比的 G-肌动蛋白没有聚合成细丝。换言之，离心不完全和/或在上清液中发现一些过量的蛋白质浓度。
上清液在 600 nm 处获得的三个独立吸光度值的平均值为 0.01055。
根据 1.00 OD 600 nm = 100 μ g蛋白质/mL 试剂/cm 计算上清液浓度，并将此蛋白质浓度乘以 10 以达到原始蛋白质溶液的μ g /mL 蛋白质浓度。
μL中上清液浓度为 0.1055 mg/ mL 。因此，应用以下等式求解 M SN ：

M_SN=Supernatant Concentration *Supernatant Volume=0.0209 mg

颗粒浓度 (F-肌动蛋白) (CP )的计算
首先，初始质量浓度 (0.08 mg) 与上清液浓度 (0.0209 mg) 的质量之差可用于获得沉淀的质量 M P ，如下所示：

M_P=Mass Initial Concentration-Mass Supernatant Concentration=0.0591 mg

此外，一旦颗粒的质量 (0.0591 mg) 已知，颗粒浓度很容易预测为 22 μ L （体积颗粒）：

C_P=(Mass Pellet)/(Volume Pellet)=2.687 mg/mL

最后，为了找到颗粒的摩尔浓度 (M)，我们使用以下等式，其中颗粒浓度 (mg/mL) 除以肌动蛋白的分子量 (43 KDa )：

Pellet Molarity (M_P )= (Pellet Concentration(mg/mL))/(Actin Molecular Weight (Da))=1.37 μM

样品质量控制
注意：以下步骤/评论旨在供新实验者将其样品质量与光散射测量数据图相关联。
相关函数是一个很好的指示图，以确保系统没有聚集/沉淀。如DLS 分析中所示，如果观察到多个指数衰减和振荡基线，则很可能代表样品的聚集和/或沉降。
确保样品均匀性的一个好做法是在任何 DLS 和 ELS 测量之前混合和涡旋溶液，以避免沉淀倾向并确保高质量数据。
强烈建议了解稀释方案中的蛋白质浓度以确保分散。如果实现增加的蛋白质浓度，则可能形成更长的肌动蛋白丝和更高阶结构，从而导致 DLS 测量结果与我们文章中介绍的结果不同（Alva 等人， 2022 年）。从 ELS 实验的角度来看，高 zeta 电位值与聚合物之间的高排斥力相关，从而导致分散系统。如果实现增加的聚电解质浓度，则 zeta 电位值可能会降低，并且分散可能会减弱。

笔记

重要的是要有良好的实验室规范，包括在非常干净的条件下工作。为尽量减少任何污染源，请紧紧关闭试管、小瓶和样品。确保试管和小瓶清洁无尘，以防止存在污染物（参见图 1）。
使用 15 mL 锥形管至关重要，因为它有助于测量和调整缓冲液 (1-3) 的 pH值。如果管子较小，pH计探头将无法安装；此外，没有足够的溶液覆盖探头尖端，导致 pH 读数不准确。
调整 pH 值（G-肌动蛋白和聚合缓冲液）时，使用玻璃移液管小心地将碱和酸溶液逐滴添加到缓冲液中。添加过多的液滴可能会显着增加或降低 pH 值，因此请谨慎使用。重要的是在添加这些液滴后涡旋溶液以使其混合均匀；否则会导致 pH 读数不准确。
要开始蛋白质重组，需要提取 1 mg G-肌动蛋白蛋白粉。粉末通常被冷冻并粘在小瓶底部。我们建议以低速至中速 (5/10) 涡旋震荡蛋白瓶 30 – 45 秒以使蛋白粉变得平滑，并在蛋白仍然干燥时便于提取。
将 G-actin 缓冲液添加到 10 mg/mL G-actin 密度后，蛋白质会聚集。通过涡旋和移液将溶液充分混合以失去团块。这些结构是可见的，因此请充分混合溶液以创建并保持均匀的溶液。
G-肌动蛋白可能集中在溶液的表面。如果是这样，在分装到实验样品之前充分混合溶液。
切割Optifit 吸头时，请在吸头上标上参考标记，以使此过程更轻松、更一致。尖端需要具有大约 3 – 5 毫米的直径，以减少细丝的断裂。
在离心步骤中，我们使用 50,000 × g旋转 2 小时以确保长丝颗粒从短到长。如果可以使用更快的超速离心（50,000 × g < 速度 < 100,000 × g ），我们建议持续时间为 1.5-2 小时。如果超速离心能够达到 100,000 × g ，我们强烈推荐 1 小时的持续时间。
我们建议通过鬼笔环肽的荧光标记和/或类似的成像技术（如透射电子显微镜）对肌动蛋白丝进行成像，以确保肌动蛋白最终制备和形成的质量（参见图 8）。

图 8. 肌动蛋白丝的显微图像。
使用 JEOL 1400 透射电子显微镜的肌动蛋白丝的说明性显微图像。在 TEM 样品制备过程中，样品在 Formvar 涂层网格上使用 2% 乙酸双氧铀进行了一系列步骤。样品用蒸馏水洗涤 2-3 次。

警告：如果肌动蛋白丝或其他聚合物暴露在高电解质盐浓度（离子强度）中，则很有可能在溶液中形成新的有序结构（束和网络）和聚集体。我们建议注意溶液中使用的类型和盐浓度，这可能会导致肌动蛋白丝束（Tang 和 Janmey，1996）或其他聚合物。
不同肌动蛋白制剂的例子：
在肌动蛋白浓度高于临界值时，ATP-G-肌动蛋白在溶液中增加，导致伸长率显着增加（Crevenna 等人，2013）并形成更长和更半柔韧的细丝。随着细丝长度的增加，细丝的断裂可能会更高。另一方面，较长的灯丝产生较小的扩散系数和较高的电泳迁移率值。
肌动蛋白丝伸长动力学取决于 pH 溶液。在 pH 值高于 7 时，由于伸长率降低，可能会形成较短的细丝（Crevenna 等人， 2013）。因此，更高的扩散系数和更小的电泳迁移率值将在更高的 pH 水平溶液中被预期。
聚合速率取决于与肌动蛋白结合的二价阳离子的类型。因此，如果 Mg 2+用作聚合缓冲液的一部分（而不是 Ca 2+ ），它可能会导致肌动蛋白丝的机械和柔韧性发生变化（Steinmetz 等人，1997 ）。这些变化可能会影响肌动蛋白丝的流体动力学和静电特性。因此，当在聚合缓冲液中使用不同的金属离子时，扩散和电泳迁移率值可能会发生变化。
高浓度的 Ca 2+和 Mg 2+可能会减弱相互排斥的丝间相互作用和肌动蛋白丝的成束形成（Castaneda et al., 2018）。因此，不同二价浓度下的肌动蛋白制剂可能会产生具有不同弯曲、直径和长度的肌动蛋白束，因此，流体动力学和静电性能。
蛋白，即凝溶胶蛋白，调节肌动蛋白丝的组装和长度（Warshavsky 等人，2022）。例如，G-肌动蛋白和凝溶胶蛋白浓度之比越低，平均丝长度越短，扩散系数越高，电泳迁移率值越小。
为避免光散射实验期间蛋白质的沉淀和/或聚集，请使用 3 – 5 mm 的尖端轻轻吸取两次运行之间的溶液2 – 3 倍。
如果样品的蛋白质和/或盐浓度高于本协议中建议的浓度，我们强烈建议通过在 ZS Xplorer软件中的 Measure > Dispersant 下添加此值来考虑粘度参数。
DLS 仪器中的衰减因子使用多个位置 (1 – 11) 来控制光束强度从 100% 到 0.0003%。此功能设置为自动以允许 ZS Xplorer 软件确定最佳衰减器。对于 F-肌动蛋白，衰减因子通常在 10 到 11 之间变化。
材料的折射率和吸收对 Z 平均值、多分散性和强度没有影响。我们选择蛋白质作为被测材料，由 1.450 的折射率和 0.001 的吸收组成。同样，分散剂的折射率设置为 1.33，粘度设置为 0.8872 mPa · s。这些值可能会根据不同的材料和/或被测量的电解质而有所不同。
相关函数是在后向散射角 (173 ° ) 处测量的，其中入射光束不必穿过整个样品。多次散射和灰尘的影响大大降低。
在 DLS 实验期间，测量持续时间由检测到的计数率自动确定。计数率越低，测量持续时间越长，噪声越大。
由于 F-肌动蛋白形成未知尺寸分布的多分散系统，因此在 DLS 测量期间选择了使用 CONTIN 算法的通用分析模型。
ZS Xplorer 软件在设置为自动时测量系统的样品电导率。它调整电池电压以在样品中保持接近 5 ms /cm 的低电流流动。如果不考虑这一点，则电极附近的样品温度可能会升高，从而导致气泡形成和样品降解，从而导致结果不准确。
选择相分析光散射的快速场反转 (FFR)，因为在此期间测量的迁移率仅归因于粒子的电泳。它不受与软场反转 (SFR) 相关的电渗透的影响。
该协议还可以应用于其他制造商的仪器，例如 Wyatt Technology 的 Dynamics Mobius 和 Brookhaven Instruments Corporation 的 NanoBrook 系列。与 ULTRA Zetasizer 一样，这些仪器可以执行 DLS 和 ELS 测量。两种仪器的软件设置有些相似，除了数据分析。我们建议对尺寸测量进行多峰分析，特别是对于多分散系统。
Mobius 和 NanoBrook 系列仪器使用不同的体积和比色皿进行尺寸和 zeta 电位测量。我们强烈建议按照他们的网站和手册使用他们的比色皿。
当长期测量将电池温度升高到大约 50 °C时，测量之间的时间延迟有助于减少样品加热，从而使样品在连续测量之间恢复 25 °C ，从而减少关键样品降解并避免通过连续测量增加流动性。
标准操作方案、数据分析（Parker 等人，2021）和生物分子制剂分析以检测蛋白质、糖蛋白、蛋白质-蛋白质复合物等的聚集，可在其他地方找到（Stetefeld 等。 , 2016)。

食谱

库存缓冲
50 毫米氯化钙2
试剂终浓度数量
氯化钙2 50毫米 55.50 毫克
H 2 O 超纯不适用 10米长
全部的 50毫米 10毫升

50 毫米氯化镁2
试剂终浓度数量
氯化镁2 50毫米 47.61 毫克
H 2 O 超纯不适用 10米长
全部的 50毫米 10毫升

1.0 M氯化钾
试剂终浓度数量
氯化钾 1.0 米 745.5 毫克
H 2 O超纯不适用 10米长
全部的 1.0 米 10毫升

102.24 毫米氯化钾
试剂终浓度数量
氯化钾 102.24 毫米 76.22 毫克
H 2 O超纯不适用 10米长
全部的 102.24 毫米 10毫升

笔记：
1）。为了保持库存缓冲液的生物活性，它们需要每周重新制作。
2).此步骤在第 1 天执行（参见图 1）。

G-肌动蛋白缓冲液
G-肌动蛋白缓冲液 1 (pH 7.80)
试剂终浓度数量
Tris碱（100 mM，pH 7.6） 2毫米 100微升_
H 2 O 超纯不适用 4,845微升_
CaCl 2 (50 毫米) 0.2 毫米 20微升_
三磷酸腺苷 (100 毫米) 0.5 毫米 25μL _ _
数字地面电视 (100 毫米) 0.2 毫米 10微升_
全部的不适用 5 毫升

G-肌动蛋白缓冲液 2 (pH 7.66)
试剂终浓度数量
Tris碱（100 mM，pH 7.6） 2毫米 100微升_
H 2 O 超纯不适用 4,860微升_
CaCl 2 (50 毫米) 0.2 毫米 20微升_
三磷酸腺苷 (100 毫米) 0.2 毫米 10微升_
BME (50 毫米) 0.1 毫米 10微升_
全部的不适用 5 毫升

G-肌动蛋白缓冲液 3 (pH 8.23)
试剂终浓度数量
Tris碱（100 mM，pH 7.6） 2毫米 100微升_
H 2 O 超纯不适用 4,830微升_
CaCl 2 (50 毫米) 0.2 毫米 20微升_
三磷酸腺苷 (100 毫米) 0.5 毫米 25μL _ _
数字地面电视 (100 毫米) 0.5 毫米 25μL _ _
全部的不适用 5 毫升

笔记：
1）。在使用前使用 Orion 缓冲液 pH 4.01、7.00 和 10.00 在三点校准时校准 pH 计。
2).要增加/减少 pH 值，请分别添加碱 (0.74 M NaOH) 或酸 (0.1 N HCl) 溶液。小心添加这些液滴并不断检查 pH 值，因为它会迅速变化。
3）。此步骤在第 2 天执行（图 1）。
4).在冷却器中准备好冰块，因为所有 G-actin 缓冲液都必须在冰上完成。

聚合缓冲液
聚合缓冲液 1 (pH 7.56)
试剂终浓度数量
H 2 O 超纯不适用 4,050微升_
氯化镁2 (50 毫米) 2毫米 200微升_
氯化钾 (1.0 M) 150 毫米 750微升_
全部的不适用 5 毫升

聚合缓冲液 2 (pH 7.64)
试剂终浓度数量
H 2 O超纯不适用 4,050微升_
氯化镁2 (50 毫米) 2毫米 200微升_
氯化钾 (1.0 M) 150毫米 750微升_
全部的不适用 5 毫升

聚合缓冲液 3 (pH 8.07)
试剂终浓度数量
H 2 O超纯不适用 4,550微升_
氯化镁2 (50 毫米) 2毫米 200微升_
氯化钾 (1.0 M) 50毫米 250微升_
全部的不适用 5 毫升

笔记：
1）。此步骤也在第 2 天执行（图 1）。
2).在冷却器中准备好冰块，因为所有聚合缓冲液都必须在冰上进行。

电解质缓冲液
电解质缓冲液 1 (pH 7.72)、缓冲液 2 (pH 7.66)、缓冲液 3 (pH 8.06)
试剂终浓度数量
H 2 O超纯不适用 10毫升
氯化钾 102.24 毫米 76.22 毫克
全部的不适用 10毫升

致谢

这项工作得到了 NIH 赠款 1SC1GM127187-04 的支持。我们感谢博士。来自 Malvern Panalytical Instruments Inc. 的 Carrie Schindler、Anna Morfesis、Ronald Soriano 和 Matthew Brown，感谢他们在光散射仪器配置和数据分析方面的帮助和建议。我们也感谢博士。感谢 Cytoskeleton Inc. 的 Brian Hoover 和 Lee Toni 在样品制备和蛋白质浓度分析方面的帮助和建议。该协议源自以前的工作 (F. Wang 等。 , 1989; Janmey等人。 , 1994, 1986).

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

本协议中没有描述人类受试者或动物研究。

参考

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