材料和试剂

用于体外培养
6孔板（Corning，目录号：353046）
1.7 mL微量离心管（Thomas Scientific，目录号：1149K01）
离心管（Corning，Falcon 管，目录号：430829 [50 mL]、352096 [15 mL]）
移液器吸头 [USA Scientific，目录号：1121-3810（10 μL ）、1120-8810（200 μL ）、1111-2721（1,000 μL ）]
堵塞的血清学无菌移液器[Corning，Falcon移液器，目录号：357543（5 mL），357551（10 mL），357525（25 mL）]
Millex过滤器单元[Millipore，目录号：SLGSR33SS（注射器驱动），S2GPU10RE（真空驱动）]
移液器 [Eppendorf，目录号：K24694J（1,000 μL ）、J46084J（200 μL ）、H16607J（20 μL ）、I54818J（10 μL ）]
移液器援助（德拉蒙德科学）
吸管（Santa Cruz，目录号：357781）
DMEM/F-12（Lonza，目录号： BE04-687/U1，Basel，Switzerland；或Thermo Fisher Scientific，目录号：21331020）
DMEM（ Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：11-966-025）
RPMI（ Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：11-875-093）
FBS（ Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：10438-026，Waltham，MA，USA）
50 × HT培养基补充剂Hybrid - Max TM （Sigma，目录号：H0137）
L-谷氨酰胺（ Thermo Fisher Scientific ，Gibco，目录号：25030-081）
抗真菌剂（抗生素）（ Thermo Fisher Scientific， Gibco，目录号：15240-062）
庆大霉素试剂溶液（ Thermo Fisher Scientific， Gibco，目录号：15710-072）
A +人类红细胞（美国红十字会或州际血库，Inc.）
B. duncani WA1 菌株（BEI Resources，NR-12311）
DMEM/F-12 完全培养基（250 mL）（见配方）

用于冷冻保存
Glycerolyte 57 溶液（Baxter Healthcare 公司，Deerfield，IL，USA，目录号：4A7831）
冷冻管小瓶（ Thermo Scientific，目录号：363401）

用于幻灯片准备
优质显微镜载玻片（ Fisherfinest ，目录号：22038-103）
Hemacolor溶液I，固定剂（Sigma-Aldrich，目录号：65044A-85）
Hemacolor溶液II（Sigma-Aldrich，目录号：65044B-85）
Hemacolor溶液 III（Sigma-Aldrich，目录号： 65044C)
浸油（ Cargille ，目录号：16482）

用于小鼠感染
BD PrecisionGlide TM 27G 针（BD，目录号：305109）
肝素锂涂层采血管（McKesson 574507，Greiner Bio-One， MiniCollect ，目录号：450477）
肝素化毛细管（Fisher Scientific，目录号：22-260-950）
异氟醚（ Covetrus ，目录号：11695-6777-2）
PEG 400（ Thermo Fisher Scientific，Avantor JT Baker U216-07，目录号：02-003-646）
× PBS pH 7.4稀释的1 × PBS （Gibco，目录号：70011-044）
小鼠品系：C3H/ HeJ （来自 Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME）
笔记：我们的研究表明，C3H/ HeJ小鼠在IV 接种剂量范围为 10 2至 10 7的受感染红细胞 ( iRBC ) 后易感染邓氏杆菌。我们发现 10 7和 10 6 iRBC剂量在短时间内 [感染后 3 – 5 天 (DPI)] 引起寄生虫血症 (P) 急剧增加（高达 35%），而接种 10 2 –10 5剂量的小鼠 iRBC表现出延迟的感染发作，峰值 P 较低（Pal 等人，2022）。在相同感染剂量下，雌性 C3H/ HeJ小鼠的寄生虫血症水平总是高于雄性（Aguilar-Delfin 等人，2001 年；Pal 等人，2022 年）。相比之下，C57BL/6J 小鼠在接种 10 4 B. duncani – iRBC后显示出 100% 的存活率且未检测到P。用 10 4 B. duncani – iRBC感染Balb / cJ导致所有小鼠的 P 随着时间的推移增加；然而，大约 50% 的小鼠清除了感染并存活下来，而另一半继续显示可检测到的 P 并死于感染（Pal 等人，2022 年）。
30% 异氟醚 (50 mL)（吸入麻醉剂；参见食谱）

设备

Sorvall legend XTR 离心机（ Thermo Scientific，目录号：75004521）
显微镜（尼康 Eclipse 5Oi）
SterilGARD III 高级生物安全柜（The Baker Company，目录号：SG603）
水浴锅（Fisher品牌，型号：FSGPD15D）
三气培养箱（ Thermo Scientific，型号：HERACELL VIOS 160i）
Eppendorf MiniSpin （Millipore-Sigma，目录号：EP022620100）

软件

GraphPad 棱镜版本 9.4.1

程序

B. duncani WA1 在hRBCs中的体外培养
通过在生物安全柜内的无菌条件下添加所有组件（参见图 1）来准备介质（图 2）。
注意：在无法从上述不同来源获得 DMEM/F-12 的特定情况下，添加缺失成分（DMEM/F-12 中存在的成分）的 DMEM 基础培养基可成功用于寄生虫培养（参见下面提供的表 1） ).

数字 1. 显示B. ducani体外培养所需的媒体成分和材料的代表性图像

B. duncani所需的生物安全柜 BSL-2 等级的代表性图像寄生虫

表 1. 完成 DMEM 基础介质所需的补充以用作 DMEM/F-12 的替代品

洗涤hRBCs如下：
从捐献中心接收血液（装有约 500 毫升全血的袋子）后，将袋子倒置 2-3 次，轻轻混匀。将血样分装到 50 mL 离心管中，并在 4 °C 下储存直至洗涤。未清洗的血液可在 4 °C下保存长达 1 个月。
要清洗等份的血液，请使用不完整的 DMEM 或 RPMI 介质。每 1 体积的浓缩 RBC 使用大约 4 体积的培养基。轻轻混合悬浮液以重悬红细胞，并在室温 (RT) 下以 1,800 rpm (757 × g ) 离心 10 分钟。
注意：对于洗涤红细胞，可以使用任何来源的 DMEM/RPMI。
离心后，轻轻吸出培养基并小心地从顶部 RBC 层中取出含有白细胞的血沉棕黄层。重复洗涤步骤两次。
最后一次清洗后，添加等量的不完整 DMEM 或 RPMI 介质，使血细胞比容 (HC) 达到 50%。
洗涤后的红细胞 (50% HC) 可立即用于体外培养或储存在 4 °C以供进一步使用。洗涤后的红细胞可在 4 °C 下储存，并在细胞培养中使用长达两周。
解冻冷冻保存的B. duncani感染的红细胞：
从液氮中取出冷冻寄生虫的冷冻管，立即放入37 °C水浴中几秒钟，直到小瓶中的内容物变成液体。
将含有受B. duncani感染的hRBC的解冻小瓶中的内容物转移到生物安全柜内的 50 mL 离心管中。
200 μ L的 12% (w/v) NaCl (0.2 ×原始冷冻管体积)。在 RT 孵育 5 分钟。
在轻轻摇动管子的同时滴加 9 mL 的 1.6% (w/v) NaCl。
在室温下以 1,500 rpm (526 × g ) 离心 5 分钟。在不干扰颗粒的情况下去除上清液。
添加 25 mL 的不完整 DMEM/F-12 介质来清洗寄生虫颗粒。在室温下以 1,500 rpm (526 × g ) 离心 5 分钟。
再重复一次上述步骤，将沉淀重悬于 3.6 mL 完整的 DMEM/F-12 培养基中（参见食谱）。添加 400 μ L洗涤过的 50% HC A + RBC（步骤 2）以将培养物维持在 5% HC。
将培养物播种到 6 孔板的孔中，并将其放置在2% O 2 、5% CO 2和 93% N 2气氛和 95% 湿度设置的培养箱中（见图 3）。

图3.用于B. ducani体外培养的 Tri 气体培养箱的代表性图像

保持文化如下：
每天用吸管吸出旧培养基更换培养基，并用预热至 37°C 的完整 DMEM/F-12 培养基更换。
注意：在吸出培养基时要格外小心，以免干扰含有iRBC的板底部。
通过涂片制备监测培养物和 P 水平，如下所示：
如上所述吸出培养基，轻轻吹打几次，将培养物重悬于新鲜培养基中。
在微量离心管中取 50 μL培养物，在室温下以 2,500 rpm (700 × g ) 旋转2分钟。
用 200 μL移液器吸头（设置为 40 μL ）小心去除上清液，留下 10 μL培养基。通过轻轻吹打几次来重悬 RBC 颗粒。
将一滴重新悬浮的红细胞放在一张幻灯片上，并通过以 25 ° - 45 °的角度滑动另一张幻灯片来制作涂片，如图 4 所示。
在固定液 I 中固定血涂片 10 s，然后在溶液 II 中固定 10 s。用溶液 III 染色 25 秒。在水中冲洗染色的载玻片，风干，并在光学显微镜下以 100 ×可视化载玻片（10% P 的血液涂片的代表性图像，如图 5 所示）。
估计 P 如下：
从体外培养中制作涂片，并按照上述步骤i -v 中的说明进行 Giemsa 染色。
风干 3-4 分钟。放一滴浸油并在显微镜下观察。
计算现场的iRBC和总 RBC ( tRBC ) ( tRBC = iRBC + 未感染的 RBC)。
对不同的字段重复步骤 3，直到添加所有字段的tRBC计数为 1,000–2,000 RBC（以获得更高的准确性）。
计算iRBC的百分比如下：

Field 1=(9 iRBCs)/(80 tRBCs) Field 2=(10 iRBCs)/(110 tRBCs) Field 3=(11 iRBCs)/(120 tRBCs) Field 5=(8 iRBCs)/(70 tRBCs) Field 6=(12 iRBCs)/(130 tRBCs)

(9+10+11+8+12)/(80+110+120+70+130)= 50/510×100=9.8%

图 4. 代表性图像展示用于涂片制备的载玻片和 RBC 颗粒（离心后 50 μ L体外培养物）的角位置

图5. 描绘 10% P 的B. duncani感染的人红细胞的代表性图像

注意：增加用于计算iRBC和tRBC比例以及 P 水平百分比的字段数可以更准确地确定 P。

– 15% ，通过接种 0.5% – 1% P 的原始培养物来维持寄生虫培养。
示例：对于含有 0.5% P 和 5% HC 的 5 mL 起始培养物，取 250 μ L储备培养物（10% P 和 5% HC）并添加 475 μ L 50% HC 洗涤过的hRBC和 4.275 mL完整的 DMEM/F-12 培养基。
对于需要高 P 的特定检测，每 24 小时后通过更换介质连续培养寄生虫，直到达到所需的 P. B. duncani体外培养可达到 20% – 25% P。

体外培养的B. duncani – iRBCs的超低温保存
按照步骤 A4a 中所述，对从体外培养的寄生虫制备的血液涂片进行 Giemsa 染色后，通过光学显微镜估计 P 水平如果 P > 5%，则继续进行以下冷冻保存步骤。
在 RT 下以 1,800 rpm 离心 5 分钟，将培养物 (5 mL) 沉淀。
吸出上清液，留下红细胞颗粒。
250 μ L过滤灭菌的甘油，同时轻敲管底进行混合。
轻轻混合悬浮液并放入冷冻管中。在冷冻保存当天标记描述寄生虫菌株和培养物 % P 的冷冻管。
将冷冻管储存在-80°C。
对于长期储存（超过六个月），从-80°C 取出冷冻管并放入液氮中。

B. duncani裂殖子的纯化
在 DMEM/F-12 培养基中的hRBC中启动和维持B. duncani体外培养，直到 P 达到 18% – 20%，并且可以在血涂片中观察到游离裂殖子（图 6）。

图 6. 描绘 18%–20% P 和箭头所示游离裂殖子的代表性图像

要分离游离裂殖子，请在 1,800 rpm（757 × g ）和 37 °C下将寄生虫培养物离心5 分钟。
使用含有B. ducani的颗粒 iRBC用于启动新鲜的发酵剂培养或其他检测。使用移液管将含有游离裂殖子的上清液收集到新鲜的离心管中。
将上清液在 4,000 rpm (1,932 × g ) 和 37 °C下离心10 分钟。所得颗粒含有游离裂殖子。
以 1:5 的比例 (v/v) 将裂殖子颗粒重新悬浮在温暖的 DMEM/F-12 中。例如，对于 10 μL 的填充颗粒，添加50 μL培养基。
通过姬姆萨染色估计裂殖子的纯度。裂殖子制剂的纯度取决于游离裂殖子的数量，几乎没有完整的未感染或感染的红细胞。图 7 显示了未检测到红细胞的裂殖子制剂的示例。纯度超过 95% 的裂殖子制剂被认为适用于后续的细胞生物学和分子分析。

图 7. 显示游离裂殖子（黑色箭头）的代表性图像。
图像中的粉红色结构代表受感染红细胞裂解产生的 RBC 膜。

小鼠感染
在采购后适应一周后使用 5-6周大的雌性 C3H/ HeJ小鼠。
要感染小鼠，请使用B. duncani体外培养的纯化裂殖子 (2 × 10 7 ) 或人iRBC (8.5 × 10 5 ) 并通过眶后静脉 (IV) 途径注射。
注意：更高剂量的寄生虫感染将加速小鼠感染的建立。但是，结果可能会因感染和处理的成功而异。
计算含有 8.5 × 10 5寄生虫的ihRBC数量如下：
体外培养中iRBC的计算：
1 mL 人血 = 5 × 10 9 RBC (100% HC)
1 mL 5% HC 人血 = 2.5 × 10 8个红细胞
如果 Giemsa 染色估计的 P 为 10%
1 mL 含 10% P 的 5% HC = 10/100× 2.5 × 10 8 = 2.5 × 10 7 iRBC
取所需数量的寄生虫 (8.5 × 10 5 )，如下所示：
6的100 μ L上述培养物（步骤 D3a） iRBC并通过添加 900 μL 的 1 × PBS 以 1:10 稀释，以达到每μL 2.5 × 10 3个寄生虫的浓度。
对于来自上述稀释培养物的 8.5 × 10 5寄生虫，取 340 μ L （8.5 × 10 5 ÷ 2.5 × 10 5 = 340 μ L ）并在室温下以 1,800 rpm（757 × g ）离心 5 分钟沉淀下来。小心吸出上清液，留下 100 μ L的上清液。
通过轻敲重悬并按照以下步骤 D5 中的描述进行注射。
注意：连续稀释以获得所需数量的寄生虫很重要，而不是直接从原始培养物中取出非常少量（例如 34 μ L ）（以避免移液错误）。
执行 IV 感染如下：
使用一个罐子，里面装有浸泡在 30% 异氟醚（吸入麻醉剂）中的棉花，在 PEG 400 中稀释，放在底部并用网眼覆盖。将一只老鼠放在含有上述吸入麻醉剂的密封室内 (见图 8)。

图 8. 显示小鼠感染所需试剂和材料的代表性图像

在步骤 D3b 中注入 100 μ L寄生虫（在 PBS 中）稀释，并通过 IV 途径注入。
通过在 24 或 48 小时的固定时间间隔内从尾静脉收集的血液制备的薄血涂片显微镜监测 P。使用 GraphPad Prism 绘制 P 和生存曲线。
来自受感染小鼠的血液可用于感染另一只未受感染的小鼠以维持寄生虫库存。可以通过显微镜检查吉姆萨染色的血涂片来监测母鼠中的寄生虫血症。
计算鼠对鼠感染所需的血量：
iRBC的计算
1 mL 小鼠血液 = 10 × 10 9 红细胞
如果 P（通过 Giemsa 染色估计）为 10%
1 毫升 10% P =10/100 × 10 × 10 9 = 10 9 iRBC
iRBC的稀释
如果所需的感染剂量为 10 4寄生虫，则通过在肝素化采血管中的眼眶后出血从小鼠身上采集 30 μ L的血液，并按如下方式稀释：
取 10 μ L血液（1.0 × 10 7 iRBC ），加入 990 μ L 1 × PBS 制成 1 × 10 7 iRBC /毫升。
上述稀释的 iRBC稀释至 1:10，再稀释两次，每次从先前的稀释液中取出 100 μL ，并加入 900 μL的 1 × PBS（连续稀释）。
这将导致 1 mL在最后一步包含 1 × 10 5 iRBC (10 2 iRBC / μ L )。使用 100 μ L (1 × 10 4 iRBC ) 将这种稀释液注入每只小鼠。
笔记：
1. 计算 N+2 只小鼠的剂量以解决任何体积损失。从小鼠到小鼠的感染比体外培养到小鼠的感染建立得更快（参见 Pal 等人，2022）。
2. 剂量反应感染（范围从 10 2 – 10 7 iRBCs ）在邓氏双胞胎的鼠对鼠传播中进行了测试，并且在所有剂量下均实现了成功感染（ Pal 等人，2022 年）。与较高剂量相比，随后的较低剂量导致感染建立的延迟。但是，结果可能因处理而异。
任何表现出痛苦迹象的动物都应按照经批准的 IACUC 协议通过 CO 2窒息和颈椎脱位进行人道安乐死。

数据分析

对于体外研究（图 9），指定天数（第 0、3、6、9、12 和 15 天）的 P 百分比是通过计算从生长的培养物制备的每个血涂片中约 3,000 tRBC中的iRBC数量来确定的在不同的媒体中，如步骤 A4a 中所述。然后使用 GraphPad 棱镜绘制这些值。使用双向方差分析计算统计显着性（P 值）。
对于体内研究（图 10），如步骤 A4.a.vi 中所述，从指定时间点（DPI 1、3、4、6、7、8、9、 10 和 11）。为每只小鼠确定总共大约 2,000 个 tRBC 中的iRBC数量。每组至少使用三只小鼠。然后使用 GraphPad prism 9.4.1 软件绘制数据。 Kaplan-Meier 生存曲线是使用 GraphPad prism 9.4.1 生成的。

B. duncani的体外繁殖 WA1 在不同的生长培养基中。
B. ducani的持续体外生长 WA1 在不同培养基中在hRBC中培养 15 天。在第 3、6 和 9 天（用箭头表示）稀释培养物 (D)。 (B) 体外培养的邓肯氏杆菌吉姆萨染色涂片的代表性图像显示不同阶段的 WA1 寄生虫，包括环 (R)、双环 (DR)、丝状形式 (FF) 和四分体 (T)。 (C) 显示B. ducani不同发育阶段百分比的图表 DMEM/F-12 和Claycomb介质中的 WA1。提供的数据是在生物重复中进行的两个独立实验的平均值±标准差。在两种媒体的不同阶段之间没有发现显着差异（p > 0.99，双向方差分析）[根据 Singh 等人改编和修改。 (2022)]。

图 10. 免疫活性小鼠中的致死性B. duncani感染。
(A) 雌性 C3H/ HeJ小鼠 (n = 3/组) 在hRBCs体外培养中感染B. duncani寄生虫后随时间推移的寄生虫血症特征(紫色; 8.5 × 10 5 iRBC /mouse），或B. duncani寄生的小鼠 RBC ( mRBC ) 从受感染的小鼠（绿色；1 × 10 4 iRBC /鼠标）。未感染的小鼠轮廓以红色描绘。 E：安乐死。 (B) 未受感染小鼠（红色）、感染体外培养的邓氏双歧杆菌寄生虫（紫色）或感染邓氏双歧杆菌的小鼠在指定剂量下寄生小鼠血液（绿色）的 Kaplan - Meier图[改编和修改自 Pal 等人。（2022）]。

食谱

DMEM/F-12 完整介质（250 mL）
DMEM/F-12 188.5 毫升
胎牛血清 50 毫升
HT 培养基补充剂 (50 × ) 混合最大 5 mL
L-谷氨酰胺 2.5 mL
抗真菌剂 2.5 mL
庆大霉素 2.5 毫升
30% 异氟醚 (50 mL)
异氟醚 15 mL
聚乙二醇 400 35 毫升

致谢

资金： Pal 及其同事（ Pal 等人，2022 年）和 Singh 及其同事（ Singh 等人，2022 年）发表的协议得到了美国国立卫生研究院（AI123321、AI138139、AI152220 和 AI136118）的资助，史蒂文和亚历山德拉科恩基金会 (Lyme 62 2020)，以及 CBM 的全球莱姆联盟。

利益争夺

指定作者均无任何利益冲突、财务或其他方面的冲突。

伦理

所有动物实验均获得耶鲁大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准（协议 #2020-07689）。动物到达后在实验开始前适应环境一周。使用批准的方案对表现出痛苦迹象或看起来垂死的动物进行人为安乐死。
机构审查委员会声明：所有进行的动物研究均获得耶鲁大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准（协议 #2020-07689）。
机构生物安全声明：所有涉及在培养中使用人类血液和巴贝虫寄生虫的研究均已获得耶鲁大学机构生物安全委员会的批准。

参考

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